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1. INTRODUÇÃO
Os microrganismos assim como outros organismos vivos precisam obter nutrientes apropriados do seu meio ambiente. Portanto, se queremos cultivar e manter microrganismos vivos em laboratório, é preciso colocar os microrganismos em meios de cultura, contendo os nutrientes necessários para o seu crescimento. [1]
Um meio de cultura é um substrato nutritivo capaz de permitir a nutrição e o crescimento dos microrganismos (bactérias, fungos, algas, parasitas) fora do seu ambiente biológico natural, ou seja, é uma preparação de nutrientes utilizada para o crescimento de microrganismos em laboratório. [2]
	A sobrevivência e o crescimento dos microrganismos dependem de um adequado suprimento de nutrientes e de um ambiente físico favorável. No entanto, há uma grande diversidade de necessidades nutricionais e ambientais entre os microrganismos e por isso é que só compreendendo as suas necessidades que se consegue ter sucesso na cultura de microrganismos no laboratório. [2]
	Os meios de cultura dividem-se em meio sólidos e semi-sólidos, que são aqueles que contêm agar, e os meio líquidos, sem agar. Ambos os meios são preparados com água destilada, aquecidos até que se dissolvam completamente e posteriormente esterilizados por autoclavagem a 121oC. [1]
	Agar é o agente solidificante mais utilizado pelos microbiologistas. Ele liquefaz-se a cerca de 100º C (o ponto de liquefacção é aos 96º C) mantendo-se nesse estado fundido até aos 42º C quando passa a gel sólido. Assim, os microrganismos, principalmente os patogénicos, podem ser cultivados a 37º C ou a temperaturas ligeiramente mais altas sem o meio de cultura se liquefazer durante a incubação. Por outro lado, como a maior parte dos microrganismos não morre a 45º C, podem ser adicionados ao meio fundido antes deste ser colocado em tubos ou placas de Petri para solidificar. [3]
	Nos meios sólidos o crescimento para por exaustão de nutrientes, devendo realizar-se a transferência de colónias para novo meio. No entanto, estes meios permitem a individualização das colónias. Os meios líquidos permitem melhor difusão de metabólitos, mas não o isolamento de colónias. [2]
Embora os meios sejam vendidos esterilizados, na fase de rehidratação deixam de o ser e então é necessário esterilizá-los de novo para evitar a presença de microrganismos contaminantes e de outras formas de vida. O método de esterilização utilizado é condicionado pela composição do meio de cultura. [1]
A esterilização dos meios de cultura pode ser feita na autoclave, que é a aplicação do calor úmido sob pressão. O calor húmido é o método mais efetivo para matar os microrganismos, pois causa desnaturação e coagulação das proteínas vitais como as enzimas. A maneira mais prática de aplicar o calor húmido é através da autoclave, que consiste num sistema fechado de volume constante em que um aumento de pressão permite um aumento de temperatura. A autoclave permite temperaturas altas, um aquecimento mais rápido e uma grande penetração de calor. É neste aparelho que se esterilizam por rotina os meios de cultura, soluções e materiais contaminados. Normalmente a esterilização dos meios de cultura faz-se por exposição ao vapor a 121º C e 15 lbs de pressão durante 15 minutos ou mais, dependendo do tipo de material a esterilizar. [4]
Após autoclavagem, os meios sólidos vertem-se em placas de Petri de forma a cobrir uniformemente o fundo da caixa e após solidificação guardam-se por 24h na estufa a 37,0 oC para testar a sua esterilidade e em seguida no frigorifico até à altura das sementeiras. Os meios sólidos podem também ser vertidos em tubos de ensaio de vidro. Os meios líquidos são mantidos em tubos de ensaio de vidro (os meios ditos sólidos estão líquidos quando saem do autoclave e solidificam após o arrefecimento). [2]
Após verter liquido em uma placa de Petri é necessário incubar o meio num ambiente adequado aos requisitos de crescimento dos microrganismos, a fim de comprovar a esterilidade do meio. O crescimento de bactérias num meio liquido identifica-se por turvação do meio, formação de uma película na sua superfície, ou aparecimento de sedimento, enquanto que num meio sólido por aparecimento de colónias. Os meios líquidos são designados de caldos (broth). Os meios sólidos podem ainda ser vertidos em tubos de ensaio de vidro, os quais são inclinados, de modo a que, durante a solidificação do meio, se forme um slope ou slant. Este slant oferece uma superfície adequada ao cultivo de microrganismos aeróbios e anaeróbios facultativos. [2]
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
· Preparar meios de cultura no laboratório de microbiologia
2.2. Objetivos Específicos 
· Familiarizar-se com as técnicas de preparo de meio de cultura;
· Entender e utilizar uma autoclave
· 
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais Utilizados
· 
· Placa de Petri (12);
· Tubos de Ensaio (4);
· Proveta de 100,0 mL;
· Bico de Bunsen;
· Tripé
· Tela de Amianto
· Béquer de 50,0 mL (2);
· Erlenmeyer de 500 mL (2)
· Bastão de Vidro;
· Suporte para tubos de ensaio
· Autoclave
3.2 Reagentes Utilizados
· Batata-Dextrosa-Agar (BDA);
· Agar Nutriente (AN);
· Água destilada;
3.3 Procedimento Exeperimental
	Foram utilizados 2 tubos de ensaio e 6 placas de Petri para o modo de cultura BDA e 2 tubos de ensaio e 6 placas de Petri para o modo de cultura An. Como seriam necessários 10,0 mL para cada placa de Petri e cada tubo de ensaio, e como cada um dos modos de cultura foi preparado para duas equipes, sendo cada equipe responsável pelo preparo de um modo de cultura, foi necessário preparar 250,0 mL de BDA e 250,0 mL de AN. Contudo, ao retirar as placas de Petri do invólucro de papel onde elas estavam guardadas após a esterilização feita no experimento 3, notou-se que só haviam 10 placas de Petri, logo, o experimento foi feito com apenas essas placas.
· Seguindo as instruções contidas no rótulo do BDA tem-se:
Diluir 39,0 gramas do meio em 1000 mL de água destilada, como se tem como o objetivo a obtenção de 250,0 mL seriam necessário apenas 9,75g.
· Seguindo as instruções contidas no rótulo do NA tem-se:
Diluir 28,0 gramas do meio em 1000 mL de água destilada, como se tem como o objetivo a obtenção de 250,0 mL seriam necessário apenas 7,0g.
· 
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
A autoclave nesse experimento foi utilizada para fazer a esterilização do meio preparado, pois este equipamento utiliza o calor úmido sob pressão, que é o método mais efetivo para matar os microrganismos, pois causa desnaturação e coagulação das proteínas vitais como as enzimas.
As placas de Petri e os tubos de ensaio foram colocados em uma incubadora de crescimento porque este é um equipamento cuja finalidade é manter a vida em desenvolvimento estável e com menos riscos de agressão ao meio externo, e proporciona também um ambiente termicamente neutro, através do controle da temperatura e da umidade relativa do ar em níveis aceitáveis para as culturas BDA e AN.
Após uma semana, as placas de Petri e os tubos de ensaio foram retirados das estufas de crescimento, a fim de fazer a comprovação de esterilidade. Observou-se que em duas placas que continham BDA houve uma mudança de cor e o crescimento de alguma colônia, ou seja, houve contaminação. Observou-se também que no tubo de ensaio inclinado que continha o meio Ágar Nutriente (AN) houve uma mudança de cor e o crescimento de alguma colônia. Essas observações podem ser vistas nas Figuras 1, 2, 3 e 4.
 Figura 2: Contaminação na Placa de Petri 1 com BDA
Figura 1: Contaminação na Placa de Petri 1 com BDA
 Figura 4: Contaminação no Tubo de ensaio inclinado com AN
Figura 3: Contaminação na Placa de Petri 2 com BDA
	Essa contaminação pode ser explicada pela inabilidade de se transferir os meios de cultura para as placas de Petri e os tubos de ensaio, assim como a dificuldade em se trabalhar na zona de segurança do bico de Bunsen, ou pode-se ter esquecido de flambar a boca do erlenmeyer após a retirada e antes de colocar a bucha para a transferência do meio, a o que pode ter feito com o meio entrasseem contato com o ar, e consequentemente com os microrganismos presentes no ambiente.
5. CONCLUSÃO
Ao final deste experimento foi possível compreender a importância dos métodos de assepsia, pois esses métodos são utilizados para impedir a penetração dos organismos nos meio de cultura BDA e AN que foram preparados, e como foi observado um erro nesse método pode acarretar na contaminação dos meios.
As contaminações observadas podem ser explicadas pela falta de habilidade de se transferir meio de cultura para os tubos de ensaio e para as placas de Petri, assim como a dificuldade em se trabalhar em área de aproximadamente10,0 cm ao redor da chama de Bunsen. Pode-se também ter esquecido de flambar a boca do erlenmeyer no pico de Bunsen após a retirada da bucha e antes de colocá-la após a transferência dos meios de culturas. Esses fatores podem ter feito os meios BDA e AN entrassem em contato com o ar, contaminando-os, acarretando no crescimento de algum microrganismo.
6. REFERÊNCIAS
[1] Prática 2: Cultura de Microrganismo. Disponível em: <http://www3.uma.pt/gcosta/docs/microbiology/prat2.pdf>. Acesso em: 28 de outubro de 2013.
[2] Cultura de Microrganismos – necessidades nutritivas. Disponível em: < users.med.up.pt/cc04-10/micropratica/micro_p_3.doc> . Acesso em: 28 de outubro de 2013. 
[3] SALVATORI, R. U.; WOLF, G.A.K. Laboratório de Microbiologia: normas gerais, instruções de trabalho e Procedimentos Operacionais Padrões (POP). Editora UNIVATES: Lajeado, 2013.
[4] NOGAROTO, S.L.; PENNA, T.C.V.; MARTINS, A.M.S. Validação de Processos de Esterilização. Disponível em: < http://www.fcf.usp.br/Departamentos/FBT/HP_ Professores/Penna/Projetos/NogarotoPenna04.pdf>. Acesso em: 29 de outubro de 2013.
7. ANEXO
7.1 Questionário
7.1.1 Como se prepara um meio de cultura em um laboratório de microbiologia?
	Para se preparar um meio sólido, que é o caso do meio agar feito na prática, segue-se os seguintes passos:
1. Prepara-se 250,0 mL do meio de cultura conforme as especificações do rótulo de cada meio;
2. Colocar o meio de cultura em um erlenmeyer, que foi fechado com uma bucha, e esterilize-o em uma autoclave a 121,0 oC por 15 min;
3. Após a esterilização, esperar esfriar o meio até aproximadamente 50,0 oC e em condições de assepsia (junto à chama do bico de Bunsen) transferir 10,0 mL para as placas de Petri e os tubos de ensaio esterilizados;
4. Deixar esfriar e virar as placas;
5. Guardar as placas e os tubos em uma incubadora de crescimento.
7.1.2 Os objetivos e procedimentos a desenvolver na prática
Objetivos:
· Preparar meios de cultura no laboratório de microbiologia
· Familiarizar-se com as técnicas de preparo de meio de cultura;
· Entender e utilizar uma autoclave
Procedimentos a desenvolver na prática:
	Está explicado no item 3.3 (Procedimento experimental)
Pesou-se aproximadamente 7,0g de AN
Essa massa foi transferida para um erlenmeyer
Adicionou-se 250,0 mL de água destilada
Essa solução foi aquecida com uma frequente agitação para facilitar a diluição
O erlenmeyer foi fechado com uma "bucha"
Colocou-se o erlenmeyer em uma autoclave por 15 min (a 121oC e 15 lbs de pressão)
Deixou-se esfriar até 50oC
Distribui-se 10,0 mL de meio em cada um das seis placas e dos 2 tubos de ensaio
Armazenou-se as placas de petri e os tubos de ensaio, sendo 1 tubo de ensaio reto e outro inclinado
Incubou-se as placas de Petri e os tubos de ensaio em uma estufa à 37oC
Trabalhando-se em uma área de aproximadamente 10 cm ao redor da chama do bico de Bunsen
Pesou-se aproximadamente 9,7539 g de BDA
Essa massa foi transferida para um erlenmeyer
Adicionou-se 250,0 mL de água destilada
Essa solução foi aquecida com uma frequente agitação para facilitar a diluição
O erlenmeyer foi fechado com uma "bucha"
Colocou-se o erlenmeyer em uma autoclave por 15 min (a 121oC)
Deixou-se esfriar até 50oC
Distribui-se 10,0 mL de meio em cada um das seis placas e dos 2 tubos de ensaio
Armazenou-se as placas de petri e os tubos de ensaio, sendo 1 tubo de ensaio reto e outro inclinado
Incubou-se as placas de Petri e os tubos de ensaio em uma estufa à 27oC
Trabalhando-se em uma área de aproximadamente 10 cm ao redor da chama do bico de Bunsen