clsi_OPAS1M27-A2

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M27-A2 
Vol. 22 No. 15 
Substitui a Norma M27-A 
Vol. 17 No. 9
Método de Referência para Testes de Diluição em 
Caldo para Determinação da Sensibilidade de 
Leveduras à Terapia Antifúngica: Norma 
Aprovada – Segunda Edição 
 
Este documento apresenta a seleção e preparação de agentes antifúngicos; implementação e interpretação 
de testes e requisitos de controle de qualidade para testes de sensibilidade de leveduras que produzem 
infecções invasivas. 
Uma norma de aplicação global desenvolvida mediante processo consensual do NCCLS. 
 
 
 
 
 
 
Permission to translate the M27-A2 has been granted to ANVISA by CLSI (Formerly NCCLS). In the 
event of any variations in meaning that may be introduced through translation, the original NCCLS 
publication (in English) is authoritative. For each standard, the interpretive data are valid only if the 
methodology in the standard is followed. NCCLS frequently updates the interpretive tables through new 
editions and supplements. Users should refer to the most recent edition. 
In January 2005, NCCLS changed its name to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 
Copies of the complete current standards and informational supplement (in English) may be obtained 
from CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898, U.S.A.; telephone: 
+610.688.0100; fax: +610.688.-700; Internet: www.clsi.org. 
The permission granted by NCCLS/CLSI is limited to distribution of M27-A2 by ANVISA to clinical 
laboratories in Brazil. Permission to reproduce additional copies or otherwise use the text of these 
documents to an extent not permitted under Copyright Law must be obtained in writing from the Clinical 
and Laboratory Standards Institute. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Coordenação da Tradução 
Silvia Figueiredo Costa 
Doutora em Doenças Infecciosas e Parasitárias pela Faculdade de Medicina da Universidade de São 
Paulo. Organização Pan Americana de Saúde 
Revisores: 
Daniel A. da Matta 
Biólogo, Mestre em Ciências Básicas em Doenças Infecciosas e Parasitárias-UNIFESP 
Marcia S. C. Melhem 
Doutora em Saúde Pública pela USP, Laboratório de Micologia-Instituto Adolfo Lutz 
 
Direitos de Tradução e Reprodução 
Agência Nacional de Vigilância Sanitária 
Gerencia Geral de Tecnologia em Serviços de Saúde 
 
NCCLS... 
Servindo A Comunidade Mundial das Ciências Médicas Através de Consenso Voluntário 
 
O NCCLS é uma organização internacional interdisciplinar, sem 
fins lucrativos, educacional e de desenvolvimento de 
normas/padrões, que promovem o desenvolvimento e uso de 
normas/padrões e diretrizes consensuais voluntárias na 
comunidade de atenção à saúde. É reconhecido no mundo inteiro 
pela aplicação de seu singular processo consensual ao 
desenvolvimento de normas/padrões e diretrizes para testes de 
patologia clínica e questões relacionadas à atenção de saúde. O 
NCCLS baseia-se no princípio de que o consenso é uma maneira 
efetiva e custo-eficaz de melhorar os testes clínicos e serviços de 
atenção à saúde. 
 
Além de desenvolver e promover o uso voluntário de 
normas/padrões e diretrizes consensuais, fornecemos um foro 
aberto e isento para tratar questões que afetam a qualidade dos 
testes de patologia clínica e a atenção à saúde. 
 
PUBLICAÇÕES 
 
Os documentos do NCCLS são publicados como normas/padrões, 
diretrizes ou relatórios de comitê. 
 
Norma – Documento desenvolvido através do processo de 
consenso, o qual identifica claramente os requisitos específicos e 
essenciais dos materiais, dos métodos, ou das práticas a serem 
usados sem modificações. Uma norma também pode conter 
elementos discricionários, que são claramente identificados. 
 
Diretriz – Documento desenvolvido através do processo de 
consenso, o qual descreve critérios para práticas e procedimentos 
ou materiais operacionais gerais a serem usados de maneira 
voluntária. Uma diretriz pode ser usada conforme redigida, ou 
modificada pelo usuário para adequá-las às suas necessidades 
específicas. 
 
Relatório – Documento que não passou pela revisão consensual e 
foi publicado pela Diretoria. 
 
PROCESSO CONSENSUAL 
 
O processo consensual voluntário do NCCLS é um protocolo que 
estabelece critérios formais para: 
autorizar um projeto; 
desenvolver e revisar documentos de maneira transparente; 
revisar documentos em resposta a comentários de usuários; 
aceitar um documento como norma/padrão ou diretriz consensual. 
 
A maioria dos documentos do NCCLS são sujeitos a dois níveis de 
consenso—“proposto” e “aprovado”. Dependendo da necessidade 
de avaliação ou coleta de campo, os documentos também podem 
disponibilizados para revisão em nível consensual intermediário 
(i.e., “tentativo”). 
 
 
Proposta – Documento consensual do NCCLS que passa por um 
primeiro estágio de revisão pela comunidade de saúde como 
proposta de norma/padrão ou diretriz. O documento deve receber 
uma revisão técnica abrangente e minuciosa, incluindo a revisão 
geral de seu escopo, enfoque e utilidade e uma revisão detalhada 
de seu conteúdo técnico e editorial. 
 
Tentativa -Uma norma/padrão ou diretriz disponibilizada para 
revisão e comentários apenas quando há necessidade evidente de 
avaliação de campo de um método recomendado ou de coleta de 
dados específicos relativos a um protocolo recomendado. Deve ser 
revisada para assegurar sua utilidade. 
 
Aprovada – Norma/padrão ou diretriz que recebeu aprovação 
consensual da comunidade de atenção à saúde. Deve ser revisada 
para avaliação da utilidade do documento final, garantia de 
consenso (ex., que os comentários relativos a versões anteriores 
foram satisfatoriamente resolvidos) e identificação de necessidade 
de documentos consensuais adicionais. 
As normas/padrões e diretrizes do NCCLS representam uma 
opinião consensual sobre boas práticas e refletem um acordo 
substancial de partes interessadas, competentes e compromissadas 
materialmente, obtido por meio dos procedimentos consensuais 
estabelecidos pelo NCCLS. As exigências das normas/padrões e 
diretrizes do NCCLS podem ser mais ou menos rigorosas do que 
os respectivos regulamentos. Conseqüentemente, a adoção desse 
documento consensual voluntário não dispensa o usuário da 
responsabilidade de obedecer aos regulamentos pertinentes. 
 
COMENTÁRIOS 
 
Os comentários dos usuários são essenciais ao processo 
consensual. Qualquer pessoa pode apresentar um comentárioe 
todos os comentários são considerados pelo comitê do NCCLS que 
preparou o documento, em conformidade com o processo 
consensual. Todos os comentários, incluindo aqueles que 
resultaram em mudança no documento, quando publicado no 
próximo nível consensual, bem como aqueles que não resultaram 
em mudança, são respondidos pelo comitê em apêndice do 
documento. Incentiva-se os leitores a tecer comentários de 
qualquer formato e em qualquer oportunidade sobre qualquer 
documento do NCCLS. Envie seus comentários ao seguinte 
endereço: NCCLS Executive Offices, 940 West Valley Road, Suite 
1400, Wayne, PA 19087, Estados Unidos. 
 
PARTICIPAÇÃO VOLUNTÁRIA 
 
Os profissionais de saúde de todas as especialidades são instados a 
participar voluntariamente nos projetos do NCCLS. Para 
informações adicionais sobre participação nos comitês, favor 
contatar os Escritórios Executivos do NCCLS. 
 
 
 
Método de Referência para Testes de Diluição em Caldo para a 
Determinação da Sensibilidade de Leveduras à Terapia Antifúngica; 
Norma Aprovada—Segunda Edição 
 
Resumo 
 
A Norma M27-A2—Método de Referência para Testes de Diluição em Caldo para a Determinação da 
Sensibilidade de Leveduras;à Terapia Antifúngica Norma Aprovada—Segunda Edição do NCCLS 
descreve a metodologia de um teste de sensibilidade aos agentes antimicrobianos das leveduras que 
causam infecções fúngicas invasivas, incluindo as espécies de Candida (e Candida glabrata) e 
Cryptococcusneoformans. A norma trata da seleção e preparação dos agentes antifúngicos; da 
implementação e interpretação dos testes; e do propósito e da implementação dos testes de controle de 
qualidade. Apresenta também uma análise cuidadosa da responsabilidade dos fabricantes e usuários no 
controle de qualidade. 
 
NCCLS. Método de Referência para Testes de Diluição em Caldo para a Determinação da Sensibilidade 
a Terapia Antifúngica das Leveduras; Norma Aprovada—Segunda Edição. Norma M27-A2 do NCCLS 
(ISBN 1-56238-469-4). NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 
Estados Unidos, 2002. 
 
 
 
 
 
 
O processo consensual do NCCLS, mecanismo que permite a revisão de um documento, em 
dois ou mais níveis, pela comunidade de atenção à saúde, é um processo permanente. Os 
usuários devem prever edições revisadas de qualquer documento. Uma vez que as rápidas 
mudanças nas tecnologias possam efetuar os procedimentos, métodos e protocolos nas 
normas/padrões e diretrizes, os usuários devem substituir as edições ultrapassadas pelas 
edições atualizadas dos documentos do NCCLS. As edições atualizadas estão relacionadas 
no Catálogo do NCCLS, distribuído às organizações membros e, mediante solicitação, aos 
não-membros. Se sua organização não é membro do NCCLS e gostaria de ser, assim como 
para solicitar um exemplar do Catálogo do NCCLS, favor contatar os Escritórios Executivos 
do NCCLS. Telefone: 610.688.0100; Fax: + 1 610.688.0700; E-Mail: exoffice@nccls.org; 
Website: www.nccls.org 
 
 vi 
 
M27-A2 
ISBN 1-56238-469-4 
ISSN 0273-3099
Método de Referência para Testes de Diluição em Caldo para a 
Determinação da Sensibilidade de Leveduras à Terapia Antifúngica; 
Norma Aprovada—Segunda Edição 
 
 
 
 
Volume 22 Número 15 
 
Michael A. Pfaller, M.D., Presidente 
Vishnu Chaturvedi, Ph.D. 
Ana Espinel-Ingroff, Ph.D. 
Mahmoud A. Ghannoum, M.Sc., Ph.D. 
Linda L. Gosey, M.T.(ASCP) 
Frank C. Odds, Ph.D., FRC Path. 
John H. Rex, M.D. 
Michael G. Rinaldi, Ph.D. 
Daniel J. Sheehan, Ph.D. 
Thomas J. Walsh, M.D. 
David W. Warnock, Ph.D., FRC Path. 
 
 
 
An NCCLS global consensus standard. ©NCCLS. All rights reserved 1
Esta publicação é protegida por direitos autorais. Nenhuma parte pode ser reproduzida, armazenada em 
sistema de recuperação, transmitida ou disponibilizada em qualquer formato ou por qualquer meio 
(eletrônico, mecânico, fotocópia, gravação ou outros) sem consentimento prévio, por escrito, do NCCLS, 
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Pelo presente instrumento, o NCCLS concede autorização para reproduzir partes limitadas desta 
publicação, para uso em manuais de procedimentos laboratoriais, em local único; para empréstimo entre 
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documento original e inclua o seguinte aviso: 
 
Reproduzido mediante autorização, parte da publicação do NCCLS 
M27-A2--Método de Referência para Testes de Diluição em Caldo 
para a Determinação da Sensibilidade a Terapia Antifúngica das 
Leveduras; Norma Aprovada--Segunda Edição (ISBN 1-56238-469-4). 
Cópias da atual edição podem ser obtidas no seguinte endereço: 
NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 
19087-1898, Estados Unidos. 
 
Autorização para reproduzir ou usar o texto deste documento além das isenções aqui concedidas ou nos 
termos da Legislação de Direitos Intelectuais pode ser obtida do NCCLS mediante solicitação por 
escrito. As autorizações podem ser obtidas no seguinte endereço: Executive Director, NCCLS, 940 
West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898, Estados Unidos. 
 
Copyright® 2002. The National Committee for Clinical Laboratory Standards. 
 
 
Citação Sugerida 
 (NCCLS. Método de Referência para Testes de Diluição em Caldo para a Determinação da 
Sensibilidade a Terapia Antifúngica das Leveduras; Norma Aprovada—Segunda Edição. NCCLS 
document M27-A2 [ISBN 1-56238-469-4]. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, 
Pennsylvania 19087-1898 Estados Unidos, 2002.) 
 
Norma Proposta 
Dezembro de 1992 
 
Norma Tentativa 
Outubro de 1995 
 
Norma Aprovada 
Junho de 1997 
 
Norma Aprovada—Segunda Edição 
Agosto de 2002 
 
 
 
 
ISBN 1-56238-469-4 
ISSN 0273-3099 
Membros do Comitê 
 
Comitê da Área de Microbiologia 
 
An NCCLS global consensus standard. ©NCCLS. All rights reserved 2 
 
James H. Jorgensen, Ph.D. 
Presidente 
University of Texas Health Center 
San Antonio, Texas 
 
Mary Jane Ferraro, Ph.D., M.P.H. 
Vice Presidente 
Massachusetts General Hospital 
Boston, Massachusetts 
 
Subcomitê para Testes de Sensibilidade a Agentes Antifúngicos 
 
Michael A. Pfaller, M.D. 
Presidente 
University of Iowa College of Medicine 
Iowa City, Iowa 
 
Vishnu Chaturvedi, Ph.D. New York State Department of Health 
Albany, New York 
 
Ana Espinel-Ingroff, M.S., Ph.D. Medical College of Virginia/VCU 
Richmond, Virginia 
 
Mahmoud A. Ghannoum, M.Sc., Ph.D. Center for Medical Mycology, Case Western 
Reserve University, and 
University Hospitals of Cleveland 
Cleveland, Ohio 
 
Linda L. Gosey, M.T.(ASCP) Food and Drug Administration 
Rockville, Maryland 
 
Frank C. Odds, Ph.D., FRC Path. University of Aberdeen 
Escócia, Reino Unido 
 
John H. Rex, M.D. University of Texas Health Science Ctr. at Houston 
Houston, Texas 
 
Michael G. Rinaldi, Ph.D. University of Texas Health Science Center 
San Antonio, Texas 
 
Daniel J. Sheehan, Ph.D. Pfizer Inc. 
New York, New York 
 
Thomas J. Walsh, M.D. National Cancer Institute 
Bethesda, Maryland 
 
David W. Warnock, Ph.D., FRC Path. Centers for Disease Control and Prevention 
Atlanta, Georgia 
 
Consultores 
 
Arthur L. Barry, Ph.D. Clinical Microbiology Institute 
Wilsonville, Oregon 
 
 
Lois M. Schmidt, D.A. 
Oficial de Ligação 
NCCLS 
Wayne, Pennsylvania 
 
Tracy Ann Dooley, M.L.T.(ASCP) NCCLS 
 
An NCCLS global consensus standard. ©NCCLS. All rights reserved 3
Gerente do Projeto Wayne, Pennsylvania 
 
Patrice E. Polgar 
Editor 
NCCLS 
Wayne, Pennsylvania 
 
Donna M. Wilhelm 
Editor Assistente 
NCCLS 
Wayne, Pennsylvania 
 
 
 
 
 
An NCCLS global consensus standard. ©NCCLS. All rights reserved 4 
Membros Ativos 
(em 1o de julho de 2002) 
 
Membros Mantenedores 
 
Abbott Laboratories 
American Association for 
 Clinical Chemistry 
Beckman Coulter, Inc. 
BD and Company 
bioMérieux, Inc. 
CLMA 
College of American Pathologists 
GlaxoSmithKline 
Nippon Becton Dickinson Co., Ltd. 
Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. 
Pfizer Inc 
Roche Diagnostics, Inc. 
 
Membros Profissionais 
 
AISAR-Associazione Italiana per lo 
 Studio degli 
American Academy of Family 
 Physicians 
American Association for 
 Clinical Chemistry 
American Association for 
 Respiratory Care 
American Chemical Society 
American Medical Technologists 
American Public Health Association 
American Society for Clinical 
 Laboratory Science 
American Society of Hematology 
American Society for Microbiology 
American Type Culture 
 Collection, Inc. 
Asociación Española Primera de 
 Socorros (Uruguay) 
Asociacion Mexicana de 
 Bioquimica Clinica A.C. 
Assn. of Public Health Laboratories 
Assoc. Micro. Clinici Italiani- 
 A.M.C.L.I. 
British Society for Antimicrobial 
 Chemotherapy 
CADIME-Camara De Instituciones 
 De Diagnostico Medico 
Canadian Society for Medical 
 Laboratory Science—Société 
 Canadienne de Science de 
 Laboratoire Médical 
Clinical Laboratory Management 
 Association 
COLA 
College of American Pathologists 
 
College of Medical Laboratory 
 Technologists of OntarioCollege of Physicians and 
 Surgeons of Saskatchewan 
ESCMID 
Fundación Bioquímica Argentina 
International Association of Medical 
 Laboratory Technologists 
International Council for 
 Standardization in Haematology 
International Federation of 
 Clinical Chemistry 
Italian Society of Clinical 
 Biochemistry and Clinical 
 Molecular Biology 
Japan Society of Clinical Chemistry 
Japanese Committee for Clinical 
 Laboratory Standards 
Joint Commission on Accreditation 
 of Healthcare Organizations 
National Academy of Clinical 
 Biochemistry 
National Association of Testing 
 Authorities – Australia 
National Society for 
 Histotechnology, Inc. 
Ontario Medical Association 
 Quality Management Program- 
 Laboratory Service 
RCPA Quality Assurance Programs 
 PTY Limited 
Sociedade Brasileira de Analises 
 Clinicas 
Sociedade Brasileira de 
 Patologia Clinica 
Sociedad Espanola de Bioquimica 
 Clinica y Patologia Molecular 
Turkish Society of Microbiology 
 
Membros Governamentais 
 
Association of Public Health 
 Laboratories 
Armed Forces Institute of Pathology 
BC Centre for Disease Control 
Centers for Disease Control and 
 Prevention 
Centers for Medicare & Medicaid 
 Services/CLIA Program 
Centers for Medicare & Medicaid 
 Services 
Chinese Committee for Clinical 
 Laboratory Standards 
Commonwealth of Pennsylvania 
 Bureau of Laboratories 
Department of Veterans Affairs 
Deutsches Institut für Normung 
 (DIN) 
FDA Center for Devices and 
 Radiological Health 
FDA Center for Veterinary 
 Medicine 
FDA Division of Anti-Infective 
 Drug Products 
Iowa State Hygienic Laboratory 
Massachusetts Department of 
 Public Health Laboratories 
National Center of Infectious 
 and Parasitic Diseases (Bulgaria) 
National Health Laboratory Service 
 (South Africa) 
National Institute of Standards 
 and Technology 
New York State Department of 
 Health 
Ohio Department of Health 
Ontario Ministry of Health 
Pennsylvania Dept. of Health 
Saskatchewan Health-Provincial 
 Laboratory 
Scientific Institute of Public Health; 
 Belgium Ministry of Social 
 Affairs, Public Health and the 
 Environment 
Swedish Institute for Infectious 
 Disease Control 
Thailand Department of Medical 
 Sciences 
 
Membros na Indústria 
 
AB Biodisk 
Abbott Laboratories 
Abbott Laboratories, MediSense 
 Products 
Acrometrix Corporation 
Ammirati Regulatory Consulting 
Anaerobe Systems 
Asséssor 
AstraZeneca 
AstraZeneca R & D – Boston, MA 
Aventis 
Axis-Shield POC AS 
Bayer Corporation – Elkhart, IN 
Bayer Corporation – Tarrytown, NY 
Bayer Corporation – West Haven, 
 CT 
Bayer Medical Ltd. 
BD 
BD Biosciences – San Jose, CA 
BD Consumer Products General Hospital Vienna (Austria) Roche Laboratories (Div. 
 
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BD Diagnostic Systems 
BD Italia S.P.A. 
BD VACUTAINER Systems 
Beckman Coulter, Inc. 
Beckman Coulter, Inc. Primary Care 
 Diagnostics 
Beckman Coulter K.K. (Japan) 
Bio-Development SRL 
Bio-Inova Life Sciences 
 International 
Bio-Inova Life Sciences North 
 America 
BioMedia Laboratories Sdn Bhd 
BioMérieux (NC) 
bioMérieux, Inc. (MO) 
Biometrology Consultants 
Bio-Rad Laboratories, Inc. 
Bio-Rad Laboratories, Inc. - France 
Biotest AG 
Blaine Healthcare Associates, Inc. 
Bristol-Myers Squibb Company 
Canadian External Quality 
 Assessment Laboratory 
Capital Management Consulting, 
 Inc. 
Carl Schaper 
Checkpoint Development Inc. 
Chiron Corporation 
ChromaVision Medical Systems, 
 Inc. 
Chronolab Ag 
Clinical Design Group Inc. 
Clinical Laboratory Improvement 
 Consultants 
Cognigen 
Community Medical Center (NJ) 
Control Lab (Brazil) 
Copan Diagnostics Inc. 
Cosmetic Ingredient Review 
Cubist Pharmaceuticals 
Dade Behring Inc. - Deerfield, IL 
Dade Behring Inc. - Glasgow, DE 
Dade Behring Inc. - Marburg, 
 Germany 
Dade Behring Inc. - Sacramento, CA 
Dade Behring Inc. - San Jose, CA 
David G. Rhoads Associates, Inc. 
Diagnostics Consultancy 
Diagnostic Products Corporation 
Eiken Chemical Company, Ltd. 
Elan Pharmaceuticals 
Electa Lab s.r.l. 
Enterprise Analysis Corporation 
Essential Therapeutics, Inc. 
EXPERTech Associates, Inc. 
F. Hoffman-La Roche AG 
Fort Dodge Animal Health 
Gen-Probe 
GlaxoSmithKline 
Greiner Bio-One Inc. 
Helena Laboratories 
Home Diagnostics, Inc. 
Immunicon Corporation 
Instrumentation Laboratory 
International Technidyne 
 Corporation 
IntraBiotics Pharmaceuticals, Inc. 
I-STAT Corporation 
Johnson and Johnson Pharmaceutical 
 Research and Development, 
 L.L.C. 
Kendall Sherwood-Davis & Geck 
LAB-Interlink, Inc. 
Laboratory Specialists, Inc. 
Labtest Diagnostica S.A. 
LifeScan, Inc. (a Johnson & 
 Johnson Company) 
Lilly Research Laboratories 
Macemon Consultants 
Medical Device Consultants, Inc. 
Merck & Company, Inc. 
Minigrip/Zip-Pak 
Molecular Diagnostics, Inc. 
mvi Sciences (MA) 
Nabi 
Nichols Institute Diagnostics 
 (Div. of Quest Diagnostics, Inc.) 
NimbleGen Systems, Inc. 
Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. 
Nippon Becton Dickinson Co., Ltd. 
Norfolk Associates, Inc. 
Novartis Pharmaceuticals 
 Corporation 
Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. 
 (Raritan, NJ) 
Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. 
 (Rochester, NY) 
Oxoid Inc. 
Paratek Pharmaceuticals 
Pfizer Inc 
Pharmacia Corporation 
Philips Medical Systems 
Powers Consulting Services 
Premier Inc. 
Procter & Gamble 
 Pharmaceuticals, Inc. 
The Product Development Group 
QSE Consulting 
Quintiles, Inc. 
Radiometer America, Inc. 
Radiometer Medical A/S 
Roche Diagnostics GmbH 
Roche Diagnostics, Inc. 
 
 Hoffmann-La Roche Inc.) 
Sarstedt, Inc. 
SARL Laboratoire Carron (France) 
Schering Corporation 
Schleicher & Schuell, Inc. 
Second Opinion 
Showa Yakuhin Kako Company, 
 Ltd. 
Streck Laboratories, Inc. 
SurroMed, Inc. 
Synermed Diagnostic Corp. 
Sysmex Corporation (Japan) 
Sysmex Corporation - Long Grove, 
 IL 
The Clinical Microbiology Institute 
The Toledo Hospital (OH) 
Theravance Inc. 
Transasia Engineers 
Trek Diagnostic Systems, Inc. 
Versicor, Inc. 
Vetoquinol S.A. 
Visible Genetics, Inc. 
Vysis, Inc. 
Wallac Oy 
Wyeth-Ayerst 
Xyletech Systems, Inc. 
YD Consultant 
YD Diagnostics (Seoul, Korea) 
 
Associações de Classe 
 
AdvaMed 
Association of Medical 
 Diagnostic Manufacturers 
Japan Association Clinical 
 Reagents Ind. - Tokyo, Japan 
Medical Industry Association 
 of Australia 
 
Membros Associados Ativos 
 
20th Medical Group (SC) 
31st Medical Group/SGSL (APO, 
 AE) 
67th CSH Wuerzburg, GE (NY) 
121st General Hospital (CA) 
Academisch Ziekenhuis-VUB 
 (Belgium) 
Acadiana Medical Laboratories, 
 LTD (LA) 
Adena Regional Medical Center 
 (OH) 
Advocate Healthcare Lutheran 
 General (IL) 
Akershus Central Hospital and AFA 
 (Norway) 
Albemarle Hospital (NC) 
Allegheny General Hospital (PA) 
Allegheny University of the 
Clarian Health–Methodist Hospital 
 (IN) 
Gateway Medical Center (TN) 
Geisinger Medical Center (PA) 
Grady Memorial Hospital (GA) 
 
An NCCLS global consensus standard. ©NCCLS. All rights reserved 6 
 Health Sciences (PA) 
Allina Health System (MN) 
Alton Ochsner Medical 
 Foundation (LA) 
American Medical Laboratories 
 (VA) 
Antwerp University Hospital 
 (Belgium) 
Arkansas Department of Health 
ARUP at University Hospital (UT) 
Armed Forces Research Institute of 
 Medical Science (APO, AP) 
Associated Regional & 
 University Pathologists (UT) 
Aurora Consolidated 
 Laboratories (WI) 
Azienda Ospedale Di Lecco (Italy) 
Bay Medical Center (MI) 
Baystate Medical Center (MA) 
Bbaguas Duzen Laboratories 
 (Turkey) 
Bermuda Hospitals Board 
Bo Ali Hospital (Iran) 
British ColumbiaCancer Agency 
 (Vancouver, BC, Canada) 
Brooks Air Force Base (TX) 
Broward General Medical Center 
 (FL) 
Calgary Laboratory Services 
Carilion Consolidated Laboratory 
 (VA) 
Cathay General Hospital (Taiwan) 
CB Healthcare Complex 
 (Sydney, NS, Canada) 
Central Peninsula General Hospital 
 (AK) 
Central Texas Veterans Health Care 
 System 
Centre Hospitalier Regional del la 
 Citadelle (Belgium) 
Centro Diagnostico Italiano 
 (Milano, Italy) 
Champlain Valley Physicians 
 Hospital (NY) 
Chang Gung Memorial Hospital 
 (Taiwan) 
Changi General Hospital 
 (Singapore) 
Children’s Hospital (NE) 
Children’s Hospital & Clinics (MN) 
Children’s Hospital Medical Center 
 (Akron, OH) 
Children’s Hospital of 
 Philadelphia (PA) 
Children’s Medical Center of Dallas 
 (TX) 
 
Clendo Lab (Puerto Rico) 
Clinical Laboratory Partners, LLC 
 (CT) 
CLSI Laboratories (PA) 
Columbia Regional Hospital (MO) 
Commonwealth of Kentucky 
Community Hospital of Lancaster 
 (PA) 
CompuNet Clinical Laboratories 
 (OH) 
Cook County Hospital (IL) 
Cook Children’s Medical Center 
 (TX) 
Covance Central Laboratory 
 Services (IN) 
Danish Veterinary Laboratory 
 (Denmark) 
Danville Regional Medical Center 
 (VA) 
Delaware Public Health Laboratory 
Department of Health & 
 Community Services (New 
 Brunswick, Canada) 
DesPeres Hospital (MO) 
DeTar Hospital (TX) 
Detroit Health Department (MI) 
Diagnosticos da América S/A 
 (Brazil) 
Dr. Everett Chalmers Hospital 
 (New Brunswick, Canada) 
Doctors Hospital (Bahamas) 
Duke University Medical Center 
 (NC) 
E.A. Conway Medical Center (LA) 
Eastern Maine Medical Center 
East Side Clinical Laboratory (RI) 
Eastern Health (Vic., Australia) 
Elyria Memorial Hospital (OH) 
Emory University Hospital (GA) 
Esoterix Center for Infectious 
 Disease (TX) 
Fairview-University Medical 
 Center (MN) 
Federal Medical Center (MN) 
Florida Hospital East Orlando 
Foothills Hospital (Calgary, AB, 
 Canada) 
Fort St. John General Hospital 
 (Fort St. John, BC, Canada) 
Fox Chase Cancer Center (PA) 
Fresenius Medical Care/Spectra 
 East (NJ) 
Fresno Community Hospital and 
 Medical Center 
Frye Regional Medical Center (NC) 
Gambro Healthcare Laboratory 
 Services (FL) 
Guthrie Clinic Laboratories (PA) 
Hahnemann University Hospital 
 (PA) 
Harris Methodist Erath County 
 (TX) 
Harris Methodist Fort Worth (TX) 
Hartford Hospital (CT) 
Headwaters Health Authority 
 (Alberta, Canada) 
Health Network Lab (PA) 
Health Partners Laboratories (VA) 
Heartland Regional Medical Center 
 (MO) 
Highlands Regional Medical Center 
 (FL) 
Hoag Memorial Hospital 
 Presbyterian (CA) 
Holmes Regional Medical Center 
 (FL) 
Holzer Medical Center (OH) 
Hopital du Sacre-Coeur de Montreal 
 (Montreal, Quebec, Canada) 
Hôpital Maisonneuve – Rosemont 
 (Montreal, Canada) 
Hospital for Sick Children 
 (Toronto, ON, Canada) 
Hospital Sousa Martins (Portugal) 
Hotel Dieu Hospital (Windsor, ON, 
 Canada) 
Houston Medical Center (GA) 
Huddinge University Hospital 
 (Sweden) 
Hurley Medical Center (MI) 
Indiana State Board of Health 
Indiana University 
Institute of Medical and Veterinary 
 Science (Australia) 
International Health Management 
 Associates, Inc. (IL) 
Jackson Memorial Hospital (FL) 
Jersey Shore Medical Center (NJ) 
John C. Lincoln Hospital (AZ) 
John F. Kennedy Medical Center 
 (NJ) 
John Peter Smith Hospital (TX) 
Kadlec Medical Center (WA) 
Kaiser Permanente Medical Care 
 (CA) 
Kaiser Permanente (MD) 
Kantonsspital (Switzerland) 
Keller Army Community Hospital 
 (NY) 
Kenora-Rainy River Regional 
 Laboratory Program (Ontario, 
 Canada) 
Kern Medical Center (CA) 
 
An NCCLS global consensus standard. ©NCCLS. All rights reserved 7
Kimball Medical Center (NJ) 
King Faisal Specialist Hospital 
 (Saudi Arabia) 
King Khalid National Guard 
 Hospital (Saudi Arabia) 
King’s Daughter Medical Center 
 (KY) 
Klinični Center (Slovenia) 
Laboratories at Bonfils (CO) 
Laboratoire de Santé Publique du 
 Quebec (Canada) 
Laboratório Fleury S/C Ltda. 
 (Brazil) 
Laboratory Corporation of America 
 (NJ) 
Laboratory Corporation of 
 America (MO) 
LAC and USC Healthcare 
 Network (CA) 
Lakeland Regional Medical Center 
 (FL) 
Lancaster General Hospital (PA) 
Langley Air Force Base (VA) 
LeBonheur Children’s 
 Medical Center (TN) 
L'Hotel-Dieu de Quebec (Canada) 
Libero Instituto Univ. Campus 
 BioMedico (Italy) 
Louisiana State University 
 Medical Center 
Maccabi Medical Care and Health 
 Fund (Israel) 
Magee Womens Hospital (PA) 
Malcolm Grow USAF Medical 
 Center (MD) 
Manitoba Health (Winnipeg, 
 Canada) 
Martin Luther King/Drew Medical 
 Center (CA) 
Massachusetts General Hospital 
 (Microbiology Laboratory) 
MDS Metro Laboratory Services 
 (Burnaby, BC, Canada) 
Medical College of Virginia 
 Hospital 
Medicare/Medicaid Certification, 
 State of North Carolina 
Memorial Medical Center (IL) 
Memorial Medical Center (LA) 
 Jefferson Davis Hwy 
Memorial Medical Center (LA) 
 Napoleon Avenue 
Methodist Hospital (TX) 
Methodist Hospitals of Memphis 
 (TN) 
MetroHealth Medical Center (OH) 
Michigan Department of 
 Community Health 
Mississippi Baptist Medical Center 
Monte Tabor – Centro Italo - 
 Brazileiro de Promocao (Brazil) 
Montreal Children’s Hospital 
 (Canada) 
Montreal General Hospital 
 (Canada) 
MRL Pharmaceutical Services, Inc. 
 (VA) 
MRL Reference Laboratory (CA) 
Nassau County Medical Center 
 (NY) 
National Institutes of Health (MD) 
Naval Hospital – Corpus Christi 
 (TX) 
Naval Surface Warfare Center (IN) 
Nebraska Health System 
New Britain General Hospital (CT) 
New England Fertility Institute 
 (CT) 
New Mexico VA Health Care 
 Systems 
North Carolina State Laboratory of 
 Public Health 
North Kansas City Hospital (MO) 
North Shore – Long Island Jewish 
 Health System Laboratories (NY) 
Northwestern Memorial Hospital 
 (IL) 
O.L. Vrouwziekenhuis (Belgium) 
Ordre professionnel des 
 technologists médicaux du 
 Québec 
Ospedali Riuniti (Italy) 
The Ottawa Hospital 
 (Ottawa, ON, Canada) 
Our Lady of Lourdes Hospital (NJ) 
Our Lady of the Resurrection 
 Medical Center (IL) 
Pathology and Cytology 
 Laboratories, Inc. (KY) 
The Permanente Medical Group 
 (CA) 
Piedmont Hospital (GA) 
Pikeville Methodist Hospital (KY) 
Pocono Hospital (PA) 
Presbyterian Hospital of Dallas 
 (TX) 
Queen Elizabeth Hospital (Prince 
 Edward Island, Canada) 
Queensland Health Pathology 
 Services (Australia) 
Quest Diagnostics Incorporated 
 (CA) 
Quintiles Laboratories, Ltd. (GA) 
Regions Hospital 
Reid Hospital & Health Care 
 Services (IN) 
Research Medical Center (MO) 
Rex Healthcare (NC) 
Rhode Island Department of Health 
 Laboratories 
Riyadh Armed Forces Hospital 
 (Saudi Arabia) 
Royal Columbian Hospital (New 
 Westminster, BC, Canada) 
Sacred Heart Hospital (MD) 
Saint Mary’s Regional Medical 
 Center (NV) 
St. Alexius Medical Center (ND) 
St. Anthony Hospital (CO) 
St. Anthony’s Hospital (FL) 
St. Barnabas Medical Center (NJ) 
St-Eustache Hospital (Quebec, 
 Canada) 
St. Francis Medical Ctr. (CA) 
St. John Hospital and Medical 
 Center (MI) 
St. John Regional Hospital (St. 
 John, NB, Canada) 
St. Joseph Hospital (NE) 
St. Joseph’s Hospital – Marshfield 
 Clinic (WI) 
St. Joseph Mercy Hospital (MI) 
St. Jude Children's Research 
 Hospital (TN) 
St. Luke’s Regional Medical 
 Center (IA) 
St. Mary of the Plains Hospital 
 (TX) 
St. Mary’s Hospital & Medical 
 Center (CO) 
St. Paul’s Hospital (Vancouver, BC, 
 Montreal) 
St. Vincent Medical Center (CA) 
Ste. Justine Hospital (Montreal, PQ, 
 Canada) 
SalinaRegional Health Center (KS) 
San Francisco General Hospital 
 (CA) 
Santa Clara Valley Medical Center 
 (CA) 
Seoul Nat’l University Hospital 
 (Korea) 
Shanghai Center for the 
 Clinical Laboratory (China) 
South Bend Medical Foundation 
 (IN) 
Southwest Texas Methodist Hospital 
 (TX) 
South Western Area Pathology 
 Service (Australia) 
Southern Maine Medical Center 
Specialty Laboratories, Inc. (CA) 
Stanford Hospital and Clinics (CA) 
 
 
An NCCLS global consensus standard. ©NCCLS. All rights reserved 8 
State of Washington Department of 
 Health 
Stony Brook University Hospital 
 (NY) 
Stormont-Vail Regional Medical 
 Center (KS) 
Sun Health-Boswell Hospital (AZ) 
Sunrise Hospital and Medical 
 Center (NV) 
Swedish Medical Center – 
 Providence Campus (WA) 
Tampa General Hospital (FL) 
Temple University Hospital (PA) 
Tenet Odessa Regional Hospital
 (TX) 
The Toledo Hospital (OH) 
Touro Infirmary (LA) 
Trident Regional Medical Center 
 (SC) 
Tripler Army Medical Center (HI) 
Truman Medical Center (MO) 
UCSF Medical Center (CA) 
UNC Hospitals (NC) 
University College Hospital 
 (Galway, Ireland) 
University Hospital (Gent) 
 (Belgium) 
University Hospitals of Cleveland 
 (OH) 
The University Hospitals (OK) 
University of Alabama-Birmingham 
 Hospital 
University of Alberta Hospitals 
 (Canada) 
University of Colorado Health 
 Science Center 
University of Chicago Hospitals (IL) 
University of Illinois Medical Center 
University of the Ryukyus (Japan) 
University of Texas M.D. Anderson 
 Cancer Center 
University of Virginia Medical 
 Center 
University of Washington 
UZ-KUL Medical Center (Belgium) 
VA (Denver) Medical Center (CO) 
Virginia Department of Health 
VA (Kansas City) Medical Center 
 (MO) 
VA (Western NY) Healthcare 
 System 
VA (San Diego) Medical Center 
 (CA) 
 
VA (Tuskegee) Medical Center 
 (AL) 
VA Outpatient Clinic (OH) 
Vejle Hospital (Denmark) 
Washington Adventist Hospital 
 (MD) 
Washoe Medical Center 
 Laboratory (NV) 
West Jefferson Medical Center 
 (LA) 
West Shore Medical Center (MI) 
Wilford Hall Medical Center (TX) 
William Beaumont Army Medical 
 Center (TX) 
William Beaumont Hospital (MI) 
Williamsburg Community Hospital 
 (VA) 
Winn Army Community Hospital 
 (GA) 
Winnipeg Regional Health 
 Authority (Winnipeg, Canada) 
Wishard Memorial Hospital (IN) 
Yonsei University College of 
 Medicine (Korea) 
York Hospital (PA) 
 
 
 
 
AUTORIDADES 
 
MEMBROS DA DIRETORIA 
 
Donna M. Meyer, Ph.D., 
 Presidente 
CHRISTUS Health 
 
Thomas L. Hearn, Ph.D., 
 Presidente Eleito 
Centers for Disease Control and 
 Prevention 
 
Emil Voelkert, Ph.D., 
 Secretário 
Roche Diagnostics GmbH 
 
Gerald A. Hoeltge, M.D., 
 Tesoureiro 
The Cleveland Clinic Foundation 
 
F. Alan Andersen, Ph.D., 
 Presidente Imediatamente Anterior 
Cosmetic Ingredient Review 
 
John V. Bergen, Ph.D., 
 Director Executivo 
 
Susan Blonshine, RRT, RPFT, 
 FAARC 
TechEd 
 
Wayne Brinster 
BD 
 
Kurt H. Davis, FCSMLS, CAE 
Canadian Society for Medical 
 Laboratory Science 
 
Lillian J. Gill, M.S. 
FDA Center for Devices and 
 Radiological Health 
 
Robert L. Habig, Ph.D. 
Habig Consulting Group 
 
Carolyn D. Jones, J.D., M.P.H. 
AdvaMed 
 
 
Tadashi Kawai, M.D., Ph.D. 
International Clinical Pathology 
 Center 
 
J. Stephen Kroger, M.D., FACP 
COLA 
 
Willie E. May, Ph.D 
National Institute of Standards and 
 Technology 
 
Gary L. Myers, Ph.D. 
Centers for Disease Control and 
 Prevention 
 
Barbara G. Painter, Ph.D. 
Bayer Corporation (Retired) 
 
Judith A. Yost, M.A., M.T.(ASCP) 
Centers for Medicare & Medicaid 
 Services 
 
 
 
An NCCLS global consensus standard. ©NCCLS. All rights reserved 9
Sumário 
 
Resumo 
 
Membros do Comitê 
 
Membros Ativos 
 
Prefácio 
 
Enfoque de Sistema de Qualidade 
 
1. Introdução 
1.1 Abrangência 
1.2 Definições 
 
2. Agentes Antifúngicos 
2.1 Fontes 
2.2 Pesagem de Agentes Antifúngicos 
2.3 Preparação de Soluções-Padrão 
2.4 Número de Concentrações Testadas 
2.5 Seleção dos Agentes Antifúngicos para Testes e Relatório de Rotina 
 
3. Metodologia dos Testes 
3.1 Meio Líquido 
3.2 Diluições dos Agentes Antifúngicos 
3.3 Preparação do Inóculo 
3.4 Meio de Inoculação RPMI-1640 
3.5 Incubação 
3.6 Leitura dos Resultados 
3.7 Interpretação dos Resultados 
3.8 Modificações nas Microdiluições em Caldo 
3.9 Impacto do Tempo de Leitura: 24 horas versus 48 horas 
3.10 Outras Modificações 
 
4. Controle de Qualidade 
4.1 Propósito 
4.2 Responsabilidades no Controle de Qualidade 
4.3 Seleção das Cepas de Referência 
4.4 Armazenamento das Cepas de Referência 
4.5 Uso Rotineiro das Cepas de Referência 
4.6 Controle dos Lotes de Meio e Material Plástico 
4.7 Freqüência do Controle de Qualidade 
4.8 Outros Procedimentos de Controle 
4.9 Cepas de Controle de Qualidade 
 
Referências Bibliográficas 
 
Apêndice A: Meio RPMI 1640 
 
Apêndice B: Padrão de Turbidez de Sulfato de Bário McFarland 0,5 
 
Apêndice C: Diretrizes de Interpretação dos Testes de Sensibilidade in Vitro das Espécies de Candida 
 
 
An NCCLS global consensus standard. ©NCCLS. All rights reserved 10 
Tabela 1. Solventes e Diluentes para a Preparação de Soluções Padrão de Agentes Antifúngicos 
 
Tabela 2. Esquema de Preparação de Diluições de Agentes Antifúngicos Solúveis em Água para Uso em 
Testes de Sensibilidade por Diluição em Caldo 
 
Tabela 3. Esquema de Diluição Seriada de Agentes Antifúngicos Insolúveis em Água para Uso em Testes 
de Sensibilidade por Diluição em Caldo 
 
Tabela 4. Limites Recomendados para CIMs de 48 Horas para Quatro Cepas de Referência para Testes de 
Macrodiluição em Caldo 
 
Tabela 5. Limites Recomendados para CIMs de 24 e 48 Horas para Duas Cepas de Controle de Qualidade 
para Testes de Microdiluição em Caldo 
 
Tabela 6. Composição do Meio RPMI-1640 
 
Tabela 7. Modificações para Circunstâncias Especiais 
 
Resumo dos Comentários e Respostas do Subcomitê 
 
Resumo dos Comentários dos Delegados e Respostas do Subcomitê 
 
Publicações Afins do NCCLS 
 
 
 
 
 
An NCCLS global consensus standard. ©NCCLS. All rights reserved 11
Prefácio 
 
Com o aumento da incidência de infecções sistêmicas por fungos e de agentes antifúngicos, cresceu 
também o interesse em métodos laboratoriais para orientar a seleção da terapia antifúngica. O Comitê da 
Área de Microbiologia do NCCLS estabeleceu o Subcomitê para Testes de Sensibilidade a Agentes 
Antifúngicos que, em 1985, publicou seu primeiro relatório, no qual foram apresentados resultados de um 
questionário e um pequeno estudo colaborativo. Esses resultados são resumidos a seguir. 
 
• Aproximadamente 20% dos membros do NCCLS que responderam e cujos hospitais tinham mais 
de 200 leitos estavam realizando testes com agentes antifúngicos. 
 
• A metodologia usada na maioria dos testes era a diluição em caldo. 
 
• A maioria das cepas testadas era Candida albicans ou outras espécies de leveduras. 
 
• A maioria dos centros testava poucos isolados por ano. 
 
• A concordância dos resultados dos testes de concentração inibitória mínima (CIM), entre os 
diferentes laboratórios que participaram no estudo colaborativo, era inaceitavelmente, baixa. 
 
Com base nesses achados, o subcomitê concluiu que seria proveitoso desenvolver metodologia mais 
reprodutível para testes de referência. 
 
Havia um acordo em relação a vários elementos da metodologia. Para facilitar a análise mais apurada das 
diversas condições de teste, o método de referência deveria ser o teste de macrodiluição em caldo. Devido 
a exemplos de antagonismos ’as drogas, por parte de alguns meios de cultura complexos em relação a 
certos agentesantifúngicos, o subcomitê limitou seu interesse a meios sintéticos completamente 
definidos. Os procedimentos de preparação e diluição das soluções-padrão das drogas desenvolvidas, 
anteriormente, para testes com agentes antibacterianos, foram adotados após pequenas modificações. 
 
Embora houvesse acordo em outras áreas, precisava-se de dados adicionais para resolver outras questões. 
Esses incluíam a preparação do inóculo; tamanho do inóculo; escolha entre os vários meios sintéticos; 
temperatura de incubação; período de incubação; e definição do ponto final. Essas questões foram objeto 
de uma série de estudos colaborativos.1,2,3,4 Assim, o subcomitê chegou a um acordo sobre todos as 
questões, o que resultou na publicação da Norma M27-P, em 1992. Nos quatro anos seguintes (1992-
1996), estabeleceram-se as faixas de referência de CIM para duas cepas de controle de qualidade para os 
agentes antifúngicos disponíveis,5,6 e disponibilizou-se uma metodologia para o teste de microdiluição em 
caldo correspondente à do teste de referência por microdiluição em caldo.4,7,8,9 Essas informações foram 
incluídas na norma revisada, publicada em 1995 (M27-T). Em revisão posterior do documento, o 
subcomitê centrou sua atenção no desenvolvimento de pontos de corte relevantes para os agentes 
antifúngicos disponíveis10 incluídos na Norma M27-A (1997). Desde então, o subcomitê desenvolveu as 
faixas de referência das CIMs de 24 e 48 horas para os testes de microdiluição com agentes antifúngicos, 
tanto estabelecidos como recém lançados.11 Os resultados desses estudos foram incluídos na atual Norma 
M27-A2. 
 
Precauções- Padrão 
Sendo impossível saber, com freqüência, o que é infectante, todos os espécimes de sangue humano devem 
ser tratados como infectantes e manuseados de acordo com as “precauções-padrão”. Essas são as novas 
diretrizes que combinam as características principais das práticas de “precauções universais e isolamento 
de substâncias corpóreas”. As precauções-padrão englobam a transmissão de qualquer patógeno e, por 
isso, são mais abrangentes do que as precauções universais, que visam apenas aos patógenos transmitidos 
pelo sangue. As diretrizes relativas às precauções-padrão e precauções universais são disponibilizadas 
pelo U.S. Centers for Disease Control and Prevention (Guideline for Isolation Precautions in Hospitals. 
 
An NCCLS global consensus standard. ©NCCLS. All rights reserved 12 
Infection Control and Hospital Epidemiology. CDC. 1996; Vol 17; 1:53-80), (MMWR 1987; 36[suppl 
2S] 2S-18S) e (MMWR 1988; 37:377-382, 387-388). No caso de precauções específicas para a prevenção 
da transmissão laboratorial de infecções transmitidas pelo sangue, por meio de instrumentos e materiais 
de laboratório, assim como as recomendações relativas à conduta de exposições a sangue, favor reportar-
se à edição mais recente do documento M29—Protection of Laboratory Workers from Occupationally 
Acquired Infections do NCCLS. 
 
Palavras-Chave 
 
Antifúngico, macrodiluição em caldo, microdiluição em caldo, teste de sensibilidade, leveduras 
 
Enfoque de Sistema de Qualidade 
 
O NCCLS endossa o enfoque de sistema de qualidade para o desenvolvimento de normas/padrões e 
diretrizes, visto que facilita a gestão de projetos; define a estrutura dos documentos por meio de um 
gabarito; e fornece um processo para identificar os documentos necessários usando a análise de lacunas 
(gap analysis). O enfoque baseia-se no modelo apresentado na edição mais recente do documento HS1—
A Quality System Model for Health Care do NCCLS. O enfoque de sistema de qualidade aplica-se a um 
conjunto central de elementos “essenciais dos sistemas de qualidade (EEQS)”, básicos a qualquer 
organização, a todas as operações em qualquer rota de fluxograma, de qualquer organização prestadora de 
serviços de atenção à saúde. Os EEQS fornecem um arcabouço para a provisão de qualquer tipo de 
produto ou serviço, servindo como guia dos gerentes. Os elementos essenciais dos sistemas de qualidade 
(EEQS) são os seguintes. 
 
 Elementos Essenciais dos Sistemas de Qualidade--EEQS 
Documentos e Registros Gestão da Informação 
Organização Gestão de Ocorrências 
Pessoal Avaliação 
Equipamento Melhoria de Processos 
Compras e Inventário Serviços e Satisfação 
Controle de Processos Instalações e Segurança 
 
 
A Norma M27-A2 trata dos seguintes elementos essenciais dos sistemas de qualidade (EEQS): 
 
D
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Se
gu
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 X 
 
Tabela adaptada do documento HS1— A Quality System Model for Health Care do NCCLS. 
 
Etapa do Fluxograma 
 
Uma etapa do fluxograma é a descrição dos passos necessários para prover um determinado produto ou 
serviço fornecido pela organização ou entidade. Por exemplo, a Norma GP26-A2 define uma etapa do 
fluxograma dos laboratórios clínicos que consiste em três passos seqüenciais: pré-analítico, analítico e 
pós-analítico. Todos os laboratórios clínicos seguem esses três processos para prestar serviços 
laboratoriais, a saber, informações laboratoriais de qualidade. A seta mostra a seqüência, da esquerda para 
a direita, que todo laboratório clínico segue. Além disso, os passos ou subprocessos necessários 
encontram-se relacionados logo abaixo do fluxograma. 
 
An NCCLS global consensus standard. ©NCCLS. All rights reserved 13
Adaptado do documento HS1 _ do NCCLS.A Quality System Model for Health Care
Laboratório de Patologia ClínicaLaboratório de Patologia Clínica
Pré-analíticas
Avaliação do paciente
Solicitação do teste
Coleta do espécime
Transporte do espécime
Recebimento do espécime
Analítica
Revisão do teste
Interpretação
Pós-analítica
Relatório de resultados
Gerenciamento pós-teste
 
 
A maioria dos documentos do NCCLS está relacionada com os laboratórios de patologia clínica, de 
maneira que a rota mais comum do fluxograma pode ser representada conforme visto anteriormente. As 
etapas do fluxograma relativas a outras atividades de atenção à saúde, ex., serviços respiratórios, serviços 
de imagens, etc., ou a outros tipos de organizações, ex., fabricantes de dispositivos médicos, irão diferir 
das dos laboratórios de patologia clínica serão diferentes das dos laboratórios de patologia clínica. Toda 
etapa do fluxograma descreve a seqüência das atividades necessárias à produção dos produtos ou serviços 
de uma organização ou entidade específica. Para aqueles documentos relacionados com outras etapas do 
fluxograma, o ícone refletirá passos diferentes do processo. 
 
A Norma M27-A2 focaliza os Seguintes Passos na Etapa do Fluxograma dos Laboratórios de 
Patologia Clínica 
 
Pré-analíticos Analíticos Pós-analíticos 
Avaliação 
do Paciente 
Solicitação 
do Teste 
Coleta do 
Espécime 
Transporte 
do 
Espécime
Recebiment
o do 
Espécime 
Revisão
Do Teste
Interpretação 
Laboratorial 
Relatório de 
Resultados 
Gestão do 
Espécime Pós-
teste 
 X X X X 
Adaptado do documento HS1— A Quality System Model for Health Care do NCCLS. 
 
An NCCLS global consensus standard. ©NCCLS. All rights reserved 14 
Método de Referência para Testes de Diluição em Caldo para a Determinação da Sensibilidade de 
Leveduras á Terapia Antifúngica; Norma Aprovada—Segunda Edição 
 
1 Introdução 
 
O método descrito neste documento focaliza os testes para levedurasque causam infecções invasivas. 
Essas leveduras incluem espécies de Candida (incluindo Candida glabrata) e Cryptococcus neoformans. 
O método não tem sido usado em estudos com fungos dimórficos em fase leveduriforme, como 
Blastomyces dermatitidis ou Histoplasma capsulatum variedade capsulatum. Outrossim, os testes com 
fungos filamentosos levantam vários problemas adicionais em sua normatização que não foram resolvidos 
pela atual metodologia. Foi desenvolvido um método de referência para testes de sensibilidade aos 
agentes antifúngicos, por diluição em caldo, que foi disponibilizado no documento M38—Reference 
Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi do NCCLS.13,14 
 
A Norma M27-A2 é um método de “referência” que está sendo desenvolvido por meio do processo 
consensual para facilitar a concordância entre laboratórios na determinação da sensibilidade de leveduras 
a agentes antifúngicos. Uma aplicação importante de métodos de referência é fornecer uma base padrão, a 
partir da qual outros métodos podem ser desenvolvidos, o que também resultará em reprodutibilidade 
interlaboratorial com faixa de erro determinada Por exemplo, os métodos de microdiluição em caldo 
descritos neste documento, foram configurados para produzir resultados concordantes com aqueles 
obtidos pelo método de referência. Esse método pode ter vantagens especiais, como: facilidade de 
execução, economia ou resultados mais rápidos; portanto, seu desenvolvimento pode ser desejável. Se o 
método produz resultados concordantes com o método de referência, será considerado em conformidade 
com a Norma M27-A2 do NCCLS. 
 
1.1 Abrangência 
 
Este documento descreve um método para testar a sensibilidade de leveduras que causam infecções, 
incluindo as espécies de Candida e Cryptococcus neoformans. Este método não foi validado para a fase 
leveduriforme de fungos dimórficos, como Blastomyces dermatitidis ou Histoplasma capsulatum 
variedade capsulatum. 
 
O subcomitê focalizou o desenvolvimento dos pontos de corte relevantes para os agentes antifúngicos 
disponíveis11 e fez referência aos intervalos de CIM para os testes de microdiluição com agentes 
antifúngicos, tanto estabelecidos, como os recém introduzidos.12 
 
1.2 Definiçõesa 
 
Antibiograma, n –Perfil geral dos resultados da sensibilidade antimicrobiana de uma espécie de micróbio 
a um painel de agentes antimicrobianos. 
 
Concentração inibitória mínima (CIM), n – A concentração mais baixa de um agente antimicrobiano 
que impede crescimento visível de um microorganismo no teste de sensibilidade por diluição em ágar ou 
caldo. 
 
2 Agentes Antifúngicos 
 
2.1 Fonte 
 
 
a Algumas destas definições são apresentadas na Norma NRSCL8 - Terminology e Definitions for Use in NCCLS Documents do 
NCCLS. Para definições mais completas e informações detalhadas sobre as fontes, favor reportar-se à edição mais recente desse 
documento. 
 
 
An NCCLS global consensus standard. ©NCCLS. All rights reserved 15
Os padrões ou substâncias de referência dos antifúngicos podem ser obtidos comercialmente ou 
diretamente do fabricante.b Não usar soluções-padrão da farmácia ou outras formulações para uso 
clínico. As substâncias aceitáveis têm o nome genérico da droga no rótulo, bem como sua potência 
determinada em ensaios em geral, expressa em microgramas (µg) ou Unidades Internacionais por mg de 
pó] e a data de vencimento. As substâncias devem ser armazenadas de acordo com as instruções do 
fabricante, ou a -20° C ou menos, em dessecador (de preferência sob vácuo). Quando o dessecador é 
retirado do congelador, deve permanecer à temperatura ambiente, antes de ser aberto (para evitar a 
condensação de água). 
 
2.2 Pesagem das substâncias Antifúngicas 
 
Todos os agentes antifúngicos devem ser submetidos a ensaio para determinar sua potência. A potência 
determinada no ensaio pode com freqüência, varia conforme cada lote de produção da droga. Por isso, o 
laboratório deve padronizar suas soluções antifúngicas com base nos resultados dos ensaios dos lotes de 
substâncias antifúngicas que estão sendo usados. 
 
Ambas as equações, a seguir, podem ser usadas para determinar a quantidade de pó ou diluentes 
necessários para preparar a solução-mãe: 
 
Peso (mg) = Volume (mL) x Concentração (µg/mL) (1) 
 Potência da substância (µg/mg) 
ou 
 
Vol. (mL) = Peso (mg) x Potência da substância (µg/mg) (2) 
 Concentração (µg/mL) 
 
O antifúngico sob forma de pó deve ser pesado em balança analítica calibrada com pesos-padrão de 
referência do National Institute of Standards e Technology (KIST [Gaithersburg, MD]) ou outros 
aprovados. Em geral, recomenda-se pesar com precisão uma quantidade em excesso do pó necessário e 
calcular o volume de diluente final para obtenção da concentração desejada final. 
 
Exemplo: Para preparar 100mL de uma solução-padrão contendo 1280µg de agente antifúngico por mL, 
usando pó antifúngico com potência de 750 µg/mg, utilizar a primeira equação para estabelecer o peso de 
pó necessário: 
 
 
 
170,7 mg = 
 750 
(Potência)
µg/mg
 
 x 100 mL
(Vol. Alvo)
 = Peso(mg)
1280 
(Conc. Desejada)
µg/mL 
 
(3) 
 
 
Visto que é recomendável pesar uma porção de pó em excesso do requerido, coloca-se pó na balança até 
chegar a 182,6mg. Com essa quantidade de pó pesado, utiliza-se a equação (2), anterior, para determinar a 
quantidade de diluente necessária: 
 
 (4) 
 
b Nos Estados Unidos, os antifúngicos sob forma de pó ou substância de referência podem ser, também, adquiridos da U.S. 
Pharmacopoeia (12001 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852). 
 
An NCCLS global consensus standard. ©NCCLS. All rights reserved 16 
mL 107,0 = 
 1280 
(Concentração desejada)
µg/mL
750 
(Potência)
µg/mg x 182,6 mg
(Peso do Pó)
 = 
(mL)
Volume
 
 
Conc. final 
 
Portanto, os 182,6 mg de antifúngico em pó deverão ser dissolvidos em 107,0 mL do diluente. 
 
2.3 Preparação de Soluções-Padrão 
 
As soluções-padrão de antifúngicos são preparadas em concentrações de, pelo menos, 1280 µg/mL ou dez 
vezes a concentração mais alta a ser testada, sendo sempre a maior das duas. No entanto, existem alguns 
agentes antifúngicos de solubilidade limitada que podem requerer concentrações mais baixas. Em todos 
os casos, as informações fornecidas pelo fabricante da droga devem ser consideradas na determinação da 
solubilidade. 
 
2.3.1 Uso de Solventes não-aquosos 
 
Algumas drogas devem ser dissolvidas em solventes diferentes da água (ver Tabela 1). As informações 
sobre solubilidade de um agente antifúngico devem estar anexadas ao produto. Essas drogas devem ser 
dissolvidas em concentrações 100X mais altas, pelo menos, do que a maior concentração usada no teste. 
Os agentes, mais freqüentemente, usados incluem: dimetilsulfóxido (DMSO), álcool etílico, 
polietilenoglicol e carboxi-metil-celulose, todos em qualidade analítica. Quando esses solventes forem 
empregados, recomenda-se preparar uma série de diluições com esses solventes, a partir da solução-mãe, 
até obtenção de 100 vezes a concentração final. A seguir, cada solução intermediária deverá ser diluída 
até a concentração final usada no teste (ver a Tabela 1). Esse procedimento impede artefatos resultantes 
da precipitação de produtos de baixa solubilidade em meio aquoso. 
 
Por exemplo, para preparar uma série de diluições para os testes, contendo uma droga insolúvel em água, 
mas solúvel em DMSO, cuja maior concentração final é 16µg/mL, pesa-se primeiro 4,8mg (assumindo 
potência de 100%) do antifúngico em pó que é dissolvido em 3,0mL de DMSO. Isso resulta em solução-
padrão de 1.600µg/mL. A seguir, preparam-se mais diluições dessa solução-mãeem DMSO. (Ver as 
Tabelas 2 e 3). As soluções em DMSO serão diluídas 10X no meio de cultura usado no teste (ver a Seção 
3.3) reduzindo a concentração final do solvente para 1%. O DMSO nessa concentração (sem a droga) 
deve ser usado no teste como controle de diluição. 
 
O exemplo anterior assume uma potência de 100% para o antifúngico em pó. Se a potência for diferente, 
será necessário aplicar os cálculos fornecidos na Seção 2.2. 
 
2.3.2 Filtragem 
 
Em geral, as soluções-padrão não contém microorganismos contaminantes, podendo-se assumir que são 
estéreis. Para se ter certeza da esterilidade, é necessário filtrá-las através de uma membrana-filtro. Os 
filtros de papel, amianto ou vidros sintetizados, que podem absorver quantidades apreciáveis de certos 
agentes antifúngicos, não devem ser usados. Sempre que se usar filtragem, é importante documentar a 
ausência de absorção por meio dos resultados de ensaios apropriados. 
 
2.3.3 Armazenamento 
 
Pequenos volumes de soluções-padrão estéreis são colocados em frascos estéreis de polipropileno ou 
polietileno, selados, cuidadosamente e armazenados (de preferência à temperatura de -60°C ou menores, 
mas nunca à temperatura superior à -20° C). Os frascos são retirados, conforme necessário, e usados no 
mesmo dia. Qualquer droga não usada deve ser descartada no fim do dia. As soluções-padrão dos agentes 
 
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antifúngicos, em sua maioria, podem ser armazenadas a -60° C, ou menos, durante seis meses ou mais, 
sem perda significativa de atividade12. Em todo caso, qualquer orientação fornecida pelo fabricante da 
droga deve ser considerada como parte destas recomendações gerais e prevalecer sobre qualquer 
orientação diferente. É indispensável certificar-se de que não há qualquer deterioração significativa do 
agente antifúngico, o que poderá se refletir nos resultados dos testes de sensibilidade, mediante uso de 
cepas de controle de qualidade ou cepas de referência, como as relacionadas na Tabela 4. 
 
2.4 Número de Concentrações Testadas 
 
As concentrações a serem testadas devem abranger as concentrações dos pontos de corte e as referentes 
aos resultados esperados para as cepas controle de qualidade. Com base em estudos anteriores, os 
seguintes intervalos de concentração das drogas são importante: anfotericina B – de 0,0313 a 16µg/mL; 
flucitosina – de 0,125 a 64µg/mL; cetoconazol – de 0,0313 a 16µg/mL; itraconazol – de 0,0313 a 
16µg/mL; fluconazol – de 0,125 a 64 µg/mL; e os novos triazólicos – de 0.0313 a 16 µg/mL. 
 
2.5 Seleção dos Agentes Antifúngicos para Testes de Rotina e Emissão de Relatórios 
 
Embora pontos de corte já estejam disponíveis para algumas combinações organismo-droga, testes de 
rotina não são recomendados. Em cada instituição, a decisão sobre realizar ou não, testes de sensibilidade 
a antifúngicos de rotina, deve ser tomada em conjunto com especialistas em doenças infecciosas, comitê 
de farmácia, pessoal de microbiologia clínica e comitê de controle de infecções. 
 
2.5.1 Nomes Genéricos 
 
Para minimizar erros, não se deve usar os nomes-comerciais dados pelos fabricantes (ex.,usar nome 
genérico) de todos os agentes antifúngicos. 
 
2.5.2 Número de Agentes Testados 
 
Para que os testes de sensibilidade de rotina sejam relevantes e práticos, o número de agentes antifúngicos 
testados deve ser limitado. Embora isso não seja uma questão premente no caso dos agentes antifúngicos, 
o mesmo princípio deve ser aplicado. 
 
2.5.3 Diretrizes para Emissão Seletiva de Relatórios 
 
É válido realizar testes em determinadas circunstâncias: (a) como parte de levantamentos periódicos de 
série de testes, com vistas a determinar o a estabelecimento de perfil de sensibilidade de coleções de 
isolados patogênicos, provenientes da própria instituição; (b) para auxiliar na determinação da terapia 
para infecções orofaríngeas refratárias causadas por Candida spp, em pacientes cuja terapia com 
antifúngicos e doses-padrão, parece ter fracassado; e (c) para auxiliar na determinação da terapia para 
infecções invasivas por Candida spp. se a utilidade dos agentes antifúngicos azólicos for indeterminada. 
Não há pontos de corte disponíveis para interpretar os resultados de testes de qualquer espécie de fungo 
filamentoso contra qualquer agente antifúngico e a relevância clínica dos testes, com qualquer 
combinação organismo-droga, permanece incerta (ex., quando a infecção é causada por um isolado não C. 
albicans). Só há pontos de corte disponíveis para Candida spp. contra fluconazol, itraconazol e 
flucitosina, sendo que, a relevância clínica dos testes para qualquer outra combinação organismo-droga 
permanece incerta. As amostras biológicas para obtenção das culturas e para outros testes devem ser 
obtidas antes de do início da terapia com antifúngicos. 
 
3 Metodologia dos Testes 
 
3.1 Meio líquido 
 
 
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3.1.1 Meio Sintético 
 
Recomenda-se um meio completamente sintético para os testes de sensibilidade. O meio sintético 
denominado RPMI-1640 (com glutamina, sem bicarbonato e com indicador vermelho de fenol) é 
considerado satisfatório, ou pelo menos tão adequado quanto vários outros meios sintéticos, tendo sido 
usado para desenvolver esta norma3,4 A fórmula desse meio é apresentada na Tabela 6 e sua preparação 
está delineada no Apêndice A. 
 
3.1.2 Solução-Tampão 
 
O meio deve ser tamponado a pH 7,0 ± 0,1, em temperatura de 25° C. Deve-se selecionar uma solução- 
tampão que não antagonize os agentes antifúngicos. A solução- tampão Tris não é satisfatória porque 
antagoniza a atividade da flucitosina. As soluções- tampão tipo Zwitterion são preferíveis ‘as que 
atravessam facilmente, a membrana celular, como os fosfatos porque, teoricamente, esses últimos podem 
produzir interações inesperadas com agentes antifúngicos. Uma solução-tampão considerada satisfatória 
nos testes de sensibilidade a antifúngicos é o MOPS [ácido 3-(N-morfolino) propanosulfônico] 
(concentração final de 0,165 mol/L, pH 7,0). O pH de cada lote de meio deve ser verificado com um 
medidor de pH imediatamente após sua preparação; o pH pode variar de 6,9 a 7,1 à temperatura ambiente 
(25° C). Os valores de CIM de cada lote de meio de cultura devem ser avaliados usando um painel de 
organismos de controle de qualidade (ver a Seção 4). 
 
3.2 Preparação de Diluições de Agentes Antifúngicos 
 
Os diferentes procedimentos de preparação e armazenamento de soluções de agentes antifúngicos são as 
seguintes. 
 
(1) Usar tubos de ensaio plásticos e estéreis, 12 x 75mm para preparar e realizar os testes. 
 
(2) Usar um poço para controle do crescimento contendo meio sintético RPMI-1640 sem agente 
antifúngico (mas, com solvente não aquoso, quando pertinente) para cada organismo testado. 
 
(3) Fechar os tubos com tampas de rosca de plástico ou metal. 
 
3.2.1 Agentes Antifúngicos Solúveis em Água 
 
Quando se precisa realizar diluição seriada em razão 2 dos agentes antifúngicos solúveis em água, estas 
podem ser preparadas volumetricamente em meio líquido (Tabela 2). O procedimento para os agentes 
antifúngicos não-solúveis em água é diferente do empregado para agentes solúveis em água e encontra-se 
descrito a seguir. Para fazer um número pequeno de testes, recomenda-se consultar a metodologia descrita 
na Tabela 3. 
 
O volume total de cada solução a ser preparada depende do número de testes a serem realizados. Visto 
que se usa 0,1mL de cada concentração da droga antifúngica para cada teste, 1,0mL de solução será 
suficiente para pipetar o necessário para nove testes. Utiliza-se apenas uma pipeta para os diluentes e, a 
seguir, acrescentar a solução-padrão do antifúngico ao primeiro tubo de ensaio. Emprega-se uma pipeta 
separada para cada diluição restante dessa série. Uma vez quea diluição das drogas será de 1:10 quando 
combinadas com o inóculo, as soluções de trabalho de agente antifúngico são 10X mais concentradas do 
que as concentrações finais. 
 
Muitas pessoas acreditam que trabalhar com diluições 1:10 (conforme indicado na Tabela 2) é fácil e 
conveniente. Entretanto, algumas pipetas automatizadas dispensam apenas volumes de 1,0 ou 0,1mL. 
Assim, a razão 1:11 seria preferível. Não é importante se o volume final do teste é 1,0mL ou 1,1mL. 
Quando se efetuam diluições 1:11, o esquema de diluição deve ser alterado de maneira a obter as mesmas 
concentrações finais da droga. 
 
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3.2.2 Agentes Antifúngicos Insolúveis em Água 
 
No caso dos agentes antifúngicos cujas soluções-padrão não podem ser preparadas em água, como 
cetoconazol, anfotericina B, itraconazol ou os novos azólicos, deve-se preparar uma série de diluições do 
agente em solvente apropriado, sendo a primeira 100X a concentração final (ver a Seção 2.3.1). A seguir, 
cada solução não aquosa deve ser diluída 10X em caldo RPMI-1640. 
 
Por exemplo, quando se deseja uma série de diluições com concentrações finais na faixa de 16µg/mL a 
0,0313µg/mL, prepara-se primeiro uma série de concentrações de 1.600 a 3,13µg/mL em DMSO (ver a 
Seção 2.3.1). Para preparar volumes de 1mL de agente antifúngico diluído (suficiente para dez testes), 
pipeta-se primeiro volumes de 0,9mL do meio RPMI-1640 em cada tubo de ensaio estéril, em total de 
onze. Com auxílio de uma única pipeta, acrescenta-se 0,1mL de DMSO puro a uma alíquota de 0,9mL de 
meio de cultura (controle de esterilidade do meio); a seguir, pipeta-se 0,1mL da menor concentração 
(3,13µg/mL) da droga diluída em DMSO, a o outro tubo com 0,9 mL de meio de cultura, seguindo com 
0,1mL da concentração 6,25µg/mL e assim sucessivamente, por toda a série de concentrações, 
acrescentado-se cada vez, 0,1mL da solução de antifúngico aos volumes de 0,9mL de meio. Esses 
volumes podem ser ajustados, se necessário, dependendo do número total de testes a serem realizados. 
Visto que haverá uma diluição 1:10 das drogas quando combinadas com o inóculo, as soluções de 
trabalho dos agentes antifúngicos são 10X mais concentradas do que as concentrações finais. 
 
3.3 Preparação do Inóculo 
 
As diferentes operações de preparação do inóculo são as seguintes. 
 
(1) Deve-se realizar a subcultura (repique) dos organismos, em tubos estéreis com ágar Sabouraud-
dextrose ou ágar batata-dextrose, executando passagens para assegurar sua pureza e viabilidade. A 
temperatura de incubação deve permanecer em 35° C. 
 
(2) O inóculo deve ser preparado escolhendo-se cinco colônias com diâmetro de ~1mm de cultura de 
24 horas para espécies de Candida ou cultura de 48 horas para C. neoformans. As colônias devem ser 
suspensas em 5mL de solução salina estéril 0,145 mol/L (8,5g/L NaCl; salina a 0,85%). 
 
(3) A suspensão resultante deve ser colocada em agitador de vórtex durante 15 segundos e a 
densidade celular, ajustada com espectrofotômetro, acrescentando-se solução salina suficiente para obter 
a transmitância equivalente de uma solução-padrão da escala de McFarland 0,5 (ver o Apêndice B), em 
comprimento de onda de 530nm. Esse procedimento fornece uma suspensão-padrão de levedura contendo 
1 x 106 a 5 x 106 células por mL. A suspensão de trabalho é produzida fazendo-se uma diluição 1:100 
seguida de uma diluição de 1:20 da suspensão-padrão com meio líquido RPMI 1640, resultando em 
concentração de 5,0 x 102 a 2,5 x 103 células por mL2. 
 
3.4 Inoculação do meio RPMI-1640 
 
Antes de ajustar o inóculo, coloca-se 0,1mL de cada uma das diferentes concentrações de agente 
antifúngico em tubos de ensaio 12 x 75mm. Para controle de crescimento coloca-se 0,1mL do diluente da 
droga, sem agente antifúngico. Dentro de 15 minutos após padronizar o inóculo (até duas horas, se o 
inóculo for mantido a 4o C), acrescenta-se e homogeneiza-se 0,9mL do inóculo ajustado, a cada tubo de 
ensaio da série de concentrações . Isso resulta em diluição 1:10 de cada concentração de antifúngico e 
uma diluição do inóculo em 10% . 
 
3.5 Incubação 
 
 
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Com exceção de C. neoformans, os tubos são incubados (sem agitação) a 35° C, durante período de 46 a 
50 horas, em ar ambiente. Nos testes com C. neoformans, os tubos devem ser incubados por período total 
de 70 a 74 horas, antes de se determinar os resultados. 
 
3.6 Leitura dos Resultados 
 
A quantidade de crescimento nos diferentes tubos contendo o agente antifúngico é comparada, 
visualmente, com a quantidade de crescimento no tubo controle de crescimento para cada levedura (sem 
agente) usado em cada série de testes, da seguinte maneira. 
 
3.6.1 Anfotericina B 
 
Para anfotericina B, os pontos finais da reação são, claramente, definidos, sendo fácil distinguir a CIM 
como a menor concentração de droga que impede qualquer grau de crescimento discernível. Em geral, 
não são vistos pontos finais da reação mal definidos. 
 
3.6.2 Antifúngicos Flucitosina e Azólicos 
 
Para flucitosina e especialmente para os azólicos, como fluconazol e cetoconazol, os pontos finais da 
reação são menos claramente, definidos do que os descritos para anfotericina B, o que pode constituir 
uma fonte substancial de variabilidade. O uso de pontos finais menos rigorosos (aceitando alguma 
turbidez acima da CIM) tem melhorado a concordância entre laboratórios, além de discriminar entre 
isolados, supostamente, sensíveis e isolados resistentes. Quando a turbidez persiste, acima da CIM, é 
freqüentemente, idêntica para todas as concentrações da droga. O grau de turbidez aceito pode ser 
estimado diluindo-se 0,2mL da suspensão do controle de crescimento, isento da droga, em 0,8mL do meio 
de cultura, produzindo um padrão de inibição de 80%.5,16 Mesmo a dispersão de grumos, que pode se 
tornar evidente após incubação, pode fazer com que a determinação do ponto final seja mais reprodutível. 
Além disso, deve-se usar cepas de referência com sensibilidade pré-definida para a capacitação do pessoal 
novato do laboratório. 
 
3.7 Interpretação dos Resultados 
 
Os pontos de corte (breakpoints) para interpretação dos resultados só foram estabelecidos para algumas 
combinações organismo-droga (ver o Apêndice C). A relevância clínica dos testes com outras 
combinações organismo-droga continua incerta, mas as informações mais relevantes podem ser resumidas 
conforme segue. 
 
3.7.1 Anfotericina B 
 
Até agora, a experiência usando os testes descritos nesta Norma indica que as CIMs da anfotericina B, 
para isolados de Candida spp., apresentam-se agrupados em pequeno intervalo entre 0,25 e 1.0µg/mL. 
Quando os isolados que parecem resistentes à anfotericina B em modelos animais são testados usando os 
métodos da Norma M27, é possível obter valores de CIM superiores a 1µg/mL. Infelizmente, a 
metodologia da Norma M27 não permite a detecção desses isolados de maneira consistente e tudo que se 
pode concluir, no presente momento, é que quando se obtém um valor de CIM de anfotericina B 
>1µg/mL para um isolado de Candida spp., é provável que o isolado seja resistente à anfotericina B. 
Pesquisas em andamento sugerem que testes com Antibiotic Medium 3 suplementado com glicose 
(dextrose) a 2% permitem maior confiabilidade na detecção dos isolados resistentes.17,18 Entretanto, a 
reprodutibilidade desse método ainda está sendo estudada19 e os laboratórios que decidirem realizar esses 
testes devem comparar, cuidadosamente, seus resultados com aqueles obtidos com isolados com resposta 
conhecida `a anfotericina B. Uma coleção de isolados de referência, com utilidade potencial foi 
depositada na American Type Culture Collection (ATCC®): C. lusitaniae ATCC® 200950; ATCC® 
200951, ATCC® 200952, ATCC® 200953, ATCC® 200954; C.albicans ATCC® 200955; e C. tropicalis 
ATCC® 200956. 
 
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3.7.2 Flucitosina 
 
Os pontos de corte para a interpretação dos resultados com Candida spp. e flucitosina foram estabelecidos 
com base, em grande parte, na farmacocinética da droga (ver o Apêndice C). 
 
3.7.3 Fluconazol 
 
Com base em grande acervo de dados do fabricante de fluconazol11 foram estabelecidos pontos de corte 
para a interpretação dos resultados com Candida spp. e fluconazol (ver o Apêndice C). Esses dados são 
provenientes, principalmente, de estudos com casos de candidíase orofaríngea e infecções invasivas por 
Candida spp., em pacientes não-neutropênicos, sendo incerta sua relevância clínica em outros contextos. 
Além disso, esses pontos de corte de interpretação não se aplicam à C. krusei e, portanto, é imprescindível 
identificar a espécie, antes de determinar a CIM. A utilidade dos testes com isolados de C. neoformans 
está sendo intensamente estudada e dados recentes sugerem correlação entre CIMs elevadas e fracasso 
clínico.20 
 
3.7.4 Cetoconazol 
 
Até agora, a experiência usando os testes descritos nesta Norma indicam que valores de CIM para 
leveduras variam de 0,03 a 16µg/mL. Entretanto, ainda não há dados indicando correlação entre CIM e 
resultados de tratamento com cetoconazol. 
 
3.7.5 Itraconazol 
 
Com base em grande quantidade de dados do fabricante de fluconazol11 foram estabelecidos pontos de 
corte para a interpretação dos resultados de testes com Candida spp. e itraconazol (ver o Apêndice C). 
Esses dados são provenientes, principalmente, de estudos de candidíase orofaríngea, sendo incerta sua 
relevância clínica em outros contextos. Além disso, é impossível ressaltar, de modo convincente a 
importância da preparação correta das diluições do itraconazol, dado que é um produto insolúvel. O uso 
de solventes incorretos ou desvios no esquema de diluições sugerido na Tabela 3 pode levar a erros 
substanciais, causados por artefatos de diluição. 
 
3.7.6 Novos Triazóis 
 
Até agora, a experiência com posaconazol, ravuconazol e voriconazol usando os testes descritos nesta 
Norma, indica que os valores de CIM para leveduras variam de 0,03 a 16µg/mL, sendo que, a maioria dos 
isolados é inibida a ≤1µg/mL de quaisquer dos três agentes. Entretanto, ainda não há dados indicando 
correlação entre CIM e resultados de tratamento com estes agentes. 
 
3.8 Modificações para Microdiluição 
 
Há volume substancial de dados publicados documentando excelente concordância entre os resultados 
obtidos com a metodologia de macrodiluição descrita anteriormente, e uma adaptação para microdiluição 
5,8-10,21-24. A facilidade de execução dos testes de microdiluição é muito interessante, sendo que a maioria 
dos laboratórios de patologia clínica, provavelmente, decidirá implementar este método ao invés do 
método de macrodiluição. Os passos e as condições de teste relevantes ao teste de microdiluição são aqui 
discutidos de maneira detalhada. 
 
As concentrações 10X da droga, descritas para o teste de macrodiluição, devem ser diluídas à 1:5 com 
RPMI para se conseguir concentração 2X necessária para o teste de microdiluição. As suspensões dos 
inóculos são preparadas e ajustadas conforme descrito para os testes de macrodiluição. A suspensão-
padrão de levedura é misturada durante 15 segundos em vórtex, diluída 1:50 e depois 1:20 com o meio de 
cultura, para se obter o inóculo 2X concentrado usado no teste (de 1 x 103 a 5 x 10 3 CFU/mL). O inóculo 
 
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(2X) será diluído a 1:1 quando os poços forem inoculados, chegando-se à concentração final desejada de 
inóculo (de 0,5 x 103 a 2,5 x 103 CFU/mL). 
 
O teste de microdiluição é realizado em placas de microdiluição estéreis, descartáveis, com múltiplos 
poços (96 poços em formato de U). As concentrações 2X da droga são dispensadas nos poços das fileiras 
1 a 10 das placas de microdiluição, em volumes de 100µL, com uma pipeta multicanal. A fileira 1 deverá 
conter a maior concentração da droga (64 ou 16µg/mL) e a fileira 10 a menor concentração da droga (0,12 
ou 0,03µg/mL). Essas placas podem ser cobertas com filme plástico, colocadas em sacos de plástico e 
armazenadas congeladas à temperatura -70° C, por até seis meses, sem deterioração da potência da droga. 
Cada poço da placa de microdiluição é inoculado, no dia do teste, com 100µL da correspondente 
suspensão 2X concentrada do inóculo, o que leva às diluições das drogas e à concentração do inóculo 
antes mencionados. Os poços controle de crescimento contêm 100µL de meio estéril, isento de droga, e 
são inoculados com 100µL das suspensões 2X concentradas dos inóculos. Os organismos de CQ são 
testados da mesma maneira e são incluídos toda vez que se testa um isolado. A fileira 12 da placa de 
microdiluição pode ser usada para efetuar o controle da esterilidade (apenas meio isento de drogas). 
 
As placas de microdiluição são incubadas a 35° C, observando presença ou ausência de crescimento 
visível. A agitação das placas pode simplificar a leitura dos pontos finais. Os poços de microdiluição 
recebem uma pontuação (escore) o crescimento em cada poço é comparado com o do poço controle do 
crescimento (isento de droga) com auxílio de um espelho de leitura;. A seguir, cada poço da placa de 
microdiluição recebe um valor numérico, usando a seguinte escala: 0 = opticamente claro; 1 = 
crescimento indefinido; 2 = redução proeminente de crescimento; 3 = ligeira redução do crescimento; e 4 
= nenhuma redução do crescimento. Quando a formação de grumos na suspensão prejudica a 
determinação da pontuação dos poços, deve-se tentar pipetar, agitar em vórtex ou outra técnica de 
homogeneização 24,25 . O valor de CIM de anfotericina B é definido como a menor concentração em que 
se observa o escore 0 (opticamente claro), sendo o CIM de 5-FC e de azóis definido como a menor 
concentração em que se observa o escore 2 (redução proeminente de crescimento). Uma diminuição 
proeminente de turbidez corresponde à, aproximadamente, 50% da inibição do crescimento, determinado 
em espectrofotômetro. Os resultados da microdiluição com leitura de CIM realizada em 48 horas (72 
horas, para a maioria dos isolados de C. neoformans) têm maior concordância com o método de referência 
por macrodiluição em caldo23, 24,26 
3.9 Impacto do Tempo de Leitura: 24 Horas versus 48 Horas 
 
A metodologia da Norma M27-A2 para Candida recomenda ponto final de leitura após 48 horas. Para a 
maioria dos isolados, a diferença entre leitura após 24 horas e após 48 horas é mínima e não altera a 
categoria de interpretação (i.e., não muda a classificação do isolado como “sensível" ou “resistente”). 
Entretanto, pesquisa recente indicou inclusão de leituras após 24 horas porque: (a) é possível, com 
freqüência, ler CIM após 24 horas e (b) leituras após 24 horas podem ser mais relevantes, do ponto de 
vista clínico, no caso de alguns isolados. Os isolados cuja leitura precoce é importante são os que 
apresentam aumento dramático de CIM, das 24 horas para as 48 horas, devido ao crescimento indefinido 
(denominado trailing) e significativo (inibição parcial do crescimento, ao longo de um amplo intervalo de 
concentrações do antifúngico). Com ocorrência estimada em, aproximadamente, 5% dos isolados27 esse 
crescimento indefinido pode ser suficiente para fazer com que um isolado que parecia sensível às 24 
horas, se torne completamente resistente após 48 horas. Duas pesquisas in vivo sobre esse fenômeno e 
independentes entre si, empregando candidíase murina disseminada como modelo27,28, demonstraram que 
os isolados com esse tipo de comportamento devem ser classificados como “sensíveis”, ao invés de 
“resistentes”. Esse conceito foi corroborado pela demonstração de que o crescimento indefinido pode ser 
eliminado