Produção e fertilização in vitro de embriões

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Produção e
fertilização in vitro de embriões
Introdução
A produção in vitro (PIV) de embriões é
uma importante biotécnica reprodutiva
que permite a interação entre o
espermatozoide e o oócito fora do trato
reprodutivo da fêmea, com a formação
de um novo indivíduo.
• Produção de animais geneticamente
superiores.
• Pesquisa fundamental.
• Desenvolvimento de outras
biotécnicas como clonagem por
transferência nuclear, transgênese e
outras.
• Tratamento da infertilidade adquirida
• Melhoramento genético
• Maior número de embriões obtidos
• Redução do intervalo entre gerações
• Produtos viáveis de animais jovens,
com problemas reprodutivos
adquiridos, gestantes, mortos.
• Alto custo
Cuidados da obtenção
Obtenção de oocitos
Uso
• Os oocitos são coletados por uma 
agulha que penetra o antro
• Ovários de abatedouro
• Laparoscopia
• Ovum pick-up (OPU)
• Temperatura
- Despolimerização da tubulina
abaixo de 36 ºC
• Tempo
• Esterilidade do material obtido
Vantagens
Desvantagens
Métodos de obtenção de oócitos
Produção e
fertilização in vitro de embriões
Introdução
A produção in vitro (PIV) de embriões é
uma importante biotécnica reprodutiva
que permite a interação entre o
espermatozoide e o oócito fora do trato
reprodutivo da fêmea, com a formação
de um novo indivíduo.
• Produção de animais geneticamente
superiores.
• Pesquisa fundamental.
• Desenvolvimento de outras
biotécnicas como clonagem por
transferência nuclear, transgênese e
outras.
• Tratamento da infertilidade adquirida
• Melhoramento genético
• Maior número de embriões obtidos
• Redução do intervalo entre gerações
• Produtos viáveis de animais jovens,
com problemas reprodutivos
adquiridos, gestantes, mortos.
• Alto custo
Cuidados da obtenção
Obtenção de oocitos
Uso
• Os oocitos são coletados por uma 
agulha que penetra o antro
• Ovários de abatedouro
• Laparoscopia
• Ovum pick-up (OPU)
• Temperatura
- Despolimerização da tubulina
abaixo de 36 ºC
• Tempo
• Esterilidade do material obtido
Vantagens
Desvantagens
Métodos de obtenção de oócitos
Produção e
fertilização in vitro de embriões
Ovários de abatedouro
A produção in vitro (PIV) de embriões é
uma importante biotécnica reprodutiva
que permite a interação entre o
espermatozoide e o oócito fora do trato
reprodutivo da fêmea, com a formação
de um novo indivíduo.
• Produção de animais geneticamente
superiores.
• Pesquisa fundamental.
• Desenvolvimento de outras
biotécnicas como clonagem por
transferência nuclear, transgênese e
outras.
• Tratamento da infertilidade adquirida
• Melhoramento genético
• Maior número de embriões obtidos
• Redução do intervalo entre gerações
• Produtos viáveis de animais jovens,
com problemas reprodutivos
adquiridos, gestantes, mortos.
• Alto custo
Cuidados da obtenção
Obtenção de oocitos
Uso
• Os oocitos são coletados por uma 
agulha que penetra o antro
• Ovários de abatedouro
• Laparoscopia
• Ovum pick-up (OPU)
• Temperatura
- Despolimerização da tubulina abaixo 
de 36 ºC
• Tempo
• Esterilidade do material obtido
• Facilidade
• Quantidade de material
• Qualidade do material
• Utilizado com ou sem superovulação
Vantagens
Desvantagens
Métodos de obtenção de oócitos
Ovários de abatedouro
Produção e
fertilização in vitro de embriões
• Cuidados:
- Temperatura
- Lavagem dos ovários
- Meio estéril
- Tempo
• Vantagens
- Utiliza animais vivos
- Permite colheitas sucessivas
- Comum em animais silvestres
- Melhor aproveitada com super-
ovulação
• Desvantagens
- Procedimento cirúrgico
- Equipamento adequado
- Mão de obra especializada
• Usado em grandes animais
Classificação dos oocitos
As células do cumulus são as
responsáveis pela nutrição do oocito -
quanto mais camadas, mas viável ele é
Laparoscopia
• Animais vivos
• Colheitas sucessivas
• Procedimento pouco invasivo
• Pode ser utilizado com ou sem
superovulação
• Equipamento especial (deve haver
uma probe)
• Mão de obra treinada para obter
resultados satisfatórios
• Resultados variáveis
• Grau I – Presença de camadas
compactas do cumulus e oócitos com
• citoplasma compacto
• Grau II – presença de 5 ou mais
camadas de células do cumulus com
• citoplasma homogêneo ou com
alguma heterogeneidade
• Grau III – menos de três camadas de
células, ou citoplasma heterogêneo
• Grau IV - cumulus parcialmente, ou
totalmente removido, ou expandido
Ovum pick-up
• Maturação nuclear
• Reativação meiótica pelo pico de
LH
• MAPK (ativação com a ruptura da
VG e alta atividade MII)
• Ativação MPF
• Manutenção em MII por Mos
quinase
• Maturação citoplasmática
• Modulação da tradução
• Modificação de número, tamanho
e/ou posição de organelas
• Aumento do número de grânulos
corticais
• Produção de matriz mucosa
• Nutrição do oócito
• Coordenação da maturação
Produção e
fertilização in vitro de embriões
Maturação nuclear oocitária
Foto Estágios nucleares
Tempo 
(h)
A Germinal vesicle (GV) 0-6.6
Germinal vesicle
Breakdown (GVBD)
6.6-8.0
B Condensed 8.0-10.3
C Metaphase I (M I) 10.3-15.4
D Anaphase I (A I) 15.4-16.6
E Telophase I (T I) 16.6-18.0
F Metaphase II (MII) and
Polar body (Pb)
18.0-24.0
Maturação oocitária in vivo
Funções do cumulusoophorus
• Placas com gotas de meio de cultivo
cobertas de óleo equilibradas a 39ºC,
5% CO2 por no mínimo 2 horas
• Meio de cultivo TCM 199 modificado
- adição de LH
- adição de FSH
- adição de estradiol
- adição de BFS
• Lavar os CCOs nas duas primeiras
gotas e locá-lo no centro das seguintes
• 1CCO/10µl
Produção e
fertilização in vitro de embriões
Capacitação espermática
• Transferência dos oócitos para placas
de maturação ( 1CCO/10µl)
• Incubação a 39ºC, 5% CO2 por
24horas
MIV
• Modificações bioquímicas ( retirada do
colesterol da membrana plasmática).
• Espermatozoide em contato com o
plasma seminal sofre incorporação de
fatores descapacitantes (caltrin,
espermina, etc..)
• No trato genital feminino há remoção
desses fatores, que resultam em
desestabilização da membrana e
hiperativação espermática, resultando na
reação do acrossomo.
• Aumento da motilidade espermática,
com batimentos vigorosos da cauda.
• In vivo ocorre no oviduto, para que o
espermatozóide se destaque das cristas
do epitélio e penetre nos envoltórios do
oócito.
• É necessário Ca++ e proteína kinase
na cauda do espermatozóide.
• 1º etapa - penetração através do
cumulus e corona radiata, graças à
hialuronidase secretada pelo cumulus.
• 2º etapa - ligação e penetração na ZP,
reação do acrossoma, membrana da
cabeça do espermatozóide fusiona à
membrana do oócito. A acrosina ajuda no
processo
Hiperativaçãoespermática
Fecundação
• Segmentação progressiva do
acrossomo e fusão das membranas
plasmática e acrossomática, permitindo
a liberação de enzimas.
• Ocorre quando espermatozóide se
liga à zona pelúcida. Quando o
espermatozóide se capacita e perde os
fatores decapacitantes, há a liberação
de receptores para a ZP3.
• Todo o espermatozóide é
incorporado no citoplasma do oócito.
• Bloqueio primário: rápida
despolarização da membrana do oócito.
• Bloqueio secundário: grânulos
corticais se fundem com a membrana
vitelina e descarregam seu conteúdo
no espaço peri-vitelino.
• Após a penetração ocorre a 2a.
Divisão meiótica, saída do 2o.
Corpúsculo polar, formação dos
pronúcleos masculino e feminino e
singamia
Produção e
fertilização in vitro de embriões
Protocolo FIVReação acrossômica
• Preparação do espermatozóide:
separação dos espermatozóides vivos
dos
demais componentes do sêmen ( swim-
up e Percoll)
• Capacitação in vitro: Heparina- 10µg/ml.
• Fecundação in vitro: incubação dos
oócitos em meio FERT-Talp com
espermatozóides em concentração de
2 milhões por ml, em estufa de 5% de
CO2 a 39ºC.
• Meios quimicamente definidos- 5% de
O2 e meios SOM, TCM199, SOF, etc...
• Após 24hs retirar células do cumulus.
• Após 48hs avaliar a clivagem.
• Após 7 a 9 dias avaliar mórulas e
blastocistos
Cultivo embrionário