Produção In Vitro de Embriões Bovinos - PIVE

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Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 11, suplemento 1, p.135-138, abril, 2008 
 
BIOTECNOLOGIAS DA REPRODUÇÃO ANIMAL 
 
PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS 
 
Paulo Bayard D. GONÇALVES1, M.H. BARRETA, L.C. SIQUEIRA, A.Q. 
ANTONIAZZI 
 
INTRODUÇÃO 
A produção in vitro de embriões (PIV) é uma biotécnica de reprodução 
assistida e uma ferramenta para pesquisa de eventos relacionados à 
maturação e fecundação de oócitos, capacitação espermática e 
desenvolvimento embrionário na fase de pré-implantação. Além disso, a PIV é 
um instrumento de suporte para outras biotécnicas como clonagem, 
transgênese e transferência nuclear. Sua aplicação em escala comercial se 
tornou viável após o advento da aspiração folicular in vivo e pelo 
aprimoramento das condições de cultivo in vitro. 
Passam-se 25 anos após o nascimento do primeiro bezerro produzido in 
vitro e os índices de blastocistos obtidos ainda estão aquém do desejado, 
variando entre 20-50% (média de 35%). Além da baixa eficiência da técnica, os 
embriões que conseguem se desenvolver in vitro apresentam qualidade inferior 
àqueles produzidos in vivo. Diversos parâmetros são utilizados para avaliar a 
qualidade dos embriões PIV como morfologia, criotolerância, transcrição 
(mRNA), eclosão in vitro e prenhez após a transferência. Entretanto, nenhuma 
dessas técnicas permite uma seleção eficiente que assegure bons índices de 
prenhez. O aumento da eficiência da PIV está condicionado ao 
desenvolvimento de trabalhos que visem aperfeiçoar e simplificar as condições 
de cultivo durante as várias etapas do processo, principalmente no que se 
refere à maturação citoplasmática e molecular de oócitos obtida in vitro. 
 
Maturação nuclear, citoplasmática e molecular do oó cito 
In vivo, a maturação nuclear do oócito inicia após o pico pré-ovulatório de 
LH durante o estro e in vitro, a retirada do oócito do ambiente folicular reinicia a 
meiose. Em bovinos, a maturação nuclear do oócito requer de 18-24h e 
compreende a progressão do estádio diplóteno da primeira prófase meiótica 
até metáfase II. A capacitação do oócito, avaliada pelo desenvolvimento 
embrionário, tem sido positivamente associada com o tamanho do folículo 
antral do qual foi recuperado (LONERGAN et al., 1994), com o estádio de 
desenvolvimento folicular (MACHATKOVA et al., 2004) e com o local de 
maturação (in vivo vs. in vitro; RIZOS et al., 2002). O TCM199 é o meio mais 
difundido entre os laboratórios de PIV. Seus principais suplementos são o soro 
fetal bovino, FSH, LH, piruvato, penicilina e estreptomicina. A maturação in vitro 
varia de 18-24h em 5% de CO2 em ar e umidade saturada. 
 
 
 
 
1 Laboratório de Biotecnologia e Reprodução Animal, Universidade Federal de Santa Maria, 
Santa Maria, RS, Brazil. e-mail: bayard@biorep.ufsm.br 
 
P. B. D. GONÇALVES et al. 
 
Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 11, suplemento 1, p.135-138, abril, 2008 
 
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In vivo, os folículos pré-
ovulatórios atingem um diâmetro de 
12-20mm, e ovulam um oócito com 
núcleo e citoplasma maturados 
adequadamente. Entretanto, os 
oócitos coletados para PIV são em 
sua maioria oriundos de pequenos 
folículos antrais e apesar de 
competentes para o reinício da 
meiose, apresentam baixa capa-
citação para o desenvolvimento 
embrionário, por apresentarem uma 
maturação citoplasmática e mole-
cular insuficiente. As condições de 
cultivo in vitro têm sido constan-
temente manipuladas para melhorar 
a capacitação do oócito após sua 
retirada do ambiente folicular. 
Fatores de crescimento, gonado-
trofinas e esteróides têm sido 
adicionados aos mais diversos 
meios de maturação. Porém, 
apenas modestos incrementos na 
capacidade de desenvolvimento 
embrionário puderam ser obser-
vados e a produção de blastocistos 
raramente atingiu 50% 
(THOMPSON, 2000). Métodos 
celulares e bioquímicos têm sido 
usados para inibir o reinício da 
meiose dos oócitos após sua 
retirada do ambiente folicular, 
visando melhorar o desenvol-
vimento citoplasmático e molecular 
na ausência de maturação nuclear 
(SIRARD, 2001). Esses estudos 
demonstram que é possível manter 
o reinício da meiose bloqueado por 
24-48h sem afetar drasticamente o 
desenvolvimento embrionário ou 
fetal. Porém, nenhuma dessas 
metodologias tem melhorado a 
capacidade de desenvolvimento 
embrionário. Recentemente, nosso 
grupo demonstrou que a angio-
tensina II é capaz de reverter o 
efeito inibitório das células da teca 
sobre a maturação nuclear de 
oócitos bovinos (GIOMETTI et al., 
2005). Além disso, o cultivo de 
CCOs em um sistema de maturação 
com células foliculares, angioten-
sina II e IGF-I aumentou as taxas de 
clivagem, blastocisto e eclosão in 
vitro (STEFANELLO et al., 2006). 
 
Fecundação in vitro 
In vivo, o espermatozóide 
percorre um longo trajeto para 
chegar ao infundíbulo e fecundar o 
oócito. Durante esse percurso, 
glicosaminoglicanas presentes no 
trato genital feminino induzem sua 
capacitação. Para fertilização in 
vitro, a capacitação espermática é, 
geralmente, promovida pela hepa-
rina. Antes do processo de 
capacitação, os espermatozóides 
viáveis contidos em uma palheta de 
sêmen precisam ser separados do 
plasma seminal, crioprotetores, 
extensores e células mortas. Para 
bovinos, os métodos de separação 
espermática mais utilizados são o 
gradiente de percoll e o swim-up. O 
co-cultivo de espermatozóides e 
oócitos é realizado por um período 
de 18-22h, a 39˚C e 5% de CO2 em 
ar e umidade saturada. O sistema 
de fertilização in vitro tenta 
mimetizar as condições in vivo. 
Porém, resultados variados são 
obtidos com espermatozóides 
oriundos de touros ou partidas 
diferentes. 
 
Desenvolvimento embrionário in 
vitro 
O momento crítico para o 
desenvolvimento embrionário come-
ça após a fecundação, quando a 
segunda meiose é reiniciada para 
formar o pró-núcleo feminino, e 
termina com a ativação do genoma 
embrionário 8-16 células (BREVINI 
GANDOLFI & GANDOLFI, 2001). O 
desenvolvimento nesse período é 
dependente de mRNA e proteínas 
acumuladas durante a maturação 
citoplasmática (BLONDIN & 
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SIRARD, 1995). A transcrição 
deficiente antes da ativação do 
genoma embrionário não permite o 
desenvolvimento em várias espé-
cies. Isso foi um dos obstáculos da 
PIV nas décadas de 60 e 70, fato 
que contribuiu para melhoria dos 
sistemas de cultivo. 
Diversos fatores de cresci-
mento têm sido adicionados aos 
meios de cultivo in vitro para 
melhorar os índices de desenvol-
vimento embrionário (LONERGAN 
et al., 1996; MATSUI et al., 1997). 
Porém, apenas em meios definidos 
esses fatores incrementam as taxas 
de blastocisto. O cultivo in vivo no 
oviduto de ovelhas (LONERGAN et 
al., 2003) e vacas, de embriões 
bovinos fertilizados in vitro, parece 
fornecer um ambiente adequado 
para o desenvolvimento embrio-
nário. A produção de blastocistos 
em sistemas de cultivo in vivo não é 
superior a observada in vitro, mas a 
qualidade dos blastocistos cultiva-
dos in vivo é superior (RIZOS et al., 
2002). 
O cultivo embrionário in vitro 
varia de 7-9 dias a 39ºC, atmosfera 
controlada (5% de O2, 5% de CO2 e 
90% de N2) e umidade saturada. A 
taxa de blastocisto geralmente é 
avaliada no 7º dia após a 
fecundação sendo que, os blasto-
cistos podem permanecer na estufa 
até o 9º dia para avaliar a taxa de 
eclosão in vitro. 
CONSIDERAÇÕES FINAIS 
A otimização da técnica de PIV 
visando à produção de embriões de 
boa qualidade e em número cada 
vez mais expressivo resultará na 
diminuição do custo por embrião 
produzido e possibilitará uma maior 
difusão da técnica entre os 
produtores. Ainda, tais melhorias 
seriam de grande valia para o 
aprimoramento de outras biotéc-
nicas que dependam da PIV. Para 
isso se faz necessário o 
desenvolvimento de um sistema de 
maturação in vitro adequado que 
permita uma maior capacitação dos 
oócitos e conseqüentemente uma 
maiortaxa de desenvolvimento 
embrionário. 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
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