Estudo dirigido

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Disciplina: Biologia Molécular
Turma: 4 º período de Farmácia
1. Como se dá técnica de PRC (Reação da cadeia em polimerase)? Descreva detalhadamente?
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica rotineira de laboratório usada para fazer muitas cópias (milhões ou bilhões) de uma região específica do DNA. Essa região do DNA pode ser qualquer objeto de interesse do pesquisador. Por exemplo, pode haver um gene cuja função o pesquisador queira compreender ou um marcador genético usado pelos cientistas forenses para correlacionar o DNA da cena do crime com os suspeitos. 
Tipicamente, o objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente da região de interesse do DNA, de modo que essa possa ser analisada e utilizada de alguma outra maneira. Por exemplo, DNA amplificado por PCR pode ser enviado para sequenciamento, visualizado por eletroforese em gel, ou clonado em plasmídeo para futuros experimentos. A PCR é usada em muitas áreas da biologia e medicina, incluindo pesquisa em biologia molecular, diagnósticos médicos e mesmo alguns ramos da ecologia.
Taq polimerase
Assim como a replicação de DNA em um organismo, a PCR requer uma enzima DNA polimerase que faça novas fitas de DNA usando as existentes como moldes. A DNA polimerase tipicamente usada na PCR é chamada de Taq polimerase, em homenagem à bactéria resistente ao calor da qual ela foi isolada (Thermus aquaticus).
T. aquaticus vive em fontes termais e de água quente. Sua DNA polimerase é bastante estável ao calor e é mais ativa à 70°C70°C70, °, start text, C, end text (temperatura em que as DNA polimerases humanas ou de E. coli seriam disfuncionais). Essa estabilidade ao calor torna a Taq polimerase ideal para PCRs. Como veremos, a alta temperatura é usada repetidamente na PCR para desnaturar o DNA molde, isto é, separar suas fitas.
Primers de PCR
Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase consegue fabricar DNA somente quando lhe é dado um primer, uma sequência curta de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a síntese de DNA. Em uma reação de PCR, o pesquisador determina a região do DNA que será copiada, ou amplificada, pelos primers que ela ou ele escolher.
Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA de fita simples, geralmente por volta de 202020 nucleotídeos de comprimento. Dois primers são usados para cada reação de PCR, e eles são projetados de modo que englobem a região de interesse (região que deve ser copiada). Isto é, são dadas sequências que os farão se ligar a fitas opostas do DNA molde, bem nas extremidades da região a ser copiada. Os primers se ligam ao molde por pareamento de bases complementares.
Quando os primers são ligados ao molde, eles podem ser estendidos pela polimerase, e a região que está entre eles será copiada.
As etapas da PCR
Os principais ingredientes de uma reação PCR são a Taq polimerase, primers, DNA molde e nucleotídeos (blocos que compõem o DNA). Os ingredientes são reunidos em um tubo, juntamente com cofatores de que a enzima precisa, e passam por repetidos ciclos de aquecimento e resfriamento que permitem que o DNA seja sintetizado.
As etapas básicas são:
1. Desnaturação (96°C96°C96, °, start text, C, end text): Aquece fortemente a reação para separar, ou desnaturar, as fitas de DNA. Isso proporciona um molde de fita simples para a próxima etapa.
2. Anelamento (555555 \[\mbox{-}\] 656565°C°C°, start text, C, end text): Resfria a reação para que os primers possam se ligar às suas sequências complementares no DNA molde de fita simples.
3. Extensão (72°C72°C72, °, start text, C, end text): Eleva a temperatura da reação para que a Taq polimerase estenda os primers, sintetizando novas fitas de DNA.
Este ciclo se repete 25 – 35 vezes em uma reação típica de PCR, que geralmente ocorre em 2 – 4 horas, dependendo do comprimento da região de DNA a ser copiada. Se a reação for eficiente (funcionar bem), a região de interesse pode gerar de uma ou poucas cópias até bilhões.
Isso porque não é apenas o DNA original que é utilizado como molde a cada vez. Ao invés, o novo DNA feito em uma rodada pode servir de molde na próxima rodada de síntese de DNA. Há muitas cópias dos primers e muitas moléculas de Taq polimerase flutuando pela reação, então o número de moléculas de DNA pode aproximadamente dobrar a cada rodada do ciclo. Esse padrão de crescimento exponencial é mostrado na imagem abaixo.
Uso da eletroforese em gel para visualizar os resultados da PCR
Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados (tornam-se visíveis) através do uso da eletroforese em gel. Eletroforese em gel é uma técnica na qual fragmentos de DNA são puxados por uma corrente elétrica através de uma matriz de gel, e que separa os fragmentos de DNA de acordo com o tamanho. Um padrão, ou escada de DNA, é tipicamente incluído para que o tamanho dos fragmentos nas amostras da PCR possa ser determinado.
Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma "banda" no gel, que pode ser vista a olho nu se o gel for pigmentado com um corante que se liga ao DNA. Por exemplo, uma reação de PCR produzindo um fragmento de 400400400 pares de bases (pb) apareceria desta maneira no gel:
Coluna esquerda: Escada de DNA com bandas de 100, 200, 300, 400, 500 pb.
Coluna direita: resultado da reação PCR, uma banda em 400pb.
Uma banda de DNA contém muitas e muitas cópias da região de interesse do DNA, não apenas uma ou algumas cópias. Como o DNA é microscópico, muitas cópias têm de estar presentes antes que possamos vê-las a olho nu. Isso é uma grande parte do porquê de a PCR ser uma ferramenta importante: ela produz cópias suficientes de uma sequência de DNA de modo que possamos ver ou manipular aquela região de DNA.
Aplicações da PCR
Através da PCR, uma sequência de DNA pode ser amplificada milhões ou bilhões de vezes, produzindo cópias suficientes de DNA para serem analisadas por outras técnicas. Por exemplo, o DNA pode ser visualizado por eletroforese em gel, enviado para sequenciamento, ou digerido por enzimas de restrição e clonado em um plasmídeo.
A PCR é usada em muitos laboratórios de pesquisa e também tem aplicações práticas em ciências forenses, testes genéticos e diagnósticos. Por exemplo, a PCR é utilizada para amplificar genes associados a desordens genéticas a partir do DNA de pacientes (ou do DNA fetal, nos casos de teste pré-natal). A PCR também pode ser utilizada para testar se há DNA bacteriano ou viral no corpo de um paciente: se o patógeno estiver presente, pode ser possível amplificar regiões de seu DNA a partir de uma amostra de sangue ou tecido.
2. Qual nome se dá a enzima descoberta pelo pesquisador Kay Mullis? Qual sua função?
Taq polimerase, a sua função é de sintetizar uma nova cadeia de DNA complementar á fita de DNA molde durante o processo de amplificação, ela realiza essa função em cada ciclo da PCR, conforme as etapas de desnaturação, anelamento e extensão são repetidas. 
3. Como se dá o processo de síntese proteica em detalhes? Exemplifique com detalhes o processo de transcrição e tradução gênica?
A síntese proteica é o processo pelo qual as informações contidas nos genes do DNA são convertidas em proteínas funcionais. Esse processo ocorre em duas etapas principais: a transcrição e a tradução. Vou descrever detalhadamente essas duas etapas, exemplificando com o processo de síntese de uma proteína a partir de um gene específico.
Transcrição Gênica:
A transcrição é o primeiro passo da síntese proteica e ocorre no núcleo da célula, onde o DNA está localizado. Durante a transcrição, a informação genética contida em um gene é copiada em uma molécula de RNA mensageiro (mRNA). Aqui estão os passos detalhados da transcrição:
Iniciação: A enzima RNA polimerase se liga ao promotor, que é uma região específica do gene onde a transcrição começa. A RNA polimerase separa as duas fitas de DNA, expondo as bases nitrogenadas.
Elongação: A RNA polimerase lê a sequência de DNA molde e sintetiza uma molécula de mRNA complementar. O mRNA é construído adicionando nucleotídeos que são complementares às bases nitrogenadas do DNA. Por exemplo,se o DNA tem uma adenina (A), o mRNA terá uma uracila (U) no local correspondente.
Terminação: A transcrição continua até que a RNA polimerase alcance uma sequência chamada terminador no DNA. Nesse ponto, a RNA polimerase e a molécula de mRNA são liberadas.
Tradução Gênica:
A tradução é o segundo passo da síntese proteica e ocorre no citoplasma da célula, onde os ribossomos estão localizados. Durante a tradução, a informação contida no mRNA é usada para montar uma cadeia de aminoácidos e formar uma proteína. Aqui estão os passos detalhados da tradução:
Iniciação: O mRNA recém-sintetizado é transportado para o citoplasma e se liga a um ribossomo. O ribossomo lê o códon de início AUG (que codifica o aminoácido metionina) e sinaliza o início da tradução. O tRNA (RNA transportador) com o anticódon complementar e o aminoácido metionina se liga ao códon de início.
Elongação: O ribossomo se move ao longo do mRNA, lendo os códons em sequência. O tRNA traz o aminoácido correspondente ao códon, e a ligação peptídica é formada entre os aminoácidos adjacentes, criando uma cadeia polipeptídica. Esse processo continua até que o ribossomo alcance um códon de parada (UAA, UAG ou UGA) no mRNA.
Terminação: Quando o ribossomo encontra um códon de parada, não há tRNA correspondente. Isso sinaliza o término da tradução. A proteína completa é liberada do ribossomo.
Portanto, a síntese proteica começa com a transcrição, onde a informação do gene é copiada para uma molécula de mRNA, e continua com a tradução, onde o mRNA é lido e usado como molde para a montagem de uma proteína específica. Esse processo é essencial para a vida das células e é responsável pela produção de todas as proteínas necessárias para as funções celulares.
4. Qual a importância da bioinformática na predição de genes de interesse?
A bioinformática desempenha um papel fundamental na predição e identificação de genes de interesse em genomas de organismos. A importância da bioinformática nesse contexto está relacionada a várias razões:
Análise de Grandes Conjuntos de Dados Genômicos: Os genomas de organismos, incluindo humanos, estão se tornando cada vez mais sequenciados e disponíveis publicamente. A bioinformática lida com a análise de grandes volumes de dados genômicos, permitindo a identificação de genes e outras regiões de interesse.
Anotação de Genes: A bioinformática é usada para anotar os genomas, ou seja, identificar as regiões que codificam proteínas (genes), bem como regiões não codificantes, como íntrons, promotores e outras características genômicas. Isso é essencial para entender a estrutura e a função dos genes.
Predição de Genes de Interesse: Através de algoritmos de predição, a bioinformática pode ajudar a identificar genes de interesse, como aqueles associados a doenças, características específicas de organismos ou vias metabólicas importantes. Isso é particularmente valioso na pesquisa biomédica e agrícola.
Estudo de Genes Reguladores: Além de identificar genes codificadores de proteínas, a bioinformática também ajuda na identificação de elementos reguladores, como promotores e regiões de ligação de fatores de transcrição, que controlam a expressão gênica. Isso é crucial para entender como os genes são controlados.
Comparação de Genomas: A bioinformática permite comparar genomas de diferentes espécies para identificar genes conservados (homólogos) e compreender as relações evolutivas entre organismos. Isso é útil para estudar a evolução dos genes e as funções conservadas ao longo do tempo.
Seleção de Alvos para Estudos Funcionais: A identificação de genes de interesse por meio de técnicas de bioinformática pode orientar pesquisadores na escolha dos genes a serem estudados experimentalmente, economizando tempo e recursos.
Desenvolvimento de Terapias e Biotecnologia: Na medicina e na biotecnologia, a bioinformática desempenha um papel importante na identificação de alvos terapêuticos, no projeto de drogas, no desenvolvimento de terapias genéticas e na engenharia genômica.
Agronomia e Melhoramento de Plantas: Na agricultura, a bioinformática é usada para identificar genes que conferem características desejáveis em plantas, como resistência a doenças, tolerância à seca e maior produtividade.
Diagnóstico e Medicina Personalizada: A bioinformática também é essencial na análise de dados genômicos para diagnóstico médico, previsão de predisposição a doenças e medicina personalizada, adaptando tratamentos com base no perfil genético individual.
Em resumo, a bioinformática desempenha um papel crucial na identificação e predição de genes de interesse, fornecendo ferramentas computacionais poderosas para analisar e interpretar dados genômicos complexos. Ela ajuda a acelerar a pesquisa científica, a descoberta de novos alvos terapêuticos e a compreensão das complexidades dos genomas.
5. Como se dá esse processo na prática. Exemplifique com um gene de interesse?