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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROS Audrey Handyara Bicalho Desenvolvimento e avaliação de um suplemento alimentar de baixo custo para idosos: impacto sobre a desnutrição Montes Claros 2019 Audrey Handyara Bicalho Desenvolvimento e avaliação de um suplemento alimentar de baixo custo para idosos: impacto sobre a desnutrição Montes Claros 2019 Exame de Defesa (Doutorado). Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências em Saúde da Universidade Estadual de Montes Claros-Unimontes, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde. Área de Concentração: Mecanismos e Aspectos Clínicos das doenças Orientador: Prof. Dr. Sérgio Henrique Sousa Santos B583d Bicalho, Audrey Handyara. Desenvolvimento e avaliação de um suplemento alimentar de baixo custo para idosos [manuscrito]: impacto sobre a desnutrição / Audrey Handyara Bicalho. – 2019. 120 f.: il. Inclui Bibliografia. Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Montes Claros - UNIMONTES, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde /PPGCS, 2019. Orientador: Prof. Dr. Sérgio Henrique Sousa Santos. 1. Idoso - Nutrição. 2. Suplementos dietéticos. 3. Alimentos - Composição. I. Santos, Sérgio Henrique Sousa. II. Universidade Estadual de Montes Claros. III. Título. IV. Título: Impacto sobre a desnutrição. Catalogação Biblioteca Central Professor Antônio Jorge UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROS-UNIMONTES Reitor: Antônio Alvimar Souza Vice-reitora: Ilva Ruas de Abreu Pró-reitor de Pesquisa: Prof. José Reinaldo Mendes Ruas Coordenadoria de Acompanhamento de Projetos: Karen Correa T. Lafetá de Almeida Coordenadoria de Iniciação Científica: Leonardo Monteiro Ribeiro Coordenadoria de Inovação Tecnológica: Dario Alves de Oliveira Pró-reitor de Pós-graduação: André Luiz Sena Guimarães Coordenadoria de Pós-graduação Lato-sensu: Iuri Simões Mota Coordenadoria de Pós-graduação Stricto-sensu: Maria de Fátima Rocha Maia PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE Coordenador: Prof. Dr. Alfredo Maurício Batista de Paula Subcoordenador: Prof. Dra. Marise Fagundes da Silveira Dedico esse trabalho à memória dos meus pais, Joana Ilca Dias Bicalho e Gonçalo Bicalho. Com amor, gratidão e saudade. “Quando a primavera chegar, algo novo irá acontecer. Todas as flores do mundo, eu vou mandar para você. Quem sabe o mundo muda de cor e amor será mais amor. Quando a primavera chegar, os pássaros me farão um favor, de levar flores perfumadas e entregá-las a você, meu amor. Você verá...” Joana Ilca Dias Bicalho Disponível em https://www.youtube.com/watch?v=jfaMKsKXetQ https://www.youtube.com/watch?v=jfaMKsKXetQ AGRADECIMENTOS A Deus, fonte de amor, força e inspiração. Aos meus pais (in memorian) Joana Ilca Dias Bicalho e Gonçalo Bicalho. Os recados de amor que vocês deixaram estão gravados na minha mente e no meu coração. Continuam a orientar e alegrar a minha vida. Muito obrigada. Aos meus irmãos, Ariane, Valfrido e Jansen, com todo afeto. Ao meu marido, Lipa Xavier. Pelo seu doce e generoso amor. ―Tudo fica mais bonito quando você está por perto‖. (Moreno Veloso) Ao meu orientador, professor Sérgio Henrique, todo o meu respeito, gratidão e admiração. ―Uma boa cabeça e um bom coração formam sempre uma combinação formidável‖. (Nelson Mandela) Aos meus amigos Danielle e Fabio, pela dedicação e apoio incondicional para a realização deste trabalho. ―Amizade só faz sentido se traz o céu para mais perto da gente, e se inaugura aqui mesmo o seu começo‖. (Chico Xavier) Aos componentes da banca examinadora, professores, Alfredo Maurício Batista de Paula, João Marcus Oliveira Andrade, Lucinéia Pinho, André Luiz Sena Guimarães, Wanderson Geraldo de Lima, Marcelo Perim Baldo e Caroline Liboreiro Paiva por aceitarem o convite e pelas valiosas contribuições. Aos amigos do laboratório de pesquisa em saúde e colegas do PPGCS-Unimontes, Fabio, Danielle, Magda, Emisael, Victor, Amanda, Dani, Jaci, Bere, Deborah, Eri, Felipe, Luis, Keila, Thaísa Crespo, Luciana Colares, Janaina, Marcela, Sabrina, Rogério, Eloá, Alana, Bárbara, Natália, Thiago, Amanda Rodrigues, Andréia, Jamille, Gislaine, Mari, Sara, Tati, Maria Paula, João Lucas, Lilian, Bruna e Carla (UFMG) pela atenção, amizade e pelos valiosos momentos de convivência. ―Conheça todas as teorias, domine todas as técnicas, mas ao tocar uma alma humana, seja apenas outra alma humana‖. (Carl Jung) Aos professores e funcionárias da secretaria do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, pelo apoio e atenção. Em especial aos professores Alfredo, André, Lucyana, Cristina Sampaio e Antônio Alvimar e as funcionárias Do Carmo e Tereza. Aos queridos amigos que a vida me presenteou: Margarete, Joana, Telma, Tânia, Dona Araci, Silvania, Hérika, Ludmila, Mirna, Dete, Nicinha, Valéria, Mara Denise, Gal, Lica, Noca, Déia, Marcos (Brejeiros), Lucinha (Salinas), Amanda, Cleis, Renatinha, Alana, Maria Thereza, Neiva, Rodrigo, Samuel, (IFNMG), Marluce e Patrícia (UFBA), Carol e André. Com vocês divido a alegria pela conclusão deste trabalho. Com palavras, gestos e boas energias vocês contribuíram para a concretização deste sonho. Às minhas tias Boneca, Geralda, Cristina e tio João, com gratidão. Às idosas que participaram do estudo e às funcionárias da instutição onde foi realizada a pesquisa. Em especial a enfermeira Rafaela pelo valioso apoio e confiança. À direção, amigos e colegas do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Norte de Minas Gerais (IFNMG). O IFNMG foi criado em 29 de dezembro de 2008, pela Lei nº 11.892, no governo do presidente Luiz Inácio Lula da Silva. Obrigada, querido presidente! ―Os poderosos podem matar uma, duas ou três rosas, mas jamais conseguirão deter a primavera inteira‖. (Che Guevara) ―Relativo é o tempo, abstrata certeza que neste momento me vem. Que distância, afinal, pode haver entre o minuto e o infinito? [...] São pequenas as palavras. E como são capazes de tão pouco dizer! Eu as ouvi assim, de um incomum modo de ouvir. No entanto eu as ouvi, tenho certeza! [...] Foi outro sentido de mim que as captou. Não havia mais dor a ser doída. ―Vai dormir menino! Seu pai já vem...!” Trecho de ―Os olhos tristes de Ulisses”, de Lipa Xavier. RESUMO O envelhecimento da população brasileira acompanha uma tendência mundial de acelerado crescimento, e essa mudança demográfica exige uma intervenção multissetorial para promover uma vida saudável e ativa. Distúrbios nutricionais, como a desnutrição e a deficiência de micronutrientes, constituem um problema comum nessa fase da vida. Nessa perspectiva, a proposta foi desenvolver um suplemento de baixo custo utilizando subprodutos da indústria de laticínios e fruto do Cerrado testando em modelos animais e pessoas idosas. O objetivo foi avaliar o impacto desse novo suplemento na recuperação do estado nutricional, no perfil metabólico e na recuperação hepática de animais experimentalmente desnutridos e na recuperação do estado nutricional de idosas desnutridas institucionalizadas, comparado com um suplemento comercial. Para isso, na fase pré-clínica, 48 camundongos SWISS, após o período de adaptação, foram submetidos a duas fases de tratamento: restrição alimentar, para instalar a desnutrição e fase de renutrição, para avaliar a suplementação alimentar. Foram divididos em seis grupos: Controle, Suplemento Comercial Isocalóricaao Controle, Suplemento Teste Isocalórica ao Controle, Desnutrido, Suplemento Comercial Isocalórica ao Desnutrido e Suplemento Teste Isocalórica ao Desnutrido. Durante todo o experimento foram avaliados o peso corporal e a ingestão alimentar. Ao fim, testes de tolerância à glicose e sensibilidade insulínica foram realizados para avaliar o metabolismo da glicose. Os animais foram sacrificados por decapitação e amostras de sangue foram coletadas para avaliação bioquímica. O fígado foi retirado, pesado e utilizado para mensuração de marcadores da inflamação e para análises histológicas. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa Experimental da Universidade Estadual de Montes Claros. A fase clínica foi realizada com 25 idosas com idade ≥ a 65 anos diagnosticadas com desnutrição ou risco de desnutrição pela Mini Avaliação Nutricional. Elas foram divididas em grupo controle, que recebeu o suplemento comercial e grupo teste, que recebeu o novo suplemento durante 90 dias. Os resultados foram agrupados em dois artigos. No primeiro artigo foram mostrados efeitos favoráveis relacionados ao suplemento teste, de baixo custo, em todos os parâmetros antropométricos avaliados e também no escore final da Mini Avaliação Nutricional das idosas. Houve também aumento dos níveis séricos de albumina e aumento significativo do número de hemácias e hemoglobina, e melhora no perfil lipídico nas fases pré-clínica e clínica. Efeitos favoráveis ao novo suplemento também foram observado no grupo de animais Suplemento Teste Isocalórica ao Desnutrido. Houve ganho de peso, aumento dos níveis séricos de albumina e diminuição dos triglicerídeos. Nesse primeiro artigo, demonstramos os benefícios das intervenções nutricionais e certificamos que o suplemento alimentar desenvolvido apresentou melhores resultados na recuperação do estado nutricional de idosas desnutridas e dos animais. No segundo artigo, os principais achados mostraram que a desnutrição induziu danos hepáticos, traduzidos na diminuição do peso desse órgão, no aumento dos infiltrados inflamatórios, na deposição de colágeno e no aumento da expressão de RNAm de enzimas antioxidantes. A renutrição com o novo suplemento se mostrou apto na recuperação do dano hepático produzido pela desnutrição em modelo animal, tanto quanto, ou melhor, que o suplemento comercial referência no mercado. Palavras-chave: Desnutrição. Idosos. Suplemento alimentar. ABSTRACT The aging of the Brazilian population follows a worldwide trend of rapid increase and this demographic change requires a multisectoral intervention in order to promote a healthy and active life. Nutritional disorders such as malnutrition and micronutrient deficiency are a common problem at this stage of life. From this perspective, the proposal was to develop a low-cost supplement using by-products from the dairy industry and a Cerrado fruit and test it on animal models and elderly people. This study aimed to evaluate and compare the effect of this new supplement and a commercial one on the recovery of nutritional status, metabolic profile, and liver recovery of experimentally malnourished animals and on the recovery of nutritional status of institutionalized malnourished elderly women. Therefore, in the preclinical phase, 48 SWISS mice, after the adaptation period, were submitted to two treatment phases: food restriction, to install malnutrition; and renutrition phase, to evaluate food supplementation. The animals were divided into six groups: Control, Commercial Supplement Isocaloric to Control, Test Supplement Isocaloric to Control, Malnourished, Commercial Supplement Isocaloric to Malnourished and Test Supplement Isocaloric to Malnourished. Throughout the experiment, body weight and food intake were evaluated. Finally, glucose tolerance and insulin sensitivity tests were performed to evaluate glucose metabolism. The animals were sacrificed by decapitation and blood samples were collected for biochemical evaluation. The liver was removed, weighed, and used for inflammation markers and histological analyses. This study was approved by the Ethics and Experimental Research Committee of The Montes Claros State University. The clinical phase was performed with 25 elderly women aged ≥ 65 years diagnosed with malnutrition or risk of malnutrition by the Mini Nutritional Assessment. They were divided into a control group that received the commercial supplement and a test group that received the new supplement. Both groups were fed its respective supplement diet for 90 days. The results were grouped into two articles. The first article reported favorable effects related to the low-cost test supplement, indicated by all anthropometric parameters evaluated and the final score of the Mini Nutritional Assessment of the elderly. Moreover, we observed increase in serum albumin levels and a significant increase in the number of red blood cells and hemoglobin, and an improvement in the lipid profile in the preclinical and clinical phases. Favorable effects on the new supplement were also observed in the Isocaloric Malnourished Test Supplement group of animals. Weight gain, increased serum albumin levels and decreased triglycerides were observed. In this first article, we demonstrate the benefits of nutritional interventions and certify that the developed dietary supplement presented better results in the recovery of the nutritional status of malnourished elderly women and animals. In the second article, we found that malnutrition induced liver damage, resulting in decreased body weight, increased inflammatory infiltrates, collagen deposition, and increased mRNA expression of antioxidant enzymes. The new supplement proved to recover liver damage caused by malnutrition in animal models, presenting similar or superior results in comparison to the commercial reference supplement in the market. Keywords: Malnutrition. Seniors.Food supplement. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 – Representação gráfica dos componentes e mecanismos fisiológicos principais envolvidos na diminuição do consumo de alimentos na população idosa. 21 Figura 2 - Representação gráfica dos fatores relacionados à desnutrição em idosos e suas repercussões físicas, bioquímicas e celulares. 23 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Anvisa - Agência Nacional de Vigilância Sanitária CA - Circunferência do Braço CC -Circunferência da Panturrilha CMC - Circinferência Muscular do Braço CCK - Colecistoquinina CRF -corticotropina hipotalâmica DRIs - DietaryReferenceIntakes GGT - Teste de Tolerância à Glicose IL-1- Interleucina -1 IL-6 - Interleucina -6 IMC - Índice de Massa Corporal IST- Teste de Sensibilidade à Insulina MNA - Mini Avaliação Nutricional PYY - Peptídeo tirosina tirosina qRT-PCR - Reação em Cadeia da Polimerase -Real Time quantitativo TNF-α - Fator de Necrose Tumoral SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 17 1.1 Envelhecimento e desnutrição........................................................................... 17 1.2 A importância de modelos animais no estudo da desnutrição........................ 18 1.3 Fatores de risco para a desnutrição na população idosa............................... 19 1.4 Detecção da desnutrição em idosos.................................................................... 23 1.5Suplementos alimentares e desnutrição em idosos............................................ 27 2 OBJETIVOS ........................................................................................................ 30 2.1 Objetivo Geral ...................................................................................................30 2.2 Objetivos Específicos ........................................................................................ 30 3. METODOLOGIA ...................................................................................... 31 4 PRODUTOS ........................................................................................................ 35 4.1 Artigo 1: Development and evaluation of a low cost food supplement to combat malnutrition: a translational study in malnourished mice and institutionalized elders 36 4.2 Artigo 2: Liver damage produced by malnutrition is improved by dietary supplementation in mice: assessment of a low-cost supplement based on buriti (a Cerrado fruit) and dairy by-products 59 5 CONCLUSÃO...................................................................................................... 77 REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 78 ANEXOS ............................................................................................................... 82 17 1 INTRODUÇÃO 1.1 Envelhecimento e desnutrição A população mundial está envelhecendo rapidamente, e as estimativas para as primeiras cinco décadas do século 21 são de que a proporção de pessoas com mais de 60 anos dobrará de 11% para 22%(1). No Brasil, a quinta nação mais populosa do mundo, com mais de 200 milhões de habitantes, a população também envelhece em ritmo acelerado(2). O número de pessoas com idade ≥ 60 anos aumentou de 3 milhões em 1960, para 14 milhões em 2002, um aumento de 500% em 40 anos(3). Mantendo essa tendência de envelhecimento, a população brasileira com idade ≥ a 60 anos, no ano de 2017, já soma 30,2 milhões, o que corresponde a 14,55 % do total de pessoas, aumento esse de 4,8 milhões de idosos em relação ao levantamento de 2012, que foi de 25,4 milhões(4). Atingir a velhice, que já foi privilégio de poucos, hoje é padrão até mesmo nos países com populações de baixa e média renda(3). Essa mudança demográfica representa um novo desafio para a sociedade e exige uma intervenção multissetorial para promover uma vida longa, saudável e ativa(5).O envelhecimento, apesar de ser um processo natural, submete o organismo a diversas alterações anatômicas e funcionais, com repercussões nas condições de saúde e nutrição do idoso(6). Assim, a longevidade não está necessariamente associada a um envelhecimento saudável. Distúrbios nutricionais, como a desnutrição e a deficiência de micronutrientes, constituem um problema comum no envelhecimento. Embora muitos idosos permaneçam saudáveis e se alimentem bem, outros podem ter dificuldades em atender às suas necessidades nutricionais(7, 8). Portanto, a desnutrição é um problema comum e crescente nesse grupo etário, visto muitas vezes erroneamente, como sendo parte do processo natural do envelhecimento(1, 9, 10). A desnutrição pode ser definida como um estado nutricional no qual há uma deficiência ou desequilíbrio de energia, proteínas e outros nutrientes, com efeitos adversos mensuráveis na composição corporal, na função muscular, cognitiva, imune e no resultado clínico. Pode ocorrer tanto por um fator primário, resultante de uma ingestão insuficiente de alimentos, como por problemas secundários, resultantes de doenças e outras ocorrências(11). Essa condição tem um impacto negativo na saúde dos idosos, e está associada à cicatrização deficiente, metabolismo alterado de fármacos, maior risco de internação hospitalar prolongada e retardo na recuperação cirúrgica. Infelizmente, a desnutrição é frequente em idosos, sendo 18 um dos principais determinantes de morbidade, mortalidade, incapacidade e custos de saúde nessa população em crescimento(12, 13). Muitos estudos sobre a epidemiologia, fisiopatologia, bem como intervenções para prevenir ou tratar a desnutrição protéico-energética e a deficiências de micronutrientes em populações humanas foram realizados e estão descritos na literatura(14-16). Estudos relevantes com populações humanas em diferentes cenários continuam a ser realizados, uma vez que desnutrição permanece como um dos principais desafios da saúde pública, principalmente nos países em desenvolvimento (14). Entretanto, modelos experimentais, com animais de laboratório, têm sido cada vez mais utilizados para avaliar os efeitos da desnutrição em uma série de alterações metabólicas que levam à redução do peso corporal, diminuição da imunocompetência, alterações das funções do aparelho digestivo, suscetibilidade a infecções, entre outras(17-20). 1.2 A importância de modelos animais no estudo da desnutrição A grande vantagem do uso de modelos animais é permitir uma avaliação altamente controlada de cada parâmetro nutricional, considerando que isso não é possível no caso de populações humanas(18). Sendo assim, a desnutrição experimental tornou-se uma área importante para o melhor entendimento da fisiopatologia da desnutrição. Dentre os estudos disponíveis com modelos para indução à desnutrição, pode-se citar os que utilizam dietas aproteicas(21), hipoproteicas(22-25), hipocalóricas isoladas(26) ou em combinação com dietas com diferentes quantidades de proteinas(27). Há uma grande diversidade de protocolos para indução da desnutrição na literatura. Do mesmo modo, diferentes protocolos de restrição calórica são adotados, podendo gerar dúvidas em relação ao seu propósito. A restrição calórica sem desnutrição é uma intervenção que aumenta o tempo de vida dos animais de laboratório e é amplamente estudada para descobrir fatores que limitam a longevidade(28). De acordo com Cerqueira e Kowaltowski (2011), há evidências de que o protocolo de restrição calórica mais comumente adotado, uma restrição de 40% da dieta AIN-93 sem suplementação vitamínica ou mineral, leva à desnutrição em camundongos e ratos. Assim esses autores propõem que os termos ―restrição calórica‖ sejam usados para se referir a dietas com calorias totais limitadas, com suplementação vitamínica e mineral, e sugerem que dietas com restrição de ração não suplementada sejam denominadas restrição alimentar(28). Nesse sentido, a desnutrição induzida por restrição alimentar produz uma série de alterações que, além de reduzir o peso corporal, provoca inflamação sistêmica(29),alteração 19 no equilíbrio metabólico normal entre a síntese e a degradação de proteínas(20) e diferentes modificações no sistema gastrointestinal e órgãos anexos(19). Em nível molecular, alterações são encontradas no fígado e em outros órgãos em relação à expressão de vários genes envolvidos em diversas vias metabólicas e na regulação de outros genes. (20). Não há um modelo único de indução da desnutrição ou uma metodologia padrão descritos na literatura(17, 20, 21, 25, 26). Nesse sentido, há recomendações das principais características de um modelo de desnutrição, que devem incluir na metodologia a descrição detalhada do modelo animal utilizado, o tipo de dieta adotada, níveis de restrição e como estes foram calculados, a idade em que a dieta foi introduzida, período de tempo em que os animais foram mantidos na dieta, suplementos incluídos, condições de alojamento e métodos de alimentação(18, 28). Assim, estudos que tratam desse tema constituem-se numa preocupante questão da atualidade e continuam a ser prioridade, sendo de grande interesse para a comunidade científica e para toda a sociedade. 1.3 Fatores de risco para a desnutrição na população idosa A desnutrição no idoso tem causas multifatoriais, mas a diminuição da ingestão alimentar relacionada à idade representa um dos principais fatores de risco. Essa condição tem sido referida como anorexia do envelhecimento. Evidências indicam que a diminuição do consumo de alimentos é em grande parte fisiológica, mas outros fatores estão fortemente relacionados. Questões sociais, psicológicas,patológicas podem estar presentes durante o processo de envelhecimento e também são causas reconhecidas de redução da ingestão de alimentos e da desnutrição(13, 30). Do ponto de vista fisiológico, todos os órgãos e processos do organismo humano são afetados pelo envelhecimento, e essas mudanças podem afetar a ingestão alimentar do idoso e promover a desnutrição. A compreensão desses fatores constitui base essencial para prevenir ou reverter os índices de desnutrição na população idosa. Assim, dentre as principais mudanças fisiológicas que interferem no estado nutricional do idoso, pode-se citar diminuições da percepção sensorial, redução da salivação, deterioração da saúde oral, alterações hormonais, entre outras (8, 12, 30). Uma redução da percepção alimentar olfativa, gustativa ou visual, por exemplo, está associada à redução do interesse pelos alimentos e a uma menor diversidade na composição da refeição, o que pode resultar em deficiências nutricionais(7). Já a diminuição do fluxo salivar pode promover cáries e infecções na boca, 20 que uma vez não tratadas são as principais causas de ausência de dentes e de uso de próteses totais na população idosa. Perdas dentárias e próteses mal adaptadas podem causar dor, ulceração, problemas na mastigação e deglutição, que são causas significativas da redução da ingestão de alimentos(8, 13). No que diz respeito às alterações na secreção de hormônios e de neuropeptídios relacionados à anorexia do envelhecimento, mecanismos complexos estão envolvidos na deterioração de atividades específicas em certas áreas do cérebro, como o hipotálamo, em resposta a estímulos periféricos (hormônios circulantes, adipocinas, nutrientes, etc.)(12, 31). Estudos mostram, por exemplo, que alta atividade da colecistoquinina (CCK) em pessoas idosas pode contribuir para retardar o esvaziamento gástrico, um efeito associado à saciedade pós-prandial prolongada e menor ingestão de alimentos. Indivíduos mais velhos têm mais células imunorreativas à CCK no duodeno e concentrações aumentadas de CCK circulante do que adultos jovens(12, 13, 31). Em analogia com a CCK, níveis pós-prandiais anormalmente elevados de peptídeo tirosina tirosina (PYY) podem inibir a busca por uma segunda refeição, levando a intervalos mais longos de jejum, causando redução da ingestão de alimentos e desnutrição em pessoas idosas. Tanto o CCK quanto o PYY são peptídeos entéricos envolvidos na motilidade gastrointestinal em resposta à alimentação. Eles fornecem um potente sinal anorexígeno ao hipotálamo e estudos demonstram um aumento nas concentrações séricas do PYY em idosos, na fase pós-prandial tardia, em relação a controles jovens. Consequentemente, as ações combinadas de CCK e PYY transmitem sinais anorexigênicos importantes para o hipotálamo (12, 13, 32). A insulina, o conhecido regulador do metabolismo da glicose, também é um hormônio com possível atuação na anorexia nos idosos(32). Concentrações aumentadas de insulina em jejum e pós-prandiais, e a reduzida tolerância à glicose, que acontecem no decorrer do envelhecimento, podem causar também diminuição da ingestão de alimentos. Concentrações mais altas de insulina plasmática podem amplificar o sinal anorexígeno da leptina, e a hiperinsulinemia em idosos também pode ser responsável por inibir a expressão gástrica da grelina. A leptina, uma proteína produzida principalmente pelo tecido adiposo, e a grelina, um hormônio produzido pelo estômago, são responsáveis pelo controle da ingestão alimentar e sua ação no sistema nervoso central (hipotálamo), em mamíferos, tem efeitos antagônicos. A leptina promove a redução da ingestão alimentar e o aumento do gasto energético e a grelina, um hormônio orexígeno, está relacionado ao aumento do apetite(7, 30). A combinação dessas alterações hormonais pode ser uma causa importante da anorexia do envelhecimento. 21 Grande parte da diminuição da energia relacionada à idade é provavelmente em resposta ao declínio no gasto de energia que também acompanha o envelhecimento normal. Em muitos indivíduos, no entanto, a diminuição na ingestão de energia é maior do que a diminuição no gasto de energia, de modo que o peso corporal é perdido. A perda de peso em pessoas idosas está associada a resultados adversos, particularmente se não intencionais, e se o peso corporal inicial é baixo. Quando os idosos perdem peso, o tecido magro é o mais afetado, principalmente o músculo esquelético. Quando essa perda é excessiva resulta em sarcopenia, que está associada ao maior risco de quedas, fraturas, incapacidade e dependência(12, 31). Todos esses fatores fisiológicos, independente ou coletivamente, podem levar a uma redução na ingestão de alimentos com o envelhecimento, com suas consequências potencialmente graves. Diante do contexto apresentado, a figura 1 esquematiza de maneira sucinta os componentes e mecanismos fisiológicos principais envolvidos na diminuição do consumo de alimentos na população idosa. 22 Figura 1 – Representação gráfica dos componentes e mecanismos fisiológicos principais envolvidos na diminuição do consumo de alimentos na população idosa que podem contribuir para a desnutrição. A desnutrição por sua vez pode interferir com o consumo de alimentos. Além dos condicionantes fisiológicos específicos do próprio envelhecimento, outros fatores podem afetar o estado nutricional dessa população, tais como o isolamento social, alterações psicológicas, doenças crônicas, polifarmácia, perda da capacidade funcional e uma série de outras situações que afetam o consumo e o aproveitamento de alimentos e líquidos pelo organismo(33, 34). O envelhecimento é acompanhado por uma maior probabilidade de sofrer de uma ou mais doenças crônicas, como doenças respiratórias, acidente vascular cerebral, depressão e demência. Essas condições podem afetar o apetite, a capacidade funcional ou a capacidade de deglutição, levando à ingestão alimentar alterada e ao comprometimento do estado nutricional(8). Mesmo que o indivíduo envelheça sem ser acometido por doenças crônicas, a inflamação crônica de baixo grau pode estar presente, uma característica do processo de envelhecimento. Nesse sentido, níveis circulantes de interleucina (IL)1, IL6 e fator de necrose tumoral (TNF-α) são tipicamente mais altos em idosos. Tais citocinas reduzem a ingestão de alimentos e, consequentemente, o peso corporal, contribuindo para o esvaziamento gástrico retardado ou estimulando diretamente a expressão de mRNA da leptina e também dos seus níveis circulantes que interferem com o consumo de alimentos. Além de seus efeitos diretos sobre a leptina, as citocinas pró-inflamatórias também estimulam a produção do fator de liberação da corticotropina hipotalâmica (CRF), um mediador do efeito anorexígeno da leptina(13) Entre os fatores que contribuem para a perda de peso na população, depressão e o isolamento têm papel principal, especialmente naqueles que vivem em instituições de longa permanência. Nesse caso, não somente os fatores relacionados ao envelhecimento irão influenciar o estado de nutrição do idoso, mas o próprio ambiente asilar representa importante fator de risco(33). Comumente, o insucesso de uma instituição de longa permanência em prestar atenção às preferências alimentares dos residentes e estimular adequadamente um ambiente favorável para alimentação são fatores importantes relacionados à perda de apetite e à redução da ingestão de alimentos entre idosos(13) Outro importante contribuinte para a diminuição da ingestão de alimentos na população idosa é a maior incidência de polifarmácia. Muitos medicamentos têm efeitos colaterais que podem afetar o paladar, a salivação, promover efeitos como náuseas e vômitos, 23 esvaziamento gástrico demorado, anorexia, diarreia e má absorção. Todos esses fatores, independentemente ou coletivamente, podem levar a uma reduçãona ingestão de alimentos, contribuindo para aumentar o risco de desnutrição. Uma compreensão dessas causas é essencial para formular estratégias de tratamento apropriadas(13, 35). Um resumo dos diferentes fatores associados à desnutrição em idosos e suas repercussões físicas, bioquímicas e celulares(7, 8, 29, 33, 36) estão representados na figura 2. Figura 2– Representação gráfica dos fatores relacionados à desnutrição em idosos e suas repercussões físicas, bioquímicas e celulares. O envelhecimento é acompanhado por muitas mudanças fisiológicas, psicossociais, funcionais que podem repercutir no estado nutricional. Condições patológicas, como a depressão, a demência e o AVC podem afetar o apetite, a capacidade funcional ou a capacidade de engolir, levando à ingestão alimentar alterada e ao comprometimento do estado nutricional. Todos esses fatores isolados ou combinados constituem risco para o desenvolvimento da desnutrição. 1.4 Detecção da desnutrição em idosos A prevalência da desnutrição ocupa posições de destaque nos levantamentos realizados em todo o mundo. Dados disponíveis na literatura demonstram que a desnutrição 24 está presente em até 15% dos idosos não institucionalizados, entre 23% a 62% dos idosos hospitalizados e em até 85% dos idosos institucionalizados(7). A falta de diagnóstico precoce da desnutrição em idosos pode se refletir na deterioração da saúde e aumento do risco de mortalidade(37). Sendo assim, a detecção do risco da desnutrição ou da desnutrição é importante para permitir intervenção nutricional mais rápida e direcionada(38). A avaliação do estado nutricional objetiva identificar os distúrbios nutricionais, e um parâmetro isolado não caracteriza a condição nutricional do indivíduo. Nessa perspectiva, tanto métodos objetivos como subjetivos podem ser usados para avaliar o estado nutricional. Dentre os métodos objetivos, podemos citar a antropometria, a composição corpórea, parâmetros bioquímicos e consumo alimentar. Exame físico e questionários de triagem nutricional compõem os métodos subjetivos(39). Estudos antropométricos comumente utilizam os parâmetros de índice de massa corporal (IMC), circunferências do braço (CA) e da panturrilha (CC), circunferência e área muscular do braço (AMC e AMA), nos quais os valores são avaliados conforme padrões de referência internacional(37). Dentre as várias ferramentas disponíveis para a avaliação do estado nutricional de idosos, sejam em estudos clínicos ou em estudos populacionais, as medidas antropométricas apresentam-se como as mais utilizadas, tendo como destaque o emprego do índice de massa corporal (IMC). Apesar das limitações no sentido de não predizer a distribuição da gordura corporal e de não diferenciar massa magra de massa gorda, este é bastante utilizado pelo fato de produzir informações básicas das variações físicas dos indivíduos(40). O IMC é um índice simples em que o peso em quilogramas é dividido pelo quadrado da altura em metros (kg/m 2 ). Segundo critérios da OMS(41), indivíduos adultos e idosos são classificados como abaixo do peso (IMC <18,5 kg/m2), peso normal (18,5 a 24,9 kg/m 2 ), excesso de peso (25 a 29,9 kg/m 2 ) ou obesidade (≥30 kg/m 2 ). Também tem sido utilizada a classificação proposta por Lipschitz(42), que considera as mudanças corporais do indivíduo idoso, sendo os pontos de corte para o baixo-peso e sobrepeso, 22 kg/m² e 27 kg/m², respectivamente. O uso de pontos de corte mais altos para idosos se deve à maior suscetibilidade a doenças que esse grupo apresenta, necessitando, assim, de maior reserva de tecidos, que protege contra a desnutrição. Pesquisas sugerem que um IMC moderadamente maior é protetor contra a mortalidade(1). À medida que se torna necessário avaliar de forma mais completa a composição corporal, dados antropométricos adicionais devem ser obtidos. As circunferências são afetadas pela massa gorda, massa muscular e tamanho ósseo. É possível medir uma grande variedade de circunferências corporais(39). A circunferência do braço (CB) é muito utilizada, 25 e representa a soma das áreas constituídas pelos tecidos ósseo, muscular e gorduroso do braço. A sua combinação com a medida da prega cutânea do tríceps (PCT) permite, através da aplicação de equação, calcular a circunferência muscular do braço (CMB), parâmetro que representa a reserva de tecido muscular(43). Com o processo de envelhecimento, a composição corpórea do indivíduo idoso se altera, com aumento na quantidade de tecido adiposo com mudanças na sua redistribuição corporal e redução do tecido muscular. As modificações do tecido muscular podem ser monitoradas também a partir das circunferências da panturrilha, considerada um indicador sensível de alterações musculares no indivíduo idoso. As medidas da CB e CP permitem estimar a massa muscular e constituem indicadores de desnutrição em idosos, à medida que identifica a perda da massa muscular(39, 43). Dentre os métodos subjetivos de avaliação do estado nutricional destaca-se a Mini Avaliação Nutricional (MNA), uma das ferramentas de triagem mais utilizadas para detectar a desnutrição em idosos, especialmente aqueles em instituições de longa permanência e em hospitais(34). Não há um consenso de um método ―padrão ouro‖ para diagnóstico e avaliação nutricional precisa de idosos na prática clínica cotidiana. O MNA é um instrumento recomendado pela European Society of Parenteral and Enteral Nutrition (ESPEN), pela Associação Internacional de Gerontologia (IAG), pela Academia Internacional de Nutrição e Envelhecimento (IANA), por ser prático, simples de ser aplicado e pela capacidade de identificar rapidamente o paciente que necessita e pode ser beneficiado com uma intervenção nutricional precoce(44).O MNA consiste em 18 itens, que atribui pontuações, com base em avaliações antropométricas, dietéticas, globais e subjetivas. O somatório das pontuações atribuídas às diferentes perguntas (máximo de 30 pontos) permite uma classificação do estado nutricional. Pontuação com resultado >24 é considerada bom estado nutricional. Resultados com pontuações entre ≥17 e ≤24 são consideradas em risco de desnutrição e pontuação com resultado <17, desnutrição(30, 45). A Mini Avaliação Nutricional é amplamente utilizada em todo o mundo e permite identificar idosos desnutridos e em risco de desnutrição. Esse instrumento de avaliaçãofoi traduzido em mais de 20 idiomas e validado em nosso país, em um estudo que demonstrou que essa ferramenta possui propriedades psicométricas exploratórias suficientes para determinar o estado nutricional de idosos brasileiros(45). Dados referentes a estudos que utilizaram o MNA no Brasil mostram altas prevalências de desnutrição em idosos institucionalizados. Contextualizando essa situação, um estudo transversal realizado com 359 indivíduos de ambos os sexos, com idade igual ou superior a 60 anos, em lares de idosos na área urbana da cidade de Salvador, Bahia, mostrou que 66,3% dos idosos avaliados estavam desnutridos ou em risco de desnutrição(46). No 26 estado de São Paulo, outro estudo transversal, que utilizou o MNA para avaliar o estado nutricional de idosos com mais de 60 anos, residentes em duas instituições de longa permanência na cidade de Atibaia, encontrou uma prevalência de 51,28% de desnutrição e 40,28% de risco de desnutrição(47). Em Minas Gerais, na cidade de Uberlândia, um estudo similar que avaliou o estado nutricional de 153 idosos institucionalizados, com mais de 60 anos, com base no MNA, mostrou que 64% dos idosos apresentaram desnutrição ou risco de desnutrição(48). Já na cidade do Rio de Janeiro, 344 idosos institucionalizados residentes em abrigos municipais, com mais de 60 anos de idade, foram testados em um estudo transversal usando MNA. Os resultados mostraram que 8,3% deles estavam com desnutrição e 55,6% com risco de desnutrição(49). Nota-se,portanto, que a desnutrição e o risco de desnutrição são realidades que merecem nossa preocupação, devido a sua grande distribuição na epidemiologia do envelhecimento em nosso país(48). No contexto mundial, uma revisão de literatura que selecionou 32 estudos com idosos institucionalizados (n = 6821 idosos) utilizando a MNA como instrumento de triagem, mostrou uma prevalência de desnutrição de 21% e o risco de desnutrição de 51%. Uma revisão posterior, com uma amostra de 4.507 idosos com mais de 65 anos (24 estudos de 12 países, principalmente de origem europeia) que selecionou o MNA como ferramenta de triagem em diferentes cenários (moradia em comunidade, institucionalizados, hospitalalizados) mostrou que no total, 46,2% dos participantes estavam em risco de desnutrição e 22,8% estavam desnutridos. Quando focados apenas os idosos institucionalizados apenas um terço dos participantes estavam bem nutridos 32,9%, 53,4% em risco de desnutrição e 13,8% desnutridos(50). Trabalhos posteriores, que utilizaram o MNA para o rastreamento do estado nutricional de pessoas idosas, permitiram a detecção do risco de desnutrição e também da desnutrição. Um estudo transversal, com 102 indivíduos com 60 anos ou mais, realizado em um distrito da Turquia, mostrou a presença da desnutrição em 38,2% da amostra e risco de desnutrição em 18,6% dos idosos avaliados(51). Com o mesmo foco, outro estudo transversal, realizado em 23 casas de repouso em Flandres, na Bélgica, com 1188 idosos mostrou uma prevalência de 38,7% de risco de desnutrição e 19,4% de desnutrição(34). Considerando que o risco de desnutrição e a desnutrição é um problema prevalente em todo o mundo, a avaliação do estado nutricional requer uma abordagem integral, incluindo a investigação de causas subjacentes, como doenças crônicas, depressão, uso de medicamentos e isolamento social. Suplementos orais devem ser considerados em pacientes em risco 27 nutricional ou desnutridos incapazes de atender às necessidades diárias com a alimentação convencional. 1.5 Suplementos alimentares e desnutrição em idosos No Brasil, os suplementos alimentares são regulamentados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA, órgão responsável pela fiscalização de alimento e congêneres, que define suplemento alimentar como um produto para ingestão oral, apresentado em formas farmacêuticas, destinado a suplementar a alimentação de indivíduos saudáveis com nutrientes, substâncias bioativas, enzimas ou probióticos, isolados ou combinados(52). Estudos apontam os efeitos da utilização de suplementos alimentares sobre o estado nutricional de idosos desnutridos ou em risco nutricional. Os impactos positivos dessa suplementação foram verificados no ganho de peso corporal(53, 54), no aumento do IMC, da circunferência da panturrilha e da massa livre de gordura(55), além de efeitos benéficos no peso corporal, na circunferência do braço e nas concentrações séricas de albumina e colesterol(54). Há diferentes suplementos nutricionais orais comercialmente usados por idosos da comunidade e institucionalizados e o uso desses suplementos para aumentar o peso tem sido continuamente estudado. Se a ingestão calórica do consumo alimentar tradicional é insuficiente, o uso de suplementação nutricional oral pode prevenir novas perdas e promover ganho de peso(9). Os suplementos nutricionais orais estão sendo cada vez mais reconhecidos como parte integral da estratégia de gerenciamento de pacientes com desnutrição, tanto em instituições de saúde quanto na comunidade. Carboidratos, proteínas e gorduras devem essencialmente fazer parte da mistura, cada um com papéis funcionais importantes(56) Dentre os suplementos nutricionais orais disponíveis comercialmente e usados por idosos, a fonte proteica geralmente é composta por caseína, soro de leite, colágeno ou proteína da soja(9). As fontes de carboidratos adicionados aos suplementos nutricionais orais variam, e têm papel indispensável dentro do suplemento em termos de sabor e função. Em relação à distribuição de macronutrientes, as recomendações nutricionais vigentes (Dietary Reference Intakes- DRIs) preconizam uma faixa de distribuição aceitável de macronutrientes (AMDR) entre 45% a 65% das calorias provenientes de carboidratos, 10% a 35% de proteínas, e 20% a 35% de gordura(57), que é semelhante às proporções de macronutrientes que os suplementos nutricionais orais geralmente fornecem(56). 28 Um dos inconvenientes do consumo de suplementos alimentares disponíveis no mercado é que nem todos são testados e não se sabe quais são os seus efeitos, a curto e longo prazo, na reversão da desnutrição. Geralmente, os dados científicos de apoio são escassos ou não publicados, e muitos suplementos são colocados à venda sem quaisquer requisitos de dados científicos que suportem os efeitos positivos reivindicados(58). Muita ênfase é dada aos benefícios de uma boa alimentação geralmente em relação aos riscos da obesidade. Contudo, existe um consenso de que o risco de desnutrição em vez de supernutrição é a causa principal de preocupação em pessoas idosas, particularmente aquelas que estão hospitalizados ou institucionalizados(59). Assim exposto, entende-se que a suplementação oral é uma estratégia eficaz e viável, ou seja, uma aliada para uma adequada manutenção das recomendações diárias para este estágio da vida, principalmente quando esta população apresenta desnutrição, e que pode ser decorrente de fatores fisiológicos da própria idade ou da ingestão alimentar insuficiente para a faixa etária. A nossa proposta de desenvolver um suplemento alimentar de baixo custo utilizando um subproduto da indústria de laticínios e farinha do fruto do Cerrado é inovadora e de grande relevância social, visto que muitas instituições que abrigam idosos, por dificuldades financeiras, muitas vezes não acessam os suplementos disponíveis no mercado. Nessa perspectiva, estudos têm demonstrado diversos benefícios do soro do leite e suas proteínas para a saúde. A denominação ―soro‖ é dada ao líquido remanescente após a precipitação e remoção da caseína do leite, e possui diversas aplicações como matéria-prima para vários produtos(60). O soro de leite consolidou sua posição no setor de alimentos especialmente em função de suas proteínas, que são mais valorizadas que as proteínas do ovo, a caseína e a proteína da soja, por sua alta qualidade nutricional e rápida absorção. A proteína do soro tem como componentes principais a β-lactoglobulinas (35–65%) e α-lactalbuminas (12–25%), fonte de aminoácidos de cadeia ramificada (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos essenciais (cisteína) e peptídeos(61). A leucina é abundante (50 a 75% mais alta que outras fontes de proteína) e desempenha papel fundamental na regulação da síntese protéica do músculo esquelético(60,62). Assim, o soro não é mais um mero subproduto do processamento de produtos lácteos. É um resíduo da indústria de laticínios que tem-se caracterizado por seu excelente valor nutricional e funcional, devido a variedade de componentes bioativos. Novas estratégias devem ser criadas para expandir a utilidade desse recurso subutilizado. Seu uso na melhora do estado nutricional e alívio de síndromes metabólicas devem ser incentivados e intensificados(60). Além disso, a adição do soro do 29 leite a um produto alimentício, pelo baixo custo e boa aceitação, é viável técnica e economicamente(63). Há também, os frutos do Cerrado, que pelos seus valores nutricionais, têm motivado o interesse das indústrias alimentícias e de cosméticos(64). Dentre eles, o buriti (Mauritia flexuosa L. f.) tem sido alvo de investigações pela sua diversidade de uso e propriedades nutricionais. O buriti é um fruto nativo da América do Sul, e mais de 10.000 toneladas são produzidas anualmente no Brasil. É rico em vitaminas (A, C e E), antioxidantes (carotenóides,compostos fenólicos e tocoferol), óleos insaturados e fibras alimentares(65). Pode ser consumido na forma de doces, sorvetes, sucos, geléias, raspa seca, óleo e vinho fermentado (66). A raspa seca, obtida a partir da desidratação da polpa, após prensagem dá origem a dois produtos, o óleo bruto e a torta. A torta tem grande potencial de uso na alimentação humana. A partir dessa torta obtém-se também a farinha de buriti que pode ser utilizada como fontes de fibra alimentar e de antioxidantes naturais(67). Apesar dos potenciais benefícios do buriti, do soro do leite e das suas proteínas para a saúde, não há descrito na literatura o uso desses ingredientes, em conjunto, como suplemento alimentar para combate à desnutrição. Nesse contexto, buscar alternativas de fontes alimentares regionais constitui uma alternativa viável, de baixo custo e de alto valor nutricional para complementação alimentar de idosos desnutridos ou em risco de desnutrição. Assim, a elaboração de um suplemento em pó, com subprodutos da indústria de laticínios e farinha de buriti conferirá ao produto alguns nutrientes como aminoácidos essenciais, vitamina C, minerais e antioxidantes, e, é de se esperar que sua ação promova efeitos benéficos sobre a saúde dos idosos. Essa pesquisa fornecerá evidências científicas de que esse suplemento pode ser uma opção alimentar segura, nutritiva e de baixo custo para idosos desnutridos. 30 2.1 OBJETIVOS Objetivo geral Desenvolver e avaliar o impacto de um suplemento alimentar de baixo custo utilizando subprodutos da indústria de laticínios e fruto do Cerrado na recuperação do estado nutricional em modelo animal de desnutrição e idosas desnutridas institucionalizadas 2.2 Objetivos específicos Produto 1 Desenvolver um suplemento alimentar de baixo custo e avaliar o seu impacto na recuperação do estado nutricional e no perfil metabólico em modelo animal de desnutrição e em idosas desnutridas institucionalizadas, comparado com um suplemento comercial. Produto 2 Avaliar os efeitos da suplementação alimentar com um suplemento de baixo custo à base de Buriti e subprodutos da indústria de laticínios, na recuperação hepática em camundongos desnutridos com o foco na expressão de genes relacionados ao estresse oxidativo e em parâmetros bioquímicos e histológicos. 31 3. METODOLOGIA 3.1 Produção do suplemento alimentar Essa etapa foi realizada em parceria com o curso de engenharia de alimentos da UFMG – Campus Montes Claros atendendo à legislação sanitária federal (ANVISA) em relação às boas práticas de fabricação(68)e em relação à nova regulamentação de suplementos alimentares(52, 69). Um resumo da produção do suplemento teste está representado na figura 3. Figura 3 – Representação gráfica dos componentes do suplemento teste e da sua produção. O suplemento alimentar desenvolvido foi definido como um produto lácteo, com fonte protéica de alto valor biológico, com farinha de fruto do cerrado, enriquecido com vitaminas e sais minerais, em pó, para consumo oral, acondicionado em embalagem fechada à vácuo. As quantidades de cada ingrediente foram determinadas de modo a alcançar proximidade da composição nutricional de macro e micronutrientes utilizando-se como base o suplemento alimentar comercial para idoso, Nutren Senior, líder de vendas no mercado. A formulação 32 elaborada apresentou em sua composição em torno de 17,36% de proteína e 40,16% de carboidratos e 42,48% de lipídeos. A composição nutricional por 100g do suplemento desenvolvido e do suplemento comercial está apresentada na tabela 1. Tabela1– Composição nutricional do suplemento teste e comercial por 100g Suplemento Comercial Suplemento Teste Valor Energético 422kcal 435 kcal Carboidratos 36g 42g Proteínas 36g 25g Gorduras totais 15g 18g Fibra Alimentar 4g 8g Sódio 182mg 383mg Cálcio 873mg 595mg Ferro 7,1mg 2,5mg Potássio 500mg 865mg Magnésio 75mg 68mg Fósforo 400mg 571mg Zinco 6,7mg 2,3mg Vitamina A 500µg 183µg Tiamina (B1) 1,3mg 0,38mg Riboflavina(B2) 0,71mg 0,88mg Niacina(B3) 4,7mg 2,8mg Ácido Pantotênico(B5) 3,6mg 0,8mg Piridoxina(B6) 1,3 0,4mg Ácido Fólico (B9) 151µg 39µg Cianocobalamina (B12) 3,5µg 1µg Vitamina C 35mg 17mg Ingredientes do suplemento comercial: Leite em pó desnatado, maltodextrina, proteína isolada do soro do leite de vaca, caseinato de cálcio obtido do leite de vaca, gordura láctea, frutooligossacarídeos, inulina, minerais (citrato de cálcio, carbonato de magnésio, sulfato ferroso, sulfato de zinco, fosfato de cálcio, sulfato de manganês, sulfato de cobre e selenato de sódio), vitaminas (vitamina C, bitartarato de colina, vitamina E, inositol, vitamina D, vitamina A, niacina, pantotenato de cálcio, vitamina B1, vitamina B6, vitamina K, vitamina B2, ácido fólico, vitamina B12 e biotina) e emulsificante lecitina de soja. Ingredientes do suplemento teste: Soro do leite em pó, Leite em pó integral, farinha de buriti, maltodextrina, concentrado protéicodo soro do leite, goma xantana, mix de vitaminas e minerais adicionados: 150mg de cálcio (Fosfato de Cálcio Tribásico), 2,1mg de ferro (Pirofosfatoférrico), 1,05mg de zinco (Sulfato de Zinco), 90µ de vitamina A (Acetato de retinol), 0,18mg de vitamina B1 (Mononitrato de Tiamina), 2,4mg de vitamina B3 (Ácido 33 Nicotínico), 0,2mg de vitamina B6 (Cloridrato de piridoxina), 0,75mg de vitamina B5 (Pantotenato de Cálcio), 36µ de vitamina B9 (ácido fólico), 0,36µ de Vitamina B12 (Cianocobalamina), 6,75 mg de Vitamina C (Ácido Ascórbico). Os custos variáveis (ingredientes e embalagem) para a produção do suplemento teste (tabela 2) foram equivalentes a 22% do valor total do suplemento alimentar comercial, Nutren Senior. Considerando o alto custo dos ingredientes do suplemento comercial, entre eles as fibras solúveis frutooligossacarídeos e inulina, e o baixo custo do soro do leite em pó, ingrediente do suplemento teste, o custo do suplemento teste (custo variável) é possivelmente mais baixo que o suplemento comercial Nutren Senior, utilizado como controle no presente estudo. Tabela 2. Custos variáveis para a produção de 100g do suplemento Ingredientes Quantidade (g) Custo por 1kg Custo Final Leite em pó integral 33 R$16,5 R$0,54 Soro do leite em pó 30 R$6,50 R$0,19 Farinha de buriti 20 R$20 R$0,4 Maltodextrina 10 R$20,99 R$0,21 Proteína do soro do leite 5 R$ 139,50 R$0,71 Mix de vitaminas e minerais 1,5 R$17,09 R$0,03 Goma xantana 0.5 R$90 R$0,045 Embalagem plástica 1 R$0,37 Totais 100 R$ 2,49 3.2 Administração dos suplementos Os suplementos foram administrados na fase pré-clínica e clínica. Para o estudo com animais (Fase pré-clínica), foram utilizados 48 camundongos, machos, Swiss, com 15 semanas de idade divididos em 6 grupos (n = 8 cada). Os animais foram mantidos em uma fase inicial de adaptação (período de 10 dias), com livre acesso água e a ração padrão 34 Presence - ração para ratos e camundongos contendo, 67,5% de carboidratos, 22,5% de proteínas e 10% de lipídeos. Após essa etapa, 5 grupos foram submetidos à restrição alimentar para a indução da desnutrição. Quando os animais atingiram um déficit de peso de cerca de 20% em relação aos seus pesos iniciais, foram submetidos à renutrição pelo período de 30 dias. Nesse período os animais de cada grupo receberam as dietas específicas de renutrição, com ração padrão ou ração padrão acrescida de suplemento comercial ou de suplemento teste. Durante todo o experimento foi avaliado o peso corporal dos animais a cada 48 horas.Todos os procedimentos realizados estavam de acordo com os padrões éticos da instituição (CEEBEA - Universidade Estadual de Montes Claros – Anexo A). A fase clínica realizada com 25 idosas residentes em uma instituição de longapermanência com idade ≥ a 65 anos. As idosas desnutridas e com risco de desnutrição, que aceitaram participar do estudo, foram divididas em 2 grupos: grupo controle (n=5), que recebeu o suplemento comercial e grupo teste (n=20) que recebeu o novo suplemento durante 90 dias. Todos os procedimentos realizados envolvendo os participantes humanos estavam de acordo com os padrões éticos do comitê institucional conforme projeto aprovado em comitê de ética envolvendo seres humanos sob o CAAE (Certificado de Apresentação de Apreciação Ética) 56455916.2.0000.5146. (Anexo B). Os procedimentos completos dessa fase estão disponíveis nos produtos 1. e 2 apresentados a seguir. 35 4. PRODUTOS 4.1 Produto 1: Development and evaluation of a low cost food supplement to combat malnutrition: a translational study in malnourished mice and institutionalized elders 4.2 Produto 2: Liver damage produced by malnutrition is improved by dietary supplementation in mice: assessment of a low-cost supplement based on buriti (a Cerrado fruit) and dairy by-products 4.3 Produto 3: Suplemento alimentar a base de farinha de buriti e subprodutos da indústria de laticínios. Coordenadoria de Inovação e Transferência Tecnológica – CTIT (NI 70/2019) – ANEXO F 36 4.1 Produto 1: Development and evaluation of a low cost food supplement to combat malnutrition: a translational study in malnourished mice and institutionalized elders Short title: Food supplement for malnourished elderly patients Audrey Handyara BICALHO 1 , Fabio Ribeiro do SANTOS 2 , Daniele Cristina MOREIRA 1 , Victor Hugo Dantas GUIMARÃES 1 , Alfredo Mauricio Batista DE PAULA, André Luis Sena GUIMARÃES, Marcelo Perim BALDO, Sérgio Henrique Sousa SANTOS 2 1 Laboratory of Health Science, Graduate Program in Health Sciences, Montes Claros State University (Unimontes), Montes Claros, MG, Brazil. 2 Institute of Agricultural Science. Food Engineering, Federal University of Minas Gerais (UFMG), Montes Claros, MG, Brazil. Audrey Handyara BICALHO bhandyara@gmail.com. Sérgio Henrique Sousa SANTOS: sergiosousas@hotmail.com Correspondence may be addressed to: Dr. Sérgio H S Santos. Institute of Agricultural Sciences. Food Engineering, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG); Avenida Universitária, 1.000 – Universitário, 39.404-547, Montes Claros, MG, Brazil. Phone: +55 38 32248327 - Email: sergiosousas@hotmail.com CONFLICT OF INTERESTS: The authors have nothing to disclose. mailto:bhandyara@gmail.com mailto:sergiosousas@hotmail.com 37 Graphical abstract Abstract Malnutrition is often seen as a normal part of the aging process. Oral food supplementation is an effective and viable strategy to meet nutritional recommendations for this life stage. Thus, the objective of the present study was to develop a low cost food supplement using by- products from the dairy industry and Brazilian Cerrado fruits (Buriti) and to evaluate its impact on the recovery of the nutritional status and metabolic profile of experimentally malnourished animals and malnourished institutionalized elders when compared to a commercial supplement. In the preclinical stage, male Swiss mice were divided into six groups and submitted to two treatment phases: malnutrition and renutrition, fed with different diets. The clinical stage was performed with 25 elderly women living in a long-term care facility, aged ≥ 65 years old with malnutrition or risk of malnutrition. The main findings of the preclinical and clinical evaluations showed favorable effects related to the low-cost 38 supplement developed in all the anthropometric parameters evaluated, such as weight gain and final score of the Mini Nutritional Assessment of the elderly women. There was also an increase in serum albumin levels in the two stages of the study and an improvement of the lipid profile in the preclinical phase. In the clinical phase, there was a significant increase in the number of red blood cells and hemoglobin. The present study showed the benefits of nutrition interventions. We showed for the first time that a low coast dietary supplement using Cerrado fruit (Buriti) and by-products of the dairy industry is able to present better results in the recovery of the nutritional status of malnourished elderly. Keywords: Elderly; malnutrition; oral nutritional supplement; nursing home; intervention. INTRODUCTION Malnutrition is a prevalent issue in the elderly, especially the institutionalized (1-3). It is an often neglected condition, commonly regarded as part of the normal aging process (3-5). Therefore, specific nutritional interventions are not performed, resulting in damage to the nutritional status and health of the elderly. Prevention and treatment of malnutrition is an important objective in clinical nutrition (3). However, it is not always an easy task to achieve, given the multifactorial origin of the problem. Moreover, in elderly patients, the effectiveness of nutritional interventions is reduced and recovery from malnutrition is difficult to accomplish (1). Thus, food supplementation is an effective and viable strategy for maintaining daily nutritional recommendations at this stage of life, especially when this population is malnourished (6, 7). Thus, the interest in the consumption of native fruits with functional activity and nutritional properties has been increasing, and research on these foods has become very important due to their contribution to public health and economy (8, 9). In this sense, the fruits of the cerrado region have been targeted for scientific research (10, 11). Among them, we are interested in buriti (Mauritia flexuosa L. f.), especially the fruit-based flour (9). The buriti flour can be added to different food products, adding nutritional value as it is considered a potential source of dietary fiber, carotenoids, and antioxidants (11). In addition, there are 39 by-products of the dairy industry, such as whey and its proteins, which have applications as functional, nutritional, and therapeutic products. Studies have shown benefits of whey in preventing age-related muscle loss (12, 13) and other metabolic characteristics that are especially associated with its proteins (14, 15). Thus, the elaboration of a powdered food supplement containing by-products of the dairy industry and Cerrado fruits could improve the health of elderly individuals who are malnourished or at a nutritional risk. In this context, the purpose of the present study was to develop a high-nutritional-value and low-cost food supplement and to evaluate its effectiveness in the recovery of the nutritional status and metabolic profile in an animal model of malnutrition and institutionalized malnourished elderly women. It also intended to compare its effects with a commercial, elderly-specific supplement available on the market. 2- METHODS The ingredients of the formulation were purchased from the local market og Montes Claros, MG, Brazil. The test supplement were manufactured by weighing the ingredients and blending then. The formlation was based on the Brazilian legislation for good manufacture practices and food supplements (17) and also based on the chemical composition of similar products avaialble on the Brasilian market. The Test Supplement was defined as a powdered milk product for oral consumption, with a high biological value protein source, added with the aforementioned Cerrado fruit flour, enriched with vitamins and minerals. Finally, the supplement was packed in a vacuum-sealed packaging. The Test Supplement‘s nutritional composition per 100 g as well as that of the commercial supplement are shown in table 1. Animal studies - Preclinical phase For the in vivo experiments, 48 Swiss, 15-week-old male mice were divided into 6 groups (n = 8 each) (Table 2). Theanimals were kept at an initial adaptation phase (10 day period), with free access to water and the standard chow for rats and mice (Presence ® ) containing 67.5% carbohydrates, 22.5% proteins, and 10% lipids. All the procedures performed that involved animals were in accordance with the ethical standards of the institution (CEEBEA - State University of Montes Claros – Annex A). The animals were kept under controlled light and temperature conditions. Malnutrition protocol and renutrition diets 40 After the adaptation period, the animals were submitted to two treatment phases: food restriction phase to lead to malnutrition (18) and renutrition phase, according to figure 1. A food restriction of 20% in relation to the control group was maintained until the moment that the animals reached a deficit of weight of approximately 20% in relation to their original weights. Thereafter, they were submitted to renutrition for 30 days. The groups with their respective renutrition diets are shown in table 2. Tests of glucose tolerance and insulin sensitivity (GTT and STI) For the glucose tolerance test, 2mg glucose/g body weight was injected intraperitoneally into the mice after overnight fasting. Glucose levels were monitored 0, 15, 30, 60 and 120 minutes post-injection using blood samples taken from the animal's tail. Insulin sensitivity tests were performed with animals in the fed state after intraperitoneal injection of insulin (0.75U/kg body weight), where blood samples from the tail were collected 0, 15, 30 and 60 min after injection for the measurement of blood glucose levels. Measurements of body weight, food intake, tissue harvesting, and biochemical analyses Mice food intake was measured on a daily basis during the treatment period. Body weight was measured two to three times per week. At the end of the experiment, the animals, after nocturnal fasting, were killed by decapitation and blood samples were collected. Tissues from these animals were harvested, weighed, frozen on dry ice and stored at - 80 °C for further analyses. Total serum cholesterol, triglycerides, high-density lipoprotein (HDL), glucose, and albumin were tested using enzyme kits (Wiener®, Argentina). Measurements were made on the Wiener BT-3000 Plus Chemical Analyzer (Wiener®, Argentina). Study with humans - Clinical phase The study was performed with 25 elderly women living in a long-stay institution aged ≥ 65 years. Data collection was performed in the beginning of the study (screening) and after 90 days of supplementation. Inclusion criteria were defined based on the nutritional screening in which the Mini Nutrition Assessment (MAN) was used, a widely valid instrument to identify the elderly who are at risk of malnutrition or malnourished (2). The elderly women who are malnourished or risking malnourishment and accepted to participate in the study were divided into 2 groups: control (n = 5), who received the commercial supplement, and test 41 group (n = 20) who received the test supplement. Those with diabetes and lactose intolerance and those who did not agree to participate in the study were excluded. All procedures performed involving the human participants were in accordance with the ethical standards of the institutional committee according to the project approved in the ethics committee involving human beings under the CAAE (Certificate of Ethical Appreciation Presentation) 56455916.2.0000.5146. (Annex B) Protocol of nutritional intervention Elder women classified as malnourished or at nutritional risk received a daily test supplement or commercial supplement, under consultation with a nutritionist, a nurse, and trained staff. The supplement preparation process was carried out daily as follows: the powder was mechanically mixed with filtered water until homogenization. The following dosage was used for the two supplements: 3 tablespoons (48g) for 120 ml of water. This preparation was distributed to each elderly woman in her respective group once a day, in the morning meal interval. The amount and proportion of nutrients present in the supplement developed per dose was the same as that considered in the commercial food supplement formulation for the elderly. Test and commercial supplements differed only in terms of some ingredients. Data collect The application of the Mini Nutritional Assessment (MNA) (Annex C) and the collection of anthropometric and blood data were performed at 0 and 90 days of treatment. MNA is a simple and quick method of identifying elderly patients who are at risk of malnutrition or who are already malnourished. The first six questions of this evaluation (alteration in food intake, weight loss, mobility, psychological stress, neurological problems, and Body Mass Index - BMI) comprise the nutritional screening. In this phase, the elderly who presented a score of at least 12 points had the evaluation interrupted, as this result indicate that they did not present a risk for malnutrition. The next twelve questions comprehend the overall assessment. A total score (sum of triage and overall assessment points) of 24 or higher indicates a good nutritional status whereas a range from 17 to 23.5 indicates a risk of malnutrition and below 17, malnutrition (2). The following anthropometric variables were collected: weight, height, skin folds (triceps, subscapular,), and circumference of the arm and leg. The height and weight of the elderly women who were able to deambulate were measured according to previously 42 described techniques (19). From the data of weight and height, the Body Mass Index (BMI) was calculated. For the bedridden elderly, weight and height were estimated from the equations proposed by Chumlea et al (20, 21) The circumference of the arm was measured at the midpoint between the acromion and the olecranon. The circumference of the calf was measured with the elderly women sitting with feet slightly apart and the right leg at a 45 ° angle with the tape placed at the maximum circumference of the calf. The subscapular cutaneous fold was measured at the lower right scapula angle and the tricipital cutaneous fold in the mid and posterior points of the right arm (4). Blood samples were collected for the following tests: albumin, total cholesterol (TC), triglycerides (TG), as well as a complete blood count. Serum was obtained after centrifugation (600 × g for 10 min at 4 °C). Total serum cholesterol, triglycerides and albumin were assayed using enzymatic kits (Wiener®, Argentina). Statistical analyses Normality was verified by the Shapiro-Wilk test (small samples). Data were analyzed using GraphPad Prism version 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) and expressed as means ± standard error of the mean (SEM). Comparison between two groups was performed using Student's t-test and multiple comparisons were performed using one-way ANOVA or two-way ANOVA tests followed by the Bonferroni post-test. In humans, Student's t-test was used for the group treated with the test supplement and Wilcoxon test for the group treated with the commercial supplement. A 95% confidence interval was considered for statistical significance and the p value was set at p <0.05. 3- RESULTS Preclinical Food intake (Fig. 2A), energy intake (Fig. 2B) and body weight (Fig. 2C and D) analyses revealed no differences in weight gain in malnourished mice undergoing renutrition with the supplement test (ST) and commercial supplement (CS) diets isocaloric to the control group when compared to the control group. On the other hand, in mice undergoing renutrition with the test supplement diet isocaloric to the malnourished group (FR20% -TS), body weight 43 gain was higher compared to the malnourished group (FR20%) and to the group that received the commercial supplement isocaloric to the malnourished group. (RF20% -CS). There wereno differences in epididymal, retroperitoneal, and mesenteric adipose tissue weights (Fig. 2 E, F, and H) in the renutrition groups submitted to diets isocaloric to the malnourished group (FR20%, FR20% -CS, FR20% -TS). The weight of these tissues was higher in the control (ST) and renutrition groups with diets isocaloric to the control group (ST-CS, ST-TS) when compared to the malnourished group (FR-20%) and submitted to diets isocaloric to the malnourished group. There were no differences in glycemia for fasting mice (Fig. 3A) in the renutrition groups submitted to food restriction (FR20%, FR20% -CS, FR20% -TS). The glucose levels were higher in the control and renutrition groups with isocaloric diets (ST-CS, ST-TS) when compared to renutrition groups submitted to food restriction (FR20%, FR20% -CS, FR20% - TS). The oral glucose tolerance test (Fig. 3B) showed a reduction in glucose levels in all groups submitted to renutrition in relation to the ST group (Fig. 4B and C), with significant values for the groups FR20% and FR20-CS. The insulin sensitivity test (IST) showed higher values in blood glucose levels compared to FR20% (Fig. 3C) in mice fed control (ST) and renutrition diets (ST-CS and FR20% TS). Albumin levels (Fig. 4A) were significantly higher in the following renutrition groups: commercial supplement isocaloric to the control diet (ST-CS), commercial supplement isocaloric to the malnourished diet (FR20-CS), and test supplement isocaloric to the malnourished diet (FR20% TS), when compared to the malnourished group (FR20%). Triglycerides levels (Fig. 4B) were reduced in renutrition groups (ST-CS, ST-TS, FR20% -CS, FR20% TS) when compared to the control (ST) and malnourished groups (FR20%). Cholesterol levels (Fig. 4C) were not different between the groups. HDL cholesterol increased in the commercial supplement isocaloric to the control group when compared to the control (ST), test supplement isocaloric to the control (FR20% -TS), and malnourished (FR20%) groups. HDL cholesterol levels (Fig. 4D) were significantly higher in the commercial supplement and test supplement isocaloric to that of the malnourished group (FR20% -CS and FR20% -TS) when compared to the malnourished group (FR20%). Clinical outcomes 44 The average age of participants in the present study was 88.2 years (± 10.4) for the group that received the commercial supplement and 81.8 years (± 3.5) for the group that received the test supplement, not differing significantly between groups. The anthropometric parameters of the elderly included in the study are shown in figures (5A, B, C, D, E, and G). This study lasted 90 days and anthropometric and biochemical evaluations were performed at the baseline (week 1) and at the end (90 days). There was a significant improvement in all the anthropometric parameters of the group of individuals who received the test supplement. The final MNA score (Fig. 5F), a tool used for nutritional screening, was higher at the end of the study in the group that received the test supplement. Biochemical and hematological parameters are shown in figures (6A, B, C, D, and E). There was significant increase in albumin, red blood cell, and hemoglobin levels. DISCUSSION It is well known that the elderly are especially vulnerable to consequences related to malnutrition; therefore, prevention, diagnosis, and immediate treatment of this condition, with appropriate nutritional interventions, should remain relevant in the health care of this population (22). In the present study, the new low-cost supplement with by-products from the dairy industry and the buriti fruit showed more favorable effects than the commercial supplement on all anthropometric parameters evaluated and also on the final score of the Mini Nutrition Assessment of the elderly. In the preclinical phase, animals with isocaloric diets were found to have different weight gain responses. We highlight the most favorable weight gain for the malnourished group, which received the test supplement. In the clinical phase, the average weight gain of the elderly women, 2.25 kg, was significant in the supplement test group. This is an important result considering that from the age of 60, 60% of the elderly tend to lose weight (23, 24), increasing the risk of malnutrition (25). This weight loss is associated with adverse outcomes, particularly if unintentional, and if the body weight of this elderly person is already low (26). Considering that all the elderly women who participated in our study were underweight, and that in the screening the group that received the test supplement had an average weight and BMI of 37.13kg and 16.39kg/m 2 , 45 respectively, our results regarding significant weight gain are encouraging, as the literature documents an alarming prevalence of low weight in the elderly (7, 27). Also noteworthy is the significant increase in arm muscle circumference and calf circumference in the elderly group that received the test supplement. These anthropometric parameters are considered sensitive indicators of muscle changes (28, 29). Therefore, this result reflects in an improvement in their nutritional status. The reduction of muscle tissue is an undesirable modification that occurs along aging. Although reductions are observed in both lean body mass and fat mass, weight loss in the elderly is expected to show a more pronounced decrease in lean body mass (23, 24). Therefore, maintaining or attenuating the natural loss of muscle mass that accompanies aging will always be important, as skeletal muscle plays key roles in strength, physical function, and metabolic regulation, with implications for the prevention of chronic disease, functional capacity, and quality of life ( 12, 13, 30). The success of the new supplement has also been confirmed in the results of biochemical and hematological examinations in the preclinical and clinical phases. In this sense, in comparison with the commercial supplement, we obtained more favorable responses with the new supplement, observed in the increase of albumin (in animals and humans) and in the increase of red blood cells and hemoglobin (in humans). Senior citizens who are malnourished or at risk of malnutrition can be treated with a variety of dietary approaches (31). In this regard, scientific evidence shows that the use of dietary supplements can lead to improvements in both nutritional intake and clinical outcomes (4,6,7,32,33). Significant results and benefits of nutritional supplementation on anthropometric parameters are documented in the literature. A study performed by Lauque et al. (2000) in which 88 elderly individuals who were malnourished or at risk of malnutrition ingested a commercial nutritional supplement for 60 days reported weight gain (1.4 ± 0.5 kg) and increase in the Mini Nutritional Assessment score of the elderly (34). Caselato-Sousa et al. (2011) found benefits of oral nutritional supplementation over a 90-day period on the biochemical parameters of malnourished elderly individuals, with a significant increase in the mean values of total protein and albumin (35). Another study conducted by Lee et al. (2013), with institutionalized malnourished elderly, showed that nutritional supplementation for a period of six months significantly improved body weight, BMI, arm circumference, and calf circumference (6). Furthermore, Ordóñez et al (2010) showed that a hyperprotein nutritional 46 supplement increased the body weight and BMI of malnourished elderly (36). Thus, dietary supplements are being increasingly recognized as an integral part of the overall malnutrition management strategy (31). However, access to this supplementation, especially in philanthropic institutions sheltering the elderly, has, as one of its main obstacles, its cost. It is important to highlight the results of the present
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