Aula 6

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PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES 
(PIVE)
Docente Francisco Jr.
Mestrado em Reprodução Assistida
OBTENÇÃO DOS OVÁRIOS
• Matadouros
• Lavagem em álcool 70%
• Conservação em solução salina estéril de cloreto
de sódio a 0,9%
• Transporte ao laboratorio a temperatura ambiente
em caixa termica por um periodo médio de 3h
RECUPERAÇÃO E SELEÇÃO DOS OÒCITOS
• Punção dos FL antrais/ 2 a 8 mm utilizando
agulhas 40 x 12 e seringas de 10 mL, sendo o
fluido folicular obtido depositado em tubos de
15 mL.
• Repouso dos tubos por 5 a 10 minutos para 
decantação.
RECUPERAÇÃO E SELEÇÃO DOS OÒCITOS
• Sedimento é transferido para uma placa
de Petri estéril de polietileno de 35 mm de
ø,
• A placa deve conter meio 199 com tampão
Hepes acrescido 10% de Soro Fetal Bovino
(SFB) (v/v), 0,22mM de piruvato,
62,6μg/mL de penicilina, 50μg/mL de
gentaminica.
RECUPERAÇÃO E SELEÇÃO DOS OÒCITOS
Rastreamento dos oócitos
• Lupa estereomicroscópica sob um
aumento de 16 x.
• Com o auxílio de pipeta sob fluxo laminar,
os oócitos recuperados são lavados em H-
199 e selecionados para a maturação in
vitro.
Carateristicas dos oócitos para maturação in 
vitro
• Circunferência normal,
• Citoplasma homogêneo
• Sem vacúolos ou grânulos escurecidos
• Apresentem células do cumulus oophorus
compactas
MATURAÇÃO IN VITRO: Lavagem e Incubacao 
• Meio 199 suplementado com
bicarbonato de sódio, 10% SFB,
62,6μg/mL de penicilina, 50
μg/mL de gentamicina, 0,5 μ
g/mL de FSH, 5,0 μg/mL de LH,
0,22mM de piruvato, 10 μL/mL de
insulina, transferrina e selênio
(ITS) e 50 μM de β-
mercaptoetanol
A incubação
• Placas de petri com gotas de 100
μL de meio de MIV sob óleo
mineral estéril (10 a 15 oócitos
por gota)
• Estufa de CO2 a 5%, com 38,5ºC
de temperatura e atmosfera
húmida, durante 22 horas
SEPARAÇÃO E CAPACITAÇÃO ESPERMÁTICA
• Gradiente de densidade
descontínuo de Percoll,
constitui o método utilizado
para a separação dos
espermatozóides dos
crioprotetores e plasma
seminal
• A palheta de sêmen (0,25 mL) é
descongelada em banho-maria a
35ºC durante 30"
• O sêmen é depositado sobre a
coluna de 2 mL de Percoll
(gradientes de 45 e 90%)
contendo 0,3mg/mL de
GSH(Glutationa) e submetidos a
centrifugacao por 20 minutos
SEPARAÇÃO E CAPACITAÇÃO ESPERMÁTICA
• Sobrenadante desprezado e o
• Pellet, homogeneizado em 2 mL de meio FIV com GSH e
centrifugados durante 3 minutos para remoção dos resíduos
de Percoll e/ou GSH
• Resuspenção do pellet para capacitação dos spz em 2 mL
de meio de FIV contendo GSH e incubado por 1 hora em
estufa húmida a 38,5ºC e 5% CO2.
FECUNDAÇÃO IN VITRO
• [ ] espermática ajustada para
2X10⁶ SPTZ/mL e
• Depositados junto com os oócitos
maturos em gotas de 80 μL de
meio de FIV (meio TALP,
suplementado com albumina
sérica bovina (BSA), heparina,
penicilamina, hipotaurina,
epinefrina)
• Os gametas permanecem co-
incubados sob as mesmas
condições citadas para a MIV por
um período de 26 horas.
CULTIVO IN VITRO DOS EMBRIÕES
• Co-cultivo dos embriões
bovinos sobre monocamada
de células da granulosa (CG)
oriundas do cumulus
oophorus dos oócitos.
• Substituição do meio de MIV
por 50 μL de meio de cultivo
embrionário.
• O meio de cultivo a utilizar é
Fluído Sintético do Oviduto
(SOF) descrito por TERVIT et
al. (1972), suplementado com
6 mg/mL de (BSA), glicina,
10% de SFB e antibióticos.
CULTIVO IN VITRO DOS EMBRIÕES
• Após 26 horas de cultivo, retira-se oócitos/zigotos de cada grupo e
fixados para posterior avaliação da taxa de fecundação e
polispermia.
• Após 20 horas, os zigotos são submetidos à pipetagens para
retirada das células do cumulus oophorus restantes e SPTZ
aderidos à zona pelúcida e então transferidos para gotas de
cultivo, onde permanecem incubados por nove dias
• Após 72 horas de cultivo acrescenta-se 50μL de meio SOF à gota
de cultivo embrionário (feeding) e após 120 horas é realizada a
renovação de 50% do meio por SOF suplementado com glicose
• Ate a próxima aula