Diagnóstico-Molecular-de-Infeccções-Bacterianas

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Novas Estratégias no 
Diagnóstico Microbiológico
Prof. Dr. Rodrigo Cayô da Silva
Setor de Biologia Molecular, Microbiologia e Imunologia
Departamento de Ciências Biológicas - DCB
Instituto de Ciências Ambientais, Químicas e Farmacêuticas - ICAQF
Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP, Campus Diadema
II CONGRESSO MINEIRO DE EPIDEMIOLOGIA, 
PREVENÇÃO E CONTROLE DE INFECÇÕES
5° CONGRESSO MINEIRO DE INFECTOLOGIA
Belo Horizonte, 2019
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES
• Cultura
– Cultura tradicional em meios de cultura (bactérias 
cultiváveis)
• Testes imunológicos
– Látex
• Sorologia
– Bactérias não cultiváveis
• Proteômica
– Técnica de MALDI-TOF MS: identificação diretamente do 
espécime clínico
• Biologia Molecular
DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES
• Cultura
– Cultura tradicional em meios de cultura (bactérias 
cultiváveis)
• Testes imunológicos
– Látex
• Sorologia
– Bactérias não cultiváveis
• Proteômica
– Técnica de MALDI-TOF MS: identificação diretamente do 
espécime clínico
• Biologia Molecular
Aplicações da Biologia Molecular
❖Diagnóstico das Infecções
❖Identificação Bacteriana
❖Estudo dos mecanismos de resistência
❖Avaliação epidemiológica
❖Estudo do Microbioma
SENSIBILIDADE ESPECIFICIDADE RAPIDEZ
Biologia Molecular: Metodologias
• Técnicas para detecção de fragmentos de DNA ou 
RNA específicos
❖ Amplificação do DNA ou RNA alvo
• PCR convencional e PCR em tempo Real
❖ Amplificação do DNA ou RNA alvo + sondas 
marcadas
• Luminex
• Micro Array
• Sequenciamento genético
❖ Sequenciamento de parte do genoma ou genoma 
completo
• Estudo da clonalidade
❖ PFGE e Diversilab
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
(nucleotideos)DNA polimerase termoestável 
(Taq polimerase)
DNA molde
Oligonucleotídeos
iniciadores 
(primers – foward e reverse)
Tampão
Mg2+
Replicação do DNA
❖ Processo de duplicação semiconservativo
❖ Cada molécula DNA serve como molde 
❖ Síntese nova molécula mediada por DNA polimerase 
❖ Regra de pareamento de bases
Taq polimerase
Primers 
Tampão
Água
94ºC
DENATURAÇÃO
72ºC
EXTENSÃO
50-55ºC
ANELAMENTO
ETAPAS DA PCR
1. Adição de reagentes
2. Alternância de temperaturas
(Termociclador)
30-40 CICLOS
DNA
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
(nucleotídeos)
http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/equipamentos-de-diagnostico/products/molecular-diag/intro-pcr/
http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/equipamentos-de-diagnostico/products/molecular-diag/intro-pcr/
PCR convencional
✓ DNA molde
✓ dNTPs
✓ MgCl2
✓Taq DNA Polimerase
✓ Primers
TERMOCICLADOR
Evolução - Revolução
DIAGNÓSTICO MOLECULAR POR PCR EM TEMPO REAL:
❖ Amplificação e detecção ocorrem na mesma etapa
❖ Sistema de fluorescência indica resultados positivos
❖ Detecta um ou mais alvos (multiplex)
❖ Mais rápido que o convencional
❖ Reduz chances de contaminação, tubo fechado
❖ Análise qualitativa e quantitativa
❖ Sensível e específico
Sondas
• Probe de Hidrólise (TaqMan)
• Hairpin (molecular beacon probe)
• Probes adjacentes
• Scorpion primers
Intercalantes Fluorescentes
• SYBR Green 1
• SYTO9 
• EvaGreen
PCR em Tempo Real
Quasar 670Fam Cal Fluor Orange TAMRA ROX
Sistema Taq Man
Aumento da intensidade de fluorescencia
Sistema Taq Man
PCR em Tempo Real
Plateau
Fase Exponencial
Baseline
Threshold
A molécula emite maior intensidade de fluorescência quando ligado à dsDNA; 
portanto aumentando a emissão de acordo com a formação dos produtos de PCR.
SYBR GREEN
Instrumentos: PCR em Tempo Real
• As reações da PCR ficam em
rotação contínua durante a corrida
(400 RPM).
• Força G mantém os reagentes na
base do tubo (remove bolhas e 
condensação).
• Detecção uniforme da florescencia 
(Normalizador de fluorescência).
• Não necessita de calibração optica
• Cinco canais de fluorescência + 
HRM
• Simples manuseio do equipamento 
e do software
Amostras em rotação contínua durante a corrida
• 400 RPM
Aquisição de dados em alta velocidade
• todas as amostras lidas em uma rotação (0.15 sec)
Força G mantém os reagentes na base do tubo
• remove bolhas e condensação
• não forma pellet
Movimentação contínua: sem variação
• uniformidade térmica e óptica
400 RPM
Ventilação movimenta o ar 
na câmara
Câmara selada para reter 
o ar
Mecanismo de Aquecimento
Note: orifícios no 
rotor permitem a 
circulação do ar
Resistência ligada
Ar frio
Ventilação direciona o ar 
para dentro da câmara
Ventilação em volta da 
câmara
Abertura de ventilação se abre 
para saída do ar quente 
Mecanismo de Resfriamento
Resistência 
desligada
Note: orifícios 
permitema 
circulação do ar
Câmara de reação
PMT Detector
LEDs
Lens
Filtros de 
detecção
Spindle/Motor 
Assembly
Mecanismo de DetecçãoDetecção
QIAGEN Rotor-Gene Q 
(Corbett Rotor-Gene 6000)
❖ Reação feita em tubos
❖ Econômica
❖ Simples manuseio do 
equipamento e 
software
❖ Bom para laboratórios 
com quantidade e 
variedade
Alvos: Genes de 
Resistência
Cepheid: Smartcycler
❖ Reação feita em tubos especiais
❖ Cada espaço funciona 
independentemente como 
diferentes equipamentos
❖ Bom para laboratórios com 
variedade de exames
❖ Reduz contaminação
Prep Amostra +
Extração DNA
2 horas
Prep PCR
0.5 hours
PCR
1.5 hours
Tempo Total
4 horas
Extração Prep PCR Amplificação
“Teste Tradicional”
Prep teste
2 min
PCR 
30-60 min
Tempo Total
≈1 hour
Realizado na mesma área/sala
Teste “Amostra – Resultados”
1. Extração e Purificação de Ácidos Nucleicos
2. Amplificação
3. Detecção e Análise
3 INSTRUMENTOS
ou ou ou
Evolução - Revolução
GeneXpert
GX-1
GX-16
GeneXpert 
Infinity-48
GeneXpert®
Module
GX-2 GX-4
Fácil
Manuseio
Rápidas
Respostas
Acurácia
Resultados
Melhor Aproveitamento dos Benefícios da 
Biologia Molecular
Cartucho
❖ Diagnóstico
• Doenças Infecciosas
• Oncologia
• Genética
❖ Testes feitos no mesmo cartucho
• Extração
• Amplificação
• Detecção
❖ Mesma base de cartucho para todos os 
testes realizados no Sistema GeneXpert®
Vortex + dispensar a amostra no 
cartucho
2
Inserir o cartucho no aparelho e 
começar a corrida
3
Inserir o swab no reagente de 
eluição
1
Trabalho Manual Total <1 Minuto
GeneXpert
Valor Clínico: Tempo de liberação dos resultados 
é crucial
TIME TO RESULT
Cepheid vs. PCR e Cultura
Cepheid
PCR
PCR
Cultura
V
A
LO
R
 C
LÍ
N
IC
O
0 12 hrs 1 dia 2 dias
Articles that look at time to result as crucial to maximizing diagnostic value:
1. Lance R. Peterson, M.D., Donna M. Hacek, M.T. (A.S.C.P.), Ari Robicsek, M.D., Case Study: An MRSA Intervention at 
Evanston Northwestern Healthcare, printed in The Joint Commission Journal on Quality and Patient Safety Volume 33 
Number 12, December 2007
2. Lance R. Peterson, M.D., Rapid Diagnosis of Community-Acquired MRSA, printed in Clinical Updates in Infectious 
Diseases, Volume Issue 3, October 2008
3. Eli N. Perencevich, MD, MS et al., SHEA Guideline: Raising Standards While Watching the Bottom Line: Making a 
Business Case for Infection Control, Infection Control and Hospital Epidemiology, Volume 28, Number 10, October 
2007
Saúde da 
Mulher
GBS
Infecções 
Relacionadas a 
Assistência a Saúde
Doenças 
Infecciosas 
Críticas
Teste CLIA-
Waived 
(Point of Care)
Oncologia & 
Genética
MRSA/SA 
BC
SA Nasal 
Complete
vanA
for VRE
MRSA/SA 
SSTI
MRSA C. difficile
Flu HemosIL
FII & FV
Virologia
• 11 Testes Disponíveis nos EUA
• 12 Testes Disponíveis Fora dos EUA
– Incluíndo MDR-Tuberculosis e BCR-ABL
EV
C. diff/Epi
MTB/RIF
CE-IVD
BCR-ABL
Monitor
CE-IVD
GeneXpert
EV Flu
MTB/RIF
Infecções 
Relacionadas a 
Assistência a Saúde
Doenças 
Infecciosas 
Críticas
Teste CLIA-
Waived 
(Point of Care)
Oncologia & 
Genética
Virologia
Microbial ID
Candidemia
HIV
Quant HCV Quant
MRSA/SA 
BC
SA Nasal 
Complete
vanA
for VRE
MRSA/SA 
SSTI
MRSA C. difficile
C. diff/Epi Norovirus
Gastro B 
Panel
BCR/ABL
Monitor
V2
HemosIL
FII & FV
BCR/ABL
Monitor V1
Breast CA 
RX Strat
BreastCancer 
Metastasis
Risk
SA
CT/NG
Flu A/B 
Panel
MRSA/SA 
SSTI EBV Quant
BKV
HBV Quant
HCV 
Genotype
Group A 
Strep
Vaginitis
Group A
Strep
MDRO
VAP 
MRSA/SA
VAP Gram 
Negative
RSV
CMV Quant
VZV
CE-IVD
CE-IVD CE-IVD
CE-IVD CE-IVDCE-IVD
Vaginitis/Vag
inosis
CE-IVD
CE-IVD
46 Testes Disponíveis
Bladder 
Cancer 
Monitor
CE-IVD
Bladder
Sympt
GBS CT/NG
HPV
CE-IVD
CT
VaginitisVaginosis
CE-IVD
HSV Typing
Lesion
Saúde da 
Mulher
CE-IVD
GeneXpert
Xpert® MRSA NxG
Xpert® SA Nasal Complete 
Xpert® MRSA/SA BC
Xpert® MRSA/SA SSTI
Xpert® C. difficile
Xpert® C. difficile/Epi
Xpert® vanA
Xpert® Carba-R
Xpert® Norovirus
Xpert® Xpress Strep A 
Xpert® Xpress Flu
Xpert® Xpress Flu/RSV
Xpert® MTB/RIF
Xpert® EV
Xpert® Ebola†
Xpert® CT/NG
Xpert® TV
Xpert® GBS
Xpert® GBS LB
Xpert® MRSA NxG
methicillin-resistant Staphylococcus 
aureus (MRSA)
Active MRSA surveillance testing in 45 minutes
Xpert® SA Nasal Complete 
methicillin-resistant Staphylococcus
aureus (MRSA)
e Pre-surgical testing for S. aureus and MRSA in about an hour
Xpert® MRSA/SA BC
methicillin-resistant Staphylococcus
aureus (MRSA)
Detection of MRSA and S. aureus in positive blood cultures in
about an hour
Xpert® MRSA/SA SSTI
methicillin-resistant Staphylococcus 
aureus (MRSA)
Detection of MRSA & S. aureus skin and soft tissue infections in
about an hour 
Xpert® C. difficile Clostridium difficile Detection of Clostridium difficile in just over 30 minutes*
Xpert® C. difficile/Epi Clostridium difficile
Detection and differentiation of Clostridium difficile & the
epidemic 027 strain in 45 minutes
Xpert® vanA
Vancomycin-resistant Enterococcus 
spp.
On-demand testing to assist with VRE surveillance in just over
30 minutes* 
Xpert® Carba-R Gram-negative bacilli
Detection of the carbapenem-resistance genes encoding KPC,
NDM, VIM, OXA-48 and IMP in 48 minutes from isolates, rectal
swabs, or perirectal swabs
Xpert® Norovirus Noravirus
Rapid identification and differentiation of Norovirus GI and GII
in less than one hour* 
Xpert® Xpress Strep A 
Rapid detection of Group A Streptococcus DNA in as soon as 
18 minutes
Group A Streptococcus
Xpert® Xpress Flu Rapid detection of Flu A and Flu B in as soon as 20 minutes
Influenza A 
Influenza B
Xpert® Xpress Flu/RSV
Rapid detection and differentiation of Flu A, Flu B, and RSV in
as soon as 20 minutes
Influenza A 
Influenza B
Xpert® MTB/RIF Mycobacterium tuberculosis
Detection of MTB and rifampin resistance mutations in
less than two hours
Xpert® EV Fast molecular diagnostic testing for enterovirus in 2.5 hours 1 Enterovirus
Xpert® Ebola† Detection of Ebola Zaire virus in 98 minutes Ebola Zaire Virus
Xpert® CT/NG
Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria
gonorrhoeae infections in 90 minutes
Chlamydia trachomatis 
Neisseria gonorrhoeae
Xpert® TV
Detection of Trichomonas vaginalis in male and female
specimens in as soon as 40 minutes* 
Trichomonas 
vaginalis
Xpert® GBS
Intrapartum screening for Group B streptococcus during 
labor/delivery in 35 minutes* 
Group B Streptococcus 
Xpert® GBS LB
Antepartum screening from LIM broth for Group B
streptococcus in 35 minutes*
Group B Streptococcus
• Cartucho detecta 5 famílias de genes que conferem 
resistência aos carbapenêmicos
‒ blaKPC
‒ blaNDM
‒ blaVIM
‒ blaOXA-48
‒ blaIMP-1 subgroup
• Amostra: Swab Retal
• TAT: 48 minutos
ALL KPCs ALL VIMS All NDMS OXA-48
OXA-162
OXA-163
OXA-204
IMP 1 IMP 6
IMP 25IMP 3
IMP 10 IMP 30
IMP-1 
subgroup
BD MAX™:
Amostra Resultados
• Único Sistema “amostra – resultado” ABERTO
• Profissional pode padronizar e definir os protocolos (Standardize 
User-Defined Protocol: UDPs)
• Consegue extrair DNA e RNA na mesma corrida
• Multiplex com detecção de 5 cores diferentes
• Laboratório pode padronizar a análise de resultados:
– Amplificação de curvas em tempo real
– Interpretação da curva de PCR
– Análise por curva de dissociação (melting curve)
– Resultados quantitativos
BD MAX™:
Única etapa manual: pipetar a amostra
BD MAX™:
BD MAX™:
Reagentes: Sistema Aberto
Reagentes de Extração e PCR
Extração
BD MAX™:
Modo aberto
Preparação da Amostra
BD MAX™:
*
BD MAX™:
“Layout”
BD MAX™:
Cartucho onde o PCR acontece
Colocar reagentes, 
amostras e cartão do 
PCR no BD MAXTM
Criar a lista de trabalho 
com identificação do 
teste e amostras
Fechar a porta do 
aparelho para 
começar a corrida
BD MAX™:
Tecnologia Microarray:
• Permite identificar, em uma mesma matriz, 
milhares de alvos diferentes
• Vários painéis multiplex vem sendo 
desenvolvidos usando esta metodologia
K.pneumoniae de 
infecção de ferida
E.coli de fezes
NDM-1
CTX-M1
SHV-12
CMY-4
Exemplo de Resultados:
Verigene
(Nanosphere)
Gram-
positivos
Gram-
negativos
Leveduras
FilmArray® Respiratory Panel 20 patógenos respirtatórios
Bordetella pertussis
Chlamydophila pneumoniae
Mycoplasma pneumoniae
Adenovirus
Coronavirus 229E
Coronavirus HKU1
Coronavirus OC43
Coronavirus NL63
Human Metapneumovirus
Human Rhinovirus/Enterovirus
Influenza A Influenza 
A/H1
Influenza A/H1-2009
Influenza A/H3
Influenza B
Parainfluenza 1
Parainfluenza 2
Parainfluenza 3
Parainfluenza 4
RSV
FilmArray® BCID Panel
24 patógenos (sangue) e 03 genes de 
resistência
Enterococcus
Listeria monocytogenes
Staphylococcus
Staphylococcus aureus
Streptococcus
Streptococcus agalactiae
Streptococcus pyogenes
Streptococcus pneumoniae Acinetobacter 
baumannii Haemophilus influenzae
Neisseria meningitidis
Pseudomonas aeruginosa
Enterobacteriaceae
Enterobacter cloacae complex
Escherichia coli
Klebsiella oxytoca
Klebsiella pneumoniae
Proteus
Serratia marcescens
Candida albicans
Candida glabrata
Candida krusei
Candida parapsilosis
Candida tropicalis
mecA - methicillin resistance
vanA/B - vancomycin resistance
KPC - carbapenem resistance
FilmArray®
Meningitis/Encephalitis (ME) 
Panel
14 patógenos (líquior)
Escherichia coli K1
Haemophilus influenzae
Listeria monocytogenes
Neisseria meningitidis
Streptococcus agalactiae
Streptococcus pneumoniae
Cytomegalovirus (CMV)
Enterovirus
Herpes simplex virus 1 (HSV-1)
Herpes simplex virus 2 (HSV-2)
Human herpes virus 6 (HHV-6)
Human parechovirus
Varicella zoster virus (VZV)
Cryptococcus 
neoformans/gattii
FilmArray® GI Panel 22 patógenos (fezes)
Campylobacter (jejuni, coli & upsaliensis)
Clostridium difficile (Toxin A/B)
Plesiomonas shigelloides
Salmonella
Yersinia enterocolitica
Vibrio (parahaemolyticus, vulnificus, & cholerae)
Vibrio cholerae E. coli O157
Enteroaggregative E. coli (EAEC)
Enteropathogenic E. coli (EPEC)
Enterotoxigenic E. coli (ETEC) lt/st
Shiga-like toxin-producing E. coli (STEC) stx1/stx2 E. coli O157
Shigella/Enteroinvasive E. coli (EIEC)
Adenovirus F 40/41
Astrovirus
Norovirus GI/GII
Rotavirus A
Sapovirus (I,II, IV, and V)
Cryptosporidium
Cyclospora cayetanensis
Entamoeba histolytica
Giardia lamblia
BD MAX™:
Gentilmente cedido por Suzane Silbert
BD Max 
Braço robótico 4 ponteiras
Gavetas cartuchos – dois 
termocicladores 
independentes
Duas racks – 12 testes cada
Tubos secundários de amostra
Cartucho microfluídico
BD Max
Cartuchos microfluídicos 
24 câmaras
individualmente
controladas para
reação de PCR
Orifícios onde as amostras são carregadas
Código de 
barras 2D com 
número de lote
✓Características específicas
Gentilmente cedido por Suzane Silbert
Gentilmente cedido por Suzane Silbert
BD MAX TM
Cartuchos microfluídicos 
24 câmaras
individualmente
controladas para
reação de PCR
Orifícios onde as amostras são carregadas
Código de barras
2D com número
de lote
Braço robótico 4 ponteiras
Gavetas cartuchos – dois 
termocicladores independentesDuas racks – 12 testes cada
Tubos secundários de amostra
Cartucho 
microfluídico
Única Etapa Manual: pipetar a amostra
Gentilmente cedido por Suzane Silbert
Gentilmente cedido por Suzane Silbert
Gentilmente cedido por Suzane Silbert
1) Protocolo de Meningite bacteriana do CDC:
Material que será extraído DNA: liquor
Extração de DNA
Master Mix
442819 ExKTM DNA-2 Swab seco e Líquido cefalorraquidiano (CSF) 
DNA MMK 
(sem SPC)
442848 
Primers
Probes
1) Protocolo de Meningite bacteriana do CDC:
Material que será extraído DNA: liquor
Extração de DNA
Master Mix
442819 ExKTM DNA-2 Swab seco e Líquido cefalorraquidiano (CSF) 
Master Mix 
Primers e Probes Próprios
Colocar as amostras no tubo de
processamento que contém o tampão
Carregar os reagentes na 
rack do BDMAX 
Colocar os tubos de processamento 
contendo as amostras na rack
Identificar as amostrasFechar a porta e iniciar a corrida
Colocar a rack carregada com as 
amostras e o cartucho no BDMAX
Resultados
PCR direto de amostra 
de sangue total!!!!!
SEPTIFAST
- Técnica de PCR em tempo Real
- Detecção e identificação de bactérias e fungos através de 
alvos específicos
- Detecção de mecanismos de resistência
- Direto do sangue ou de amostras clínicas
http://www.roche.com/prod_diag_septifast.pdf
1.5 mL
SeptiFast
LightCycler® System
PCR EM 
TEMPO 
REAL