Estudos Cinéticos da Fermentação Alcoólica utilizando Saccharomyces cerevisiae

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1.INTRODUÇÃO 
 A utilização de leveduras pela indústria vem se mostrando cada vez mais 
 intensa, seja para obtenção de células, obtenção de compostos fermentados ou do 
 produto final por essas produzidos. Devido à baixa complexidade dos processos 
 fermentativos que usam leveduras, esse é muito atrativo, sendo cada vez mais 
 aprimorado para melhor utilização. 
 O presente trabalho consiste da análise do cultivo de leveduras da sepa 
 “Amanda” em caldo de cana, afim de compreender melhor sua cinética, tendo sido 
 realizado um processo de mensuração de células e características do meio (como 
 pH e ºBrix) de acordo com tempos variados em intervalos curtos. Os resultados 
 foram analisado observando pequenas discrepâncias metodológicas na prática e 
 com isso obtendo resultados que se aproximam ao cálculo de reta de primeiro grau. 
 O objetivo final era a caracterização da sepa de acordo com os critérios 
 acima citados: número de células geradas, pH do meio e consumo de açúcar 
 mesurado em ºBrix. 
 2. REVISÃO 
 2.1 Leveduras 
 As leveduras são taxonomicamente diversas, incluindo basidiomicetos, 
 ascomicetos e as leveduras imperfeitas, um terceiro grupo. Estas são identificadas 
 de acordo com as características morfológicas e fisiológicas, que são distintas se 
 comparadas às características dos fungos. Uma espécie de leveduras é 
 considerada como uma reunião de uma população de clones ou de uma coleção de 
 linhagens, significando que a descrição padrão de uma espécie é baseada em 
 várias linhagens. Uma diferença significativa para a classificação de espécies é a 
 interfertilidade entre as linhagens de uma mesma espécie e a infertilidade entre 
 linhagens de espécies diferentes. Outro fator de classificação é a diferença nas 
 bases genéticas de cada espécie. Também pode ser diferenciada em relação às 
 estruturas de parede celular, composição química dessas e a similaridade de suas 
 co-enzimas (N. J. W, 1984). 
 Dentre as aplicações, as leveduras são intensamente utilizadas em 
 processos industriais, sendo cultivadas visando à obtenção das suas células, de 
 seus componentes celulares e dos produtos finais obtidos durante a fermentação 
 alcoólica. Suas células são empregadas na panificação e como fontes de alimentos, 
 vitaminas e outros fatores de crescimento. É responsável pela produção de álcool 
 (bioetanol) para uso industrial e conhecidas também por seu papel na produção de 
 bebidas alcoólicas. Além disso, outra aplicação interessante é a utilização dessas 
 para a produção heteróloga de proteínas intra e extracelulares de plantas, animais e 
 humanos (ABREU et al., 2015). 
 Para a obtenção de etanol, a utilização da Saccharomyces cerevisiae 
 continua sendo a mais adequada, pois por se tratar de processos não estéreis, 
 necessita-se de um microrganismo “rústico”, capaz de suportar condições drásticas. 
 Além disso, essas leveduras possuem uma alta eficiência fermentativa, um 
 crescimento rápido, eficiente metabolização de açúcares, habilidade na produção e 
 consumo de etanol, tolerância a altas concentrações do produto e baixos níveis de 
 oxigênio, osmotolerância, tolerância a variações grandes de temperatura e atividade 
 celular em ambientes ácidos (REIS, 2011). 
 Diferenças substanciais entre linhagens dessa espécie justificam a seleção 
 de linhagens mais apropriadas para o ambiente de fermentação alcoólica industrial, 
 existindo atualmente o fornecimento por unidades produtoras de biomassa de 
 grandes volumes de leveduras previamente isoladas durante o período de safra, 
 sendo essas chamadas de leveduras selecionadas. Essas são selecionadas com 
 base na sua produção de glicerol e trealose em condições de estresse (REIS, 2011). 
 2.2 Caldo-de-cana 
 O caldo-de-cana é constituído em torno de 75-82% por água e sólidos totais 
 dissolvidos (18-25%). Dentre esses sólidos, estão os açúcares, tais como a 
 sacarose (14,5-23,5%), a glucose e a frutose e os não-açúcares orgânicos 
 (0,8-1,5%) e inorgânicos (0,2-0,7%). Os não-açúcares orgânicas são proteínas, 
 aminoácidos, amidas, gorduras e ceras, pectina, ácidos, matérias corantes e os 
 inorgânicos são minerais como a sílica e potássio, em sua maior parte (PRATI, 
 2008). 
 O caldo é considerado como um líquido opaco, viscoso, variando de cor 
 parda ao verde escuro, cuja composição varia de acordo com a idade, variedade e 
 salinidade da planta de cana, condições climáticas, planejamento agrícola, pragas e 
 doenças. A bebida apresenta uma proporção de sólidos compreendida entre 15 e 
 25º Brix e o pH do caldo é de caráter pouco ácido, variando entre 5 e 6 (PRATI, 
 2008). 
 Então, por ser uma bebida rica em açúcares e de baixa acidez, torna-se 
 muito suscetível à deterioração, principalmente por leveduras, resultando em uma 
 fermentação (PRATI, 2008). 
 2.3 Processo de Fermentação em Batelada Submerso 
 As fermentações descontínuas, ou também conhecidas como fermentações 
 por batelada, vêm sendo utilizadas pelo homem desde a Antiguidade, e hoje ainda 
 são as mais empregadas para obtenção de diversos produtos fermentados. 
 Inicialmente, na solução nutriente esterilizada são inoculados e incubados os 
 microrganismos, permitindo que a fermentação ocorra sob condições ótimas. No 
 decorrer do processo nada é adicionado, com exceção de oxigênio, no caso de 
 processos aeróbicos, antiespumante, e ácido ou base para o controle do pH. Uma 
 das características desse processo, é então, o volume constante. Essa fermentação 
 pode levar a baixos rendimentos quando o substrato é adicionado de uma só vez, 
 pois esse pode exercer efeitos de inibição, repressão ou desvio do metabolismo 
 celular a produtos que não são de interesse. Além disso, apresenta “tempos 
 mortos”, ou seja, tempos no qual o fermentador não está sendo utilizado para a 
 fermentação, mas sim para carga e descarga de materiais e também o período 
 correspondente à lavagem e esterilização do equipamento (SCHMIDELL et al., 
 2001). 
 Por outro lado, apresenta vantagens como menores riscos de contaminação, 
 grande flexibilidade de operação por poder utilizar o mesmo fermentador para a 
 produção de diferentes produtos, condições de controle mais estreito da 
 estabilidade genética do microrganismo e a possibilidade de realizar fases 
 sucessivas no mesmo recipiente, isto é, sem necessidade de transferir o material 
 para outro fermentador (SCHMIDELL et al., 2001). 
 Existe ainda, o processo descontínuo alimentado, que é definido como uma 
 técnica em processos microbianos, onde um ou mais nutrientes são adicionados ao 
 fermentador durante o cultivo e em que os produtos permanecem ali até o final da 
 fermentação. Em alguns casos, todos os nutrientes são adicionados gradualmente à 
 dorna. Para outros autores, é estendido esse conceito para o acréscimo de aditivos, 
 tais como precursores de produtos. A vazão de alimentação pode ser constante ou 
 variar de acordo com o tempo e a adição de mosto pode ser contínua ou 
 intermitente. Nesse, a mudança de volume pode ocorrer, dependendo da taxa de 
 evaporaçãodo sistema e da concentração de substrato (SCHMIDELL et al., 2001). 
 Uma vantagem desse processo é que devido à flexibilidade de utilização de 
 diferentes vazões para a adição do meio nutriente, torna-se possível controlar a 
 concentração de substrato no fermentador, de modo a interferir no metabolismo 
 microbiano, para que seja alternada para a via metabólica desejada, levando ao 
 acúmulo de um produto específico. Também, cada condição de trabalho pode levar 
 a diferentes perfis de concentração de substrato, células e produtos. Além disso, 
 esse processo é muito satisfatório quanto à operação e eficiência de conversão de 
 açúcares a álcool (SCHMIDELL et al., 2001; PACHECO, 2010). 
 A produção industrial de etanol se classificam em processos de batelada e 
 contínuos, sendo para essa finalidade utilizado o processo em batelada do tipo 
 alimentado. A nível industrial, os biorreatores, também chamados dornas, são 
 reatores de aço do tipo tanque agitado, normalmente fechadas e mantidas a uma 
 temperatura de 33 a 35ºC até o fim do processo, quando a concentração de etanol 
 se situa entre 7 e 12º GL. No início da fermentação são utilizadas altas 
 concentrações celulares, de cerca de 10^7 células/mL. Ao final da fermentação a 
 concentração atinge valores de 10 a 100 vezes maiores que o inicial (PACHECO, 
 2010). 
 2.4 Fatores que afetam a fermentação alcoólica 
 Diversos fatores físicos, químicos e microbiológicos afetam o rendimento da 
 fermentação e a eficiência da conversão de açúcar em etanol. Durante os processos 
 fermentativos, a levedura pode estar exposta a diversos fatores estressantes. 
 Dentre esses fatores, os mais frequentemente citados são a concentração de teores 
 alcoólicos, a temperatura elevada, a acidez do meio (inclusive no tratamento ácido), 
 a presença de sulfito, a contaminação bacteriana e a contaminação com leveduras 
 não Saccharomyces (PACHECO, 2010). 
 A faixa de temperatura para o processo de fermentação alcoólica é de 25 a 
 36ºC, sendo que abaixo dessa pode-se retardar o processo e acima pode ocasionar 
 a evaporação do álcool produzido e pode favorecer o surgimento de contaminações. 
 O pH ideal para favorecer a multiplicação da levedura e inibir o aparecimento de 
 outros microrganismos está entre 4,0 e 5,0. Nos mostos industriais o pH está entre 
 4,5 e 5,5 (PACHECO, 2010). 
 3. Metodologia 
 Para realização da técnica, foi utilizada a levedura Amanda como inóculo. 
 Inicialmente foi feita a contagem de células da solução a partir de uma câmara de 
 Neubauer. Uma vez efetuada a contagem de células e que constatou-se que a 
 amostra estava viável para continuar com a técnica foi separado 150 mL dessa 
 solução e essa foi introduzida em 1,5L de solução de caldo de cana, previamente 
 autoclavado, para que a levedura se reproduzisse no caldo e fosse possível a 
 determinação da cinética. Esse caldo foi levado a um shaker onde permaneceu sob 
 agitação constante por 8 horas e depois foi separado em frascos pequenos, 
 esterilizados com álcool, para realização das medições de acordo com os tempos 
 para estudo da cinética: pré-inóculo, tempo 0, 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7 e 8 divididos em 5h 
 de intervalo. 
 Após a realização das separações foi efetuada a análise de contagem de 
 células ao longo do tempo novamente com auxílio de uma câmara de Neubauer e 
 posteriormente foram feitas também análises de pH e Brix. Após essas medições 
 foram feitas análises para mensurar a obtenção de álcool proveniente da 
 fermentação. 
 4. Resultados e Discussão 
 Em relação ao estudo das curvas cinéticas do primeiro experimento, visando 
 a produção de células para posterior fermentação alcoólica, os resultados obtidos 
 não foram satisfatórios, tendo os valores de R da contagem, pH e Brix de 0,83; 0,64 
 e 0,79, respectivamente. Esses valores foram gerados pela equação de primeira 
 ordem, equação essa que apresentou maiores Rs. Como todos esses se 
 apresentaram abaixo de 0,90, tem-se um resultado relativamente ruim, que pode 
 acarretar em uma fermentação alcoólica com um rendimento menor que o desejado. 
 Para a fermentação alcoólica, os dados do estudo de cinética se mostraram 
 mais promissores, tendo na equação de primeira ordem os melhores valores de R, 
 sendo esses, para a contagem, pH e Brix, de 0,8916; 0,8352 e 0,91, considerados, 
 então, valores próximos ou acima de 0,90, mostrando-se um processo fermentativo 
 eficiente. A quantidade de células aumentou, porém não de forma expressiva, assim 
 apresentando resultados fora do padrão, pois deveria ter uma concentração por 
 volta de 10 vezes maior, no mínimo. O pH e o Brix diminuíram significativamente de 
 acordo com os estudos e os gráficos 2 e 3, provando a conversão de açúcares em 
 etanol. 
 Além disso, a produção de etanol nessa fermentação de 44h foi de 4,4% em 
 volume, ou seja, 66 mL de álcool. Assim, poder-ia-se ter um rendimento mais alto se 
 o processo todo tivesse apresentado bons resultados, o que não aconteceu devido 
 aos problemas mostrados no estudo cinético de produção das leveduras. A seguir 
 estão dispostos os gráficos resultantes do estudo durante a fermentação alcoólica. 
 Gráfico 01: equação de primeira ordem para contagem de células. 
 Gráfico 2: equação de primeira ordem para o pH do processo. 
 Gráfico 3: equação de primeira ordem para o Brix do processo. 
 5. Conclusão 
 A partir desse trabalho podemos entender de que forma melhorar as 
 variáveis que interferem no problema de fermentação, podendo dessa forma criar 
 sistemas de trabalho com melhorias, buscando garantir resultados mais efetivos 
 para a técnica. A importância da fermentação faz com que os processos devam ser 
 estudados de forma a serem sempre implementados de acorodo com o 
 microrganismo utilizado. No trabalho os resultados se mostraram insatisfatórios ou 
 medianos, coisa que para um processo industrial é danoso e pode oferecer riscos 
 elevados pensando no sustento de um comércio. 
 Assim sendo, entendemos a necessidade de adaptação do microrganismo e 
 otimização do meio e procedimento para obtenção de melhores resultados. 
 REFERÊNCIAS 
 ● ABREU, Jéssica Aline Soares de; ROVIDA, Amanda Flávia da Silva; 
 PAMPHILE, João Alencar. Fungos de Interesse: Aplicações 
 Biotecnológicas. Revista Uningá Review. Vol. 21, n.1, p. 55-59. Jan - Mar 
 2015. 
 ● BORZANI, Walter; LIMA, Urgel de Almeida; AQUARONE, Eugênio. 
 Engenharia bioquímica. São Paulo: E. Blücher, 2001. 300 p. Biotecnologia; 
 v. 2. 
 ● N.J.W, Kreger-van Rij. The Yeasts: A Taxonomy Study. 3. ed. Groningen, 
 The Netherlands. Elsevier Science Publishers B. V. Amsterdam. 1984. 
 ● PACHECO, Thályta Fraga. Fermentação Alcoólica com leveduras de 
 características floculantes em reator tipo torre com escoamento 
 ascendente . Universidade Federal de Uberlândia, 2010. 
 ● PRATI, Patricia; CAMARGO, Gisele Anne. Características do Caldo de 
 Cana e sua influência na estabilidade da bebida. BioEng, Campinas, v. 2, 
 n. 1, p. 37-44. jan/abr 2008. 
 ● REIS, Vanda Renata. Caracterização de linhagens selvagens deSaccharomyces cerevisiae isoladas de processos fermentativos para 
 produção de etanol. Piracicaba, 2011. Dissertação (Mestrado) - Escola 
 Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, 2011.