Apostila de aulas praticas

•

UFPEL

Leonardo de Oliveira

23/04/2024

E aí, curtiu este material?

Ajude a incentivar outros estudantes a melhorar o conteúdo

Gostou desse material? Compartilhe! 🧡

Microbiologia

75.239 Materiais compartilhados

Baixe o app para aproveitar ainda mais

Leia os materiais offline, sem usar a internet. Além de vários outros recursos!

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA

NOME _______________________________________________________
MATRICULA ___________________________

2022.2
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

APRESENTAÇÃO

1. SEGURANÇA LABORATORIAL
Pode ser definida como sendo um
conjunto de ações voltadas para a
prevenção, minimização ou eliminação de
riscos inerentes a estas atividades e que
podem comprometer a saúde do homem,
dos animais, do meio ambiente ou a
qualidade dos trabalhos desenvolvidos.
A rotina do Laboratório de
Microbiologia envolve exposição tanto
com material clínico e reagentes químicos
como com potenciais agentes patogênicos
concentrados em meio de cultura. Assim
profissionais da área de saúde e outros
trabalhadores que exercem suas
atividades em laboratórios, estão sob risco
de desenvolver doença por exposição a
agentes infecciosos, produtos químicos
tóxicos e inflamáveis, entre outros.
Fonte: Segurança e Controle de Qualidade
no Laboratório de Microbiologia Clínica
Modulo II em
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/
manuais/microbiologia/mod_2_2004.pdf
O laboratório de aulas práticas de
Microbiologia é classificado como NÍVEL 1
DE BIOSSEGURANÇA (NB-1) OU
PROTEÇÃO BÁSICA (P1)
CLASSIFICAÇÃO DOS LABORATÓRIOS
SEGUNDO O NÍVEL DE BIOSSEGURANÇA
NÍVEL 1 DE BIOSSEGURANÇA (NB-1) OU
PROTEÇÃO BÁSICA (P1)
As práticas, o equipamento de
segurança e o projeto das instalações são
apropriados para o treinamento
educacional secundário ou para o
treinamento de técnicos, e de professores
de técnicas laboratoriais. É adequado ao
trabalho que envolva agente com o menor
grau de risco para o pessoal do laboratório
e para o meio ambiente. Bacillus subtilis,
Naegleria gruberi, o vírus da hepatite
canina infecciosa e organismos livres sob
as Diretrizes do NIH (National Institute of
Health) de DNA Recombinantes são
exemplos de micro-organismos que
preenchem todos estes requisitos
descritos acima. Muitos agentes que
geralmente não estão associados a
processos patológicos em homens são,
entretanto, patógenos oportunos e que
podem causar uma infecção em jovens,
idosos e indivíduos imunossuprimidos ou
imunodeprimidos. As cepas de vacina que
tenham passado por múltiplas passagens
in vivo não deverão ser consideradas não
virulentas simplesmente por serem cepas
de vacinas. O laboratório, neste caso, não
está separado das demais dependências
do edifício. O trabalho é conduzido, em
geral, em bancada. Os equipamentos de
contenção específicos não são exigidos. O
pessoal de laboratório deverá ter
treinamento específico nos
procedimentos realizados no laboratório e
deverão ser supervisionados por cientista
com treinamento em microbiologia ou
ciência correlata.
Fonte: Segurança e Controle de Qualidade
no Laboratório de Microbiologia Clínica
Modulo II em
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/
manuais/microbiologia/mod_2_2004.pdf
As aulas práticas de Microbiologia
têm como objetivo ensinar ao acadêmico
os princípios gerais e métodos utilizados
no estudo prático de Microbiologia.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

Nestas aulas serão utilizados fungos e
bactérias, sendo alguns destes
potencialmente patogênicos para
humanos, portanto, é essencial que as
normas sejam seguidas, a fim de se evitar
contaminações acidentais.
01. Uso de jaleco é obrigatório
02. É proibido comer, beber ou fumar
no laboratório
03. Antes de entrar no laboratório de
aulas praticas, o(a) acadêmico(a)
deve vestir o jaleco, e se certificar
de que este esteja limpo.
04. Cabelos longos devem estar
presos, de forma-se a não tocarem
em reagentes ou chama, durante
os procedimentos.
05. Estar calçado com sapatos
fechados.
06. Limpar e desinfetar a superfície
das bancadas antes e ao término
das aulas práticas.
07. Fazer adequada antissepsia das
mãos, ao entrar e ao sair do
laboratório. Observação: se
houver algum ferimento nas mãos,
avisar o(a) professor(a) regente,
para que seja conduzido o melhor
procedimento para assegurar a
segurança.
08. Na bancada de trabalho, não deve
haver acúmulo de material,
deixando-se apenas o
indispensável para ser utilizado
antes de iniciar a aula. OBS.
Estojos, cadernos de outras
disciplinas, celulares e
computadores devem estar fora
da área de trabalho.
09. No caso de derramamento de
material contaminado, proceder
imediatamente a desinfecção.
10. Manter canetas, lápis, dedos longe
da boca.
11. Não utilizar material de uso
pessoal para limpar os objetos de
trabalho.
12. Em caso de contaminação
acidental, comunicar
imediatamente o(a) professor(a).
13. Depositar todo o material utilizado
a ser descartado em recipiente
adequado e jamais deixá-los sobre
as bancadas.
14. Flambar as alças e agulhas
microbiológicas, bem como pinças
antes e após o uso.
15. Após as leituras, os cultivos, serão
armazenados em refrigeradores
ou esterilizados, portanto não é
permitido seu conteúdo nas pias.
16. Ao acender o pico de Bunsen,
verificar se não há vazamento de
gás ou substancias inflamáveis
(por ex. álcool), por perto.
17. Antes de abandonar o laboratório,
em condições de rotina, verificar
se o ponto de gás e as torneiras
estão fechados.
18. Não comece a trabalhar antes de
receber as instruções. Cada aula
deve ser iniciada pelo(a)
professor(a), como uma breve
explanação.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

Quando procedente, trabalhe sempre próximo a chama, com posicionamento desta
entre você e o material biológico analisado

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

HIGIENIZAÇÃO DE MÃOS
É a medida individual mais simples
e menos dispendiosa para prevenir a
propagação das infecções relacionadas à
assistência à saúde. Recentemente, o
termo “lavagem das mãos” foi substituído
por “higienização das mãos” devido à
maior abrangência deste procedimento. O
termo engloba a higienização simples, a
higienização antiséptica, a fricção anti-
séptica e a anti-sepsia cirúrgica das mãos.
PORQUE REALIZAR A HIGIENIZAÇÃO DAS
MÃOS FREQUENTEMENTE
As mãos constituem a principal via
de transmissão de microrganismos
durante a assistência prestada aos
pacientes, pois a pele é um possível
reservatório de diversos micro-
organismos, que podem se transferir de
uma superfície para outra, por meio de
contato direto (pele com pele), ou
indireto, através do contato com objetos e
superfícies contaminados.
A pele das mãos alberga,
principalmente, duas populações de
microrganismos, os pertencentes à
microbiota residente e à microbiota
transitória.
A microbiota residente (ou
indígena ou endógena) é constituída por
micro-organismos de baixa virulência,
como estafilococos, corinebactérias e
micrococos, pouco associados às infecções
veiculadas pelas mãos. É mais difícil de ser
removida pela higienização das mãos com
água e sabão, uma vez que coloniza as
camadas mais internas da pele.
A microbiota transitória coloniza a
camadamais superficial da pele, o que
permite sua remoção mecânica pela
higienização das mãos com água e sabão,
sendo eliminada com mais facilidade
quando se utiliza uma solução anti-
séptica. É representada, tipicamente,
pelas bactérias Gram-negativas, como
enterobactérias (Ex: Escherichia coli),
bactérias não fermentadoras (Ex:
Pseudomonas aeruginosa), além de
fungos e vírus.
Os patógenos hospitalares mais relevantes
são:
Apresente a
morfologia
Staphylococcus
aureus

Staphylococcus
epidermidis

Enterococcus spp
Pseudomonas
aeruginosa

Klebsiella spp
Enterobacter spp
leveduras do
gênero Candida

As infecções relacionadas à assistência à
saúde geralmente são causadas por
diversos microrganismos resistentes aos
antimicrobianos, tais como
Staphylococcus aureus e S. epidermidis,
resistentes a oxacilina/meticilina;
Enterococcus spp., resistentes à
vancomicina; representantes da família
Enterobacteriaceae, resistentes a
cefalosporinas de 3ª geração e
Pseudomonas aeruginosa, resistentes a
carbapenêmicos.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

ATIVIDADE PRATICA 1
OBSERVAÇÃO DA AÇÃO
GERMICIDA DA LUZ UV FRENTE A
BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS E
GRAM NEGATIVAS E LEVEDURAS.
INTRODUÇÃO
A radiação UV, emitida por
lâmpadas especiais, é um mecanismo
físico no qual a inativação microbiana
ocorre pela absorção da luz que promove
uma reação fotoquímica capaz de alterar
componentes moleculares essenciais para
as funções celulares, causando danos nos
ácidos nucléicos (DNA e RNA) dos micro-
organismos, inativando-os (UNITED
STATES ENVIRONMENTAL PROTECTION
AGENCY, 1999).
A luz UV é parte do espectro
eletromagnético situada entre a luz visível
e raio-X. A porção específica desse
espectro situada entre 185-400nm
(conhecida como UV-C) tem um efeito
germicida forte, com pico de efetividade
em 265nm. Nesses comprimentos de
ondas, a luz UV elimina micro-organismos
penetrando nas membranas de suas
células e danificando o DNA, tornando-os
incapazes de se reproduzirem e matando-
os.

ESCALA NANOMÉTRICA DE
COMPRIMENTO DE ONDAS

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

MECANISMO GERMICIDA
A luz U.V. é absorvida pelas bases
púricas e pirimídicas dos ácidos nucleicos

• A luz ultra-violeta é efetiva na
inativação de vírus.
• Porém bactérias tem sistema de
reparo do DNA

A radiação UV apresenta como principais
vantagens:
 simplicidade operacional,
 requisito mínimo de área para
implementação,
 custo relativamente baixo,
 pouca exigência de operação e
manutenção,
 eficácia de inativação para grande
variedade de microrganismos,
 Ausência do uso de produtos
químicos e de geração de
subprodutos tóxicos.
A efetividade dos sistemas de desinfecção
com radiação UV depende de fatores
como:
 Intensidade de radiação,
 Tempo de exposição dos
microrganismos,
 Configuração do reator,
 Características do líquido a ser
desinfetado

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

PROPOSTA DE TRABALHO
Micro-organismos a serem estudados
- Micro-organismos presentes no ar,
coletados a partir de exposição direta de
meios de cultura, por tempo determinado
Ubiquidade é a qualidade de estar ou existir
concomitantemente em todos os lugares, pessoas e
coisas. Teologicamente esta qualidade é atribuída
à Deus, ou consciência cósmica, como preferir
chamar. Mas a Microbiologia atribui esta
qualidade aos micro-organismos, pois raramente
haverá um ambiente no planeta Terra que seja
estéril, ou seja, ausente de micro-organismos, de
forma natural.
Se formos desbravar os ambientes
terrestre coletando amostras microbiológicas de
qualquer lugar ou superfície, vamos encontrar
micro-organismos nas mais diversas condições
ambientais terrenas.
MATERIAL POR GRUPO
- 3 placas de Petri, contendo ágar
nutriente
ESQUEMA DE PROCEDIMENTO
 Em ambiente externo ao laboratório,
abra as placas de petri, expondo o
meio de cultura à contaminação
ambiental, por 5 minutos. Observação
não toque na superfície dos meios de
cultura.
 Após decorrido o tempo proposto,
feche as placas, contendo os meios de
cultura submetidos à exposição
ambiental, e traga as mesmas para o
laboratório onde será realizada a
experimentação da degermação por
UV germicida.
 Anote os nomes dos componentes da
dupla, e identifique as placas da
seguinte maneira
ex.

João F e Maria B
Controle

João F e Maria B

João F e Maria
B

 Submeta os meio de cultura à
exposição direta da radiação UV,
conforme os tempos estipulados.
 Após a exposição, acondicione os
meios em estufa de incubação
microbiana, o qual deverão ser
mantidos por 48 horas.
 Na próxima aula prática, realize as
leituras macroscópicas dos
resultados.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

Leitura
Os resultados obtidos foram os esperados,
inicialmente? Apresente suas considerações,
de acordo com os resultados obtidos, e faça
proposta de novos experimentos,
considerando os resultados obtidos.
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
_

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

LEITURA COMPLEMENTAR
Fonte: https://www2.ifsc.usp.br/portal-
ifsc/equipamentos-desenvolvidos-no-ifsc-usp-descontaminam-superficies/
Equipamentos desenvolvidos no IFSC/USP
descontaminam superfícies “Surface UV” na
desinfecção de pequenas superfícies Através
de uma parceria entre o Centro de Pesquisa
em Óptica e Fotônica (CEPOF) do Instituto de
Física de São Carlos (IFSC/USP) e a empresa
MMO, com o apoio do Laboratório de Apoio
Tecnológico, coordenado pelo docente e
pesquisador do IFSC/USP, Prof. Vanderlei
Bagnato, e contando com a participação de
diversos pesquisadores e engenheiros, foram
recentemente desenvolvidos dois dispositivos
para descontaminação de superfícies. O
primeiro equipamento, ao qual foi dado o
nome de Surface UV, pode ser utilizado como
uma alternativa na desinfecção de pequenas
superfícies, instrumentos, e até mesmo de
pequenos locais, tendo como principal
objetivo inativar microrganismos e reduzir a
disseminação dos mesmos, controlando a
incidência de infecções nos ambientes. Por
outro lado, um outro equipamento ainda em
testes finais no IFSC/USP, tem a mesma
finalidade, só que o foco é a descontaminação
de grandes superfícies – pisos, paredes,
grandes superfícies em vidro, etc.. Prototipo
de novo equipamento para desinfecção de
grandes superfícies (em testes) O
desenvolvimento destes novos aparelhos vem
ao encontro do aumento registrado na
propagação dos vírus da gripe – dentre eles o
COVID-19 -, sendo cada vez maior a
necessidade de introduzir novos métodos
para descontaminação de ambientes e
superfícies para evitar que a contaminação se
propague com maior rapidez. Em relação aos
processos de desinfecção, existem vários
métodos químicos e físicos capazes de destruir
a forma vegetativa dos microrganismos nos
ambientes. No entanto, um procedimento que
tem mostrado segurança e eficácia na
inativação dos microrganismos, como o
COVID-19, é a radiação ultravioleta (UV),
presente nestes novos equipamentos, que
evita que a contaminação se propague, já que
os cientistas sabem que os vírus podem
persistir durante muitas horas em diversas
superfícies, como metais, vidros, plásticos e
madeiras. Pesquisadora Thaila Quatrini Correa
Diferentemente dos outros métodos
empregados para a desinfecção, a radiação
UV-C é capaz de proporcionar uma inativação
rápida e eficaz dos microrganismos mediante
um processo físico que atua diretamente no
material genético de bactérias, fungos e vírus,
sem deixar vestígios ou subprodutos no local.
A principal vantagem que a técnica apresenta
em relação aos desinfetantes, é que ele não é
um consumível. Os desinfetantes podem
acabar e a limpeza constante com água pode
levar ao excessivo uso de um recurso natural
escasso, enquanto que a tecnologia com luz
ultravioleta mantém-se operacional. A
radiação ultravioleta é a fração do espectro
eletromagnético que abrange os
comprimentos de onda abaixo da luz visível,
variando de 200 a 400 nm. Essa fração é ainda
subdividida em três tipos: UV-A com
comprimentos de onda variando de 320 a 400
nm; UV-B com comprimentos de onda
variando de 280 a 320 nm; e UV-C com
comprimentos de onda variando de 200 a 280
nm. Cada tipo de radiação UV é responsável
por causar algum dano biológico. A radiação
UV-A é a responsável por provocar alterações
na pele, causando o envelhecimento; a
radiação UV-B, além de atuar no
envelhecimento da pele, é a principal
responsável por causar mutações genéticas
que levam ao desenvolvimento de câncer de
pele; mas, é a radiação UV-C que é
considerada a mais deletéria, ou seja, a faixa
germicida. “Por possuir elevada efetividade, a
radiação UV-C tem sido amplamente utilizada
com segurança na desinfecção de superfícies
em geral, como em hospitais, salas cirúrgicas,
clínicas, laboratórios e também nas indústrias
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

farmacêuticas, cosméticas, alimentícias, de
laticínios, entre outros ambientes.” destaca a
doutora em biotecnologia do IFSC/USP, Thaila
Quatrini Correa. No que diz respeito ao
Surface UV, ele é um equipamento portátil e
de fácil manuseio, ideal para realizar a rotina
de desinfecção dos locais de trabalho, bem
como de todos os utensílios e equipamentos
presentes nesses locais. Com o seu uso
regular, o dispositivo pode promover a
diminuição de possíveis infecções veiculadas
pelas superfícies, instrumentos, objetos e
quaisquer outros materiais contaminados. Em
locais públicos com grande circulação de
pessoas, os sistemas com luz ultravioleta
podem ser utilizados para reduzir a possível
presença de COVID-19. O sistema pode ser
aplicado, por exemplo, em ônibus,
mobiliários, bancadas, pias, leitos,
equipamentos, pisos, paredes, portas, janelas,
grades de ar condicionado, banheiros
públicos, corredores, mobílias, maçanetas,
corrimãos, teclados e mouses de computador,
caixas eletrônicos, ou seja, locais onde as
pessoas normalmente colocam as mãos. Em
outros países, a técnica tem sido utilizada para
descontaminar aviões e hospitais. Desinfecção
de objetos O Surface UV foi testado e sua ação
em inativar microrganismos foi comprovada
cientificamente em um estudo publicado na
revista internacional Photomedicine and Laser
Surgery, em 2017 de autoria dos
pesquisadores Thaila Quatrini Correa, Kate
Cristina Blanco, Natalia Mayumi Inada, Maisa
de Fatima Hortenci, Angela Aparecida Costa,
Evaine da Silveira Silva, Patricia Pereira da
Costa Gimenes, Soraya Pompeu, Raphael Luiz
de Holanda e Silva, Walter Manso Figueiredo,
e Vanderlei Salvador Bagnato. Prof. Sebastião
Pratavieira A pesquisa científica avaliou a
efetividade do dispositivo na redução de
bactérias Gram-positivas, como as espécies
Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans
e Streptococcus pneumoniae; bactérias Gram-
negativas, como as espécies Pseudomonas
aeruginosa e Escherichia coli, além da espécie
fúngica Candida albicans, todas causadoras de
doenças infecciosas. 31/07/2022 22:50
Equipamentos desenvolvidos no IFSC/USP
descontaminam superfícies. Além disso, o
mesmo estudo avaliou a ação do Surface UV
na desinfecção de superfícies de locais
diferentes dentro de um ambiente hospitalar,
isto é, em ambientes reais de contaminação.
Dez superfícies foram escolhidas para receber
a desinfecção: bancada de trabalho do
laboratório de bacteriologia, cadeira de coleta
de sangue, bancada de troca dos bebês do
atendimento infantil, mesa de atendimento
da sala de vacinação, mesa de atendimento da
sala de tuberculose, dengue e clínica médica,
mesa de atendimento da sala de DST/AIDS,
mesa de atendimento da sala de
dermatologia, cadeira ginecológica da sala de
saúde da mulher, e suporte com material para
curativos da sala de hanseníase. Todos os
resultados mostraram redução na carga
microbiana presente nestas superfícies,
indicando que o dispositivo pode auxiliar na
desinfecção desses locais. O docente e
pesquisador do IFSC/USP, Prof. Sebastião
Pratavieira, sublinha que, com relação ao
COVID-19 ainda não existem estudos
específicos: “Todavia, baseado no que
encontramos na literatura, o UV-C tem
potencial para inativar toda e qualquer
bactéria, fungo ou vírus, nessas superfícies.
Vamos ter que aguardar para fazer os testes
para o novo coronavirus, mas estamos
convictos de que o UV-C é eficaz. O
equipamento é extremamente seguro para
quem manuseia e a única advertência é que
este aparelho não pode ser utilizado
diretamente na pele humana, nem em
animais”, conclui o pesquisador.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

ATIVIDADE PRATICA 2

REALIZAÇÃO DA TÉCNICA DE
COLORAÇÃO DE GRAM

INTRODUÇÃO
O método tintorial predominante utilizado
em bacteriologia é o método de Gram. A
bacterioscopia, após coloração pelo método
de Gram com diagnóstico presuntivo, de
triagem, ou até mesmo confirmatório em
alguns casos, constitui peça importante e
fundamental na erradicação e no controle
das Doenças Sexualmente Transmissíveis
(DST), por exemplo. Essa técnica é simples,
rápida e tem capacidade de resolução,
permitindo o correto diagnóstico em cerca
de 80% dos pacientes em caráter de pronto
atendimento em nível local. Os custos com
investimento e manutenção são
consideravelmente baixos diante da eficácia
alcançada com os resultados imediatos dos
testes.
Essa técnica requer instalação simples,
necessitando apenas de uma sala pequena
com disponibilidade de água e gás, onde
deverá ser instalado um balcão com pia e um
bico de Busen, eventualmente substituído
por uma lamparina ou espiriteira. São ainda
necessários: microscópio com objetiva de
imersão e bateria para a coloração de Gram.

A coloração de Gram recebeu este nome em
homenagem a seu descobridor, o médico
dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram.
Em 1884, Gram observou que as bactérias
adquiriram cores diferentes, quando
tratadas com diferentes corantes. Isso
permitiu classificá-las em dois grupos
distintos: as que ficavam roxas, que foram
chamadas de Gram positivas, e as que
ficavam vermelhas, chamadas de Gram-
negativas.

Como funciona a coloração de Gram?
Desde o trabalho original de Hans Gram,
vários pesquisadores tentaram, com pouco
sucesso, determinar o mecanismo envolvido
no método de coloração. Conceitos diversos
têm sido apresentados, tais como:
1. A existência de um substrato Gram-
positivo e específico;
2. As bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas possuiriam diferentes afinidades
com o corante primário cristal de violeta; e
3. A existência de diferentes graus de
permeabilidade na parede dos micro-
organismos Gram-positivos e Gram-
negativos.

Este último é o mais aceito atualmente.
Tanto a espessura da parede celular, quanto
as dimensões dos espaços intersticiais, por
exemplo, “diâmetro do poro”, parecem ser
determinantes do resultado final da
coloração de Gram. Segundo esse conceito,
quando as estruturas celulares são cobertas
pela violeta-de-metila, todas se coram em
roxo. Com a adição do lugol, também
chamado de mordente, ocorre a formação
do completo iodo-pararosanilina. Esta
reação tem a propriedade de fixar o corante
primário nas estruturas coradas. Algumas
estruturas perdem a cor violeta
rapidamente, quando se aplica um agente
descorante, como álcool etílico, enquanto
outras perdem sua cor mais lentamente ou
não perdem a cor. A safranina cora as
estruturas que foram descoradas.

Fonte: Ministério da Saúde Secretaria de
Políticas de Saúde Programa Nacional de
DST e Aids

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

Procedimento

1. Cubra o esfregaço com violeta-de-metila e deixe por aproximadamente 15 segundos;
2. Adicione igual quantidade de água sobre a lâmina coberta com violeta-de-metila e deixe
agir por mais 45 segundos;
3. Escorra o corante e lave em um filete de água corrente;
4. Cubra a lâmina com lugol diluído (1/20) e deixe agir por aproximadamente 1 minuto;
5. Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente; 5. Adicione álcool etílico (99,5º GL)
sobre a lâmina; descorando-a, até que não desprenda mais corante;
6. Lave em um filete de água corrente;
7. Cubra a lâmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos;
8. Lave em um filete de água corrente;
9. Deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente, com o auxílio de um papel de filtro limpo;
10. Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço; e
11. Leia em objetiva de imersão (100 X).

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

Leituras

Atividade 1
Primeiramente analise o esfregaço da
Amostra 1, sob aumento de 100x,
identificando a morfologia do
micro-organismo analisado, e
considere:
a. Há mais de um tipo morfológico
Sim Não

b. Qual tipo morfológico pode ser
identificado na análise?
_____________________________
_____________________________
_____________________________

c. Esta morfologia seria compatível
com Staphylococcus aureus
Sim Não

d. Desenhe abaixo, um campo
observado em aumento de 1000X,
considerando quantidade e arranjos
celulares observados.

Aumento 1000X
__________________________________
Atividade 2
Primeiramente analise o esfregaço da
Amostra 2, sob aumento de 1000x,
identificando a morfologia do
micro-organismo analisado, e
considere:
a. Há mais de um tipo morfológico
Sim Não

b. Qual (is) tipo(s) morfológico(s)
pode(m) ser identificado(s) na
análise?
_____________________________
_____________________________
_____________________________
c. Esta morfologia seria compatível
com Enterococcus faecalis
Sim Não
___________________________________
d. Desenhe abaixo, um campo
observado em aumento de 100X,
considerando quantidade e
arranjos celulares observados.

Aumento 1000X

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

ATIVIDADE PRATICA 3

BACILOSCOPIA DE ESCARROS
CORADOS PELA TÉCNICA DE
ZIEHL-NEELSEN
 TB (tuberculose)
 BK Bacilos de Kock
 BAAR (bacilos álcool ácido
resistentes)
INTRODUÇÃO
Como é feito o diagnóstico da tuberculose?
O diagnóstico da tuberculose é feito por:
• exame clínico: baseado nos sintomas
relatados e no exame físico que possibilitam
o diagnóstico preliminar zda doença a ser
confirmada por outros exames;
• exame radiológico de tórax: pode revelar
imagens no pulmão sugestivas de
tuberculose, mas sua simples realização não
é suficiente para confirmar a doença;
• prova ou reação tuberculínica: também
conhecida como PPD (Purified Protein
Derivative) - derivado purificado de fração
protéica antigênica do bacilo) ou reação de
Mantoux, em homenagem ao cientista que
aperfeiçoou essa prova criada por Koch. É
uma reação intradérmica, que apenas
verifica se o indivíduo teve ou não contato
com o bacilo.
• diagnóstico laboratorial: é o que confirma
o diagnóstico da tuberculose. Tuberculose -
Diagnóstico Laboratorial - Baciloscopia
Como é feito o diagnóstico laboratorial da
tuberculose? •
O diagnóstico laboratorial da tuberculose é
feito através dos seguintes métodos
bacteriológicos:
• Baciloscopia - ou exame microscópico, é a
pesquisa de bacilos álcool-ácido resistentes
- BAAR em esfregaços da amostra,
preparados e corados com metodologia
padronizada.
 Teste rápido molecular para tuberculose
(GeneXpert MTB/RIF)
• Cultura - é o exame que permite o
isolamento e a multiplicação de BAAR, a
partir da semeadura da amostra em meios
de cultivo específicos para micobactérias.
Como qualquer espécie de micobactéria
pode se desenvolver nesses meios, é
preciso realizar testes de identificação, que
possibilitama diferenciação do M.
tuberculosis de outras micobactérias, em
amostras de culturas positivas para BAAR.
Os testes mais utilizados são:
• prova de crescimento de colônias
bacterianas em PNB (ácido p-
nitrobenzóico): consiste na observação do
crescimento de colônias de micobactérias
em meio de cultura contendo PNB. O meio
de cultura contendo este tipo de ácido
(PNB) inibe a multiplicação do M.
tuberculosis não ocorre a formação de
colônias bacterianas;
• prova de produção da niacina: detecta a
niacina produzida pelo M. tuberculosis e
acumulada no meio de cultura. As outras
micobactérias não produzem niacina em
quantidade suficiente para a detecção
nessa prova;
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

• prova de redução do nitrato: detecta o
nitrito produzido pela redução de nitratos,
devido a presença da enzima nitrato-
redutase. É obrigatório realizar a
baciloscopia e a cultura em todas as
amostras?
SITUANDO:
Os exames laboratoriais para TB são:
 Baciloscopia direta da expectoração
(Coloração de Ziehl Neelsen)
 Teste rápido molecular para tuberculose
(GeneXpert MTB/RIF)
 Cultura para micobacteria.
____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

Leitura de escarro: Escala semi-quantitativa para informe do número de BAAR
observados em esfregaços de escarro corados pelo método de Ziehl-Neelsen

Resultado: __________________________________________________________________
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

ATIVIDADE PRÁTICA 4
TÉCNICAS DE SEMEADURA POR
ESTRIAMENTO, EM DIFERENTES MEIOS
DE CULTURA
INTRODUÇÃO
Meios de cultura consistem da
associação qualitativa e quantitativa de
substâncias que fornecem os nutrientes
necessários ao desenvolvimento
(cultivo) de microrganismos fora do seu
meio natural. Tendo em vista a ampla
diversidade metabólica dos
microrganismos, existem vários tipos de
meios de cultura para satisfazerem as
variadas exigências nutricionais. Além
dos nutrientes é preciso fornecer
condições ambientais favoráveis ao
desenvolvimento dos microrganismos,
tais como pH, pressão osmótica,
umidade, temperatura, atmosfera
(aeróbia, microaeróbia ou anaeróbia),
dentre outras. Os meios de cultura
podem ser classificados quanto a sua:
A) Composição
B) Consistência
C) Intenção de uso
D) Método de preparo
Amostras podem ser semeados
em meios de cultura sólidos, para a
realização de análises microbiológicas.
Para este fim, Técnicas de Semeadura
utilizam materiais coletores como
cotonetes, swabs, ou materiais
específicos de inoculação como alças de
Drigalski ou bastões de inoculação. Na
execução da Técnica de Semeadura por
Espalhamento é realizada a inoculação,
através de estrias de inoculação
estratégicas, com o objetivo de
propiciar a distribuição uniforme do
conteúdo da amostra, sobre o meio de
cultura sólido. Na execução da Técnica
de Semeadura por Esgotamento é
realizada a inoculação, através de
estrias de inoculação estratégicas, com
o objetivo de diminuir a carga amostral
gradualmente, sobre a superfície do
meio de cultura sólido, propiciando a
obtenção de colônias microbianas
isoladas umas das outras.
Fonte: https://abihpec.org.br/guia-
microbiologia/files/assets/basic-
html/page54.html

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

Cultura microbiológica em
meio sólido, semeada através da
Técnica de Semeadura por
Esgotamento

Material necessário
 Suspenção microbiana
 3 distintos meios de cultura
- ágar nutriente
- ágar Mc Conkey
- ágar Manitol salgado
 Alça microbiológica

PROCEDIMENTO

Realize a semeadura da suspensão microbiana, em uma unidade de Meio de Cultura
Sólido, utilizando a Técnica de Semeadura por Espalhamento, conforme esquema
ilustrativo.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

Ilustração da Técnica de Semeadura por
Espalhamento sobre o meio de cultura sólido,
esquematizando a sequência de inoculação.

1. A seguir, utilizando outra unidade de Meio de Cultura Sólido e realize semeadura da
suspensão microbiana, utilizando a Técnica de Semeadura por Isolamento ou
Esgotamento, conforme esquema ilustrativo.

Ilustração da Técnica de Semeadura por
Esgotamento, sobre meio de cultura sólido,
esquematizando a sequência de inoculação.

PROPOSTA DE TRABALHO

Figura esquema de movimentos de semeadura da técnica de esgotamento,
sobre o meio de cultura sólido.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

Leitura
Os resultados obtidos foram os esperados,
inicialmente? Apresente suas
considerações, de acordo com os resultados
obtidos, e faça proposta de novos
experimentos, considerando os resultados
obtidos.
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
____________________________________
_____

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

ATIVIDADE PRÁTICA 5
OBSERVAÇÃO DO CRESCIMENTO
MICROBIANO, ATRAVÉS DA TURBIDEZ
E PRODUTOS METABÓLICOS
INTRODUÇÃO
Quando há condições propícias
para o desenvolvimento microbiano,
bactérias e fungos se multiplicamexponencialmente, porém a taxa de
crescimento diminui devido à carência
de nutrientes e alterações das
condições ambientais, que se não forem
revertidas, levam à morte da cultura
microbiana.
O crescimento de bactérias e
fungos, em sistemas fechados, ou seja,
em ambientes que não há entrada de
novos aportes nutricionais, e nem
depuração de metabólitos produzidos
pelos próprios micro-organismos,
ocorre em 4 fases:
 Fase Lag, na qual os micro-
organismos estão se adaptando
ao meio.
 Fase Log ou Exponencial, na
qual os micro-organismos já
adaptados ao ambiente, em que
estão expostos, se multiplicam
continuamente, em uma
progressão exponencial.
 Fase Estacionária, na qual a taxa
de crescimento populacional
microbiana é equivalente à taxa
de mortes da mesma, devido à
escassez de nutrientes e a
formação de produtos do
metabolismo, que se acumulam
no ambiente.
 Fase de Declínio, na qual, a taxa
de mortes supera o número de
novos micro-organismos, devido
à escassez severa de nutrientes
essenciais, desequilíbrio iônico e
aumento de toxinas, produtos
do próprio metabolismo
microbiano. Nesta fase o
ambiente se torna inóspito para
a população microbiana.
As leveduras da
espécie Saccharomyces cerevisiae,
realizam fermentação alcoólica, que é
um processo biológico, no qual açúcares
como a glicose, frutose e sacarose são
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

convertidos em energia celular, com
produção de etanol e dióxido de
carbono. A velocidade de fermentação
é determinada pela quantidade de
açúcar fermentado, e por uma
quantidade de leveduras, durante um
certo tempo. Para acompanharmos o
tempo necessário que uma cultura de S.
cerevisiae micro-organismo específico
leva para se manter nas fases Lag e Log,
acompanharemos a produção de um
dos metabólitos, o gás dióxido de
carbono.
Entende-se por turbidez o
fenômeno que ocorre, quando
partículas sólidas presentes em solução,
antes homogênea, dispersam a radiação
incidida em linha reta, através da
solução, e esta luz é mais absorvida do
que transmitida. Em um crescimento
microbiano, em ambiente aquoso, a
turbidez proteica é proporcional à
quantidade de micro-organismos
presentes. Quanto maior a turbidez,
maior a concentração das partículas
suspensas, presentes naquele
ambiente. Se a luz transmitida é medida
em um comprimento de onda
particular, pode-se obter um valor que é
proporcional à concentração da
substância, ou substâncias presentes na
solução, responsáveis pela turbidez.
Os métodos turbidimétricos são
utilizados em Microbiologia para
quantificar a concentração de micro-
organismos em ambientes aquosos. Em
laboratórios de ensaios analíticos ou
clínicos as medições são realizadas com
equipamentos chamados
espectrofotômetros.
A observação da turbidez
também pode ser utilizada para
detectar a presença e crescimento de
micro-organismos em ambientes
supostamente estéreis, como a análise
de controle de qualidade de uma
solução.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

PROPOSTA DE TRABALHO
Micro-organismos a serem estudados
- Sacharomyces cereviseae, proveniente de fermento biológico.
MATERIAL POR GRUPO
- 3 tubos com 10 mL de solução salina
- 2 g de fermento biológico
- 2 g de açúcar (sacarose)
- fitas de indicador de pH
- 2 balões de festa
- cubetas de espectrofotometria descartáveis
-Papel de pesagem

Procedimento
1ª. etapa
1. Identifique os tubos, conforme a proposta:
 Tubo C – 1 colher (chá) de fermento biológico.
 Tubo 1 – 1 g de açúcar e 1 g de fermento biológico.
 Tubo 2 – 1 g de açúcar e 1 g de fermento biológico

2. Adicione a quantidade de fermento biológico e de açúcar, estipulada para cada
tubo, na etapa 1.
3. Feche as tubos e agite bem para homogeneizar os ingredientes.
4. Retire as tampas e cubra a boca dos tubos 1 e 2 a garrafas com os balões.
5. No tubo 3 acrescente 1 pedaço de repolho roxo, previamente sanitizados.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

ATIVIDADE PRÁTICA 6
PESQUISA MICOLÓGICA DE GRÃOS
OLEAGINOSOS
INTRODUÇÃO
Além de fungos comestíveis e
fermentadores que podem fazer parte
de nossa alimentação, fungos não
comestíveis, presentes
abundantemente na natureza, são
encontrados frequentemente em
alimentos. Para estes fungos, a presença
nos alimentos é indesejável, pois alguns
destes fungos podem produzir
substancias tóxicas chamadas
Micotoxinas, que se ingeridas com os
alimentos podem comprometer
gravemente a saúde humana e de
outros animais.
Alguns fungos filamentosos como
integrantes dos gêneros Aspergillus e
Penicillium, são toxigênicos, e a principal
toxina produzida por este gênero
fúngico é chamada aflatoxina, que é
capaz de comprometer gravemente a
longo prazo a saúde humana.
Devido às suas necessidades
nutricionais, muitos fungos toxigênicos
têm predileção por se desenvolver em
ambientes oleaginosos. Por isso, grãos
como amendoim, avelã, nozes e
castanhas, além de milho e soja,
frequentemente apresentam
quantidades desaconselhadas de
micotoxinas. Portanto, a detecção de
fungos filamentos em grãos oleaginosos
desaconselha o consumo do lote
analisado.
PROPOSTA DE TRABALHO
Material necessário
 3 unidades de ágar sabouraud dextrose (ASD).
 Grãos adquiridos no comércio varejista, sugiro algo que você tenha em sua
residência (ex: amendoim, avelã, castanha, noz, e que não sejam salgados ou
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

adocicados). Caso você não tenha, procure adquirir uma porção pequena de
amostra. Só serão necessários 9 a 12 grãos.
 Espátula
PROCEDIMENTO
1. Identifique as unidades de meio sólido para crescimento fúngico, sendo, 2 unidades
como experimento e 1 unidade como controle negativo, e a data da realização do
experimento.
2. Com o auxílio de uma espátula, separe os grãos a serem analisados. No caso de
amendoim com casca, não será necessário descascá-lo.
3. Para cada unidade do meio de cultura básico sólido, distribua 3 a 4 grãos sobre sua
superfície.
4. Incube os meios de cultura, controle e meios semeados, a temperatura ambiente
controlada (25º C), por 7 dias.
Observação e documentação dos resultados
Decorrido o tempo estipulado, observe se houve o crescimento de micro-
organismos, e se sim, qual a cor que apresentam. Verifique se houve crescimento na
unidade de controle negativo, pois se houver, os resultados obtidos nos experimentos
podem ser comprometidos.
Tempo da
observação
Amostras
1 2 3 Controle negativo
7 dias Foto Foto Foto Foto
Relação de
contaminação

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

PREJUÍZO
Milho: presença de toxina
impede a comercialização de
500 mil sacas
Em Tocantins, o temor
entre os empresários é de
que o estado seja visto
como produtor de grãos
contaminados e perca
possíveis compradoresPUBLICADO EM 05/11/2018 ÀS 14H22 POR
COM INFORMAÇÕES DA EMBRAPA PESCA
E AQUICULTURA - ATUALIZADO EM
21/11/2018 ÀS 16H02

Foto: Leonardo Rocha/ Embrapa
Agrossilvipastoril
Produtores e exportadores de
milho do Tocantins estão com
problemas de comercialização
devido à identificação de uma
toxina encontrada no cereal
durante fiscalização sanitária.
Um levantamento realizado pela
Secretaria do Desenvolvimento
da Agricultura e Pecuária
(Seagro) do estado constatou
que aproximadamente 500 mil
sacas foram barradas para a
venda, mas o prejuízo pode ser
ainda maior, segundo Tadeu
Teixeira Jr, gerente de agricultura
da secretaria. A aflatoxina é um
tipo de micotoxina das mais
nocivas do mundo, considerada
o agente natural mais
cancerígeno que se conhece.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

“Essa micotoxina é altamente
perigosa, porque mesmo quando
o milho é processado ela não
morre. Então ela pode ser
encontrada em inúmeros
alimentos processados, como
flocos de milho e até na cerveja.
E pior: se o animal consumir o
milho contaminado, transmite
aflatoxina para a carne e o leite”,
alerta Rodrigo Véras da Costa,
pesquisador e especialista em
fitopatologia da Embrapa Milho e
Sorgo (Sete Lagoas, MG).
Segundo a Embrapa, a Europa é
um dos compradores mais
exigentes do mundo, não
admitindo um nível de
contaminação superior a quatro
nanogramas. Países como
Brasil, Argentina e Estados
Unidos já admitem até cinco
vezes acima desse patamar.
Nos Estados Unidos há uma
legislação específica que
determina a destinação do milho
de acordo com seu grau de
contágio: até 20 nanogramas o
grão pode ser destinado ao
consumo humano. No Brasil, a
legislação não diferencia os
diversos graus de
contaminação.
Véras revela ainda como o
departamento descobriu casos
de aflatoxina no Tocantins. “Uma
grande empresa exportadora de
grãos entrou em contato conosco
para relatar sobre a rejeição de
seus lotes de milho. A princípio a
demanda era ligada a questões
tributárias, mas ali acendeu um
alerta e fomos saber se o
problema era local ou se atingia
outras empresas”, diz.
Depois de uma consulta com
mais de 30 armazenadores do
estado, a Seagro tomou
conhecimento de que várias
estavam com o mesmo problema
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

de contaminação. O temor dos
produtores e empresários é que
o estado seja visto como produtor
de grãos contaminados e perder
possíveis compradores.
 Produtores de milho de MT
seguram vendas e reduzem área
de plantio
 Plantio de milho verão avança e
ultrapassa média dos últimos
cinco anos
“Mato Grosso, que é um grande
produtor de milho, é tido como
fornecedor de grão saudável,
limpo. Se o Tocantins pegar esse
estigma de exportador de grão
contaminado, pode inviabilizar
plantio de milho no estado”,
alerta Verás.
Prevenção
Provocada pelo
fungo Aspergillus flavus, que
causa o mofamento dos grãos, a
aflatoxina é resistente ao
tratamento com fungicidas, que
encontram dificuldade de atingir
o alvo. Além disso, a micotoxina
é altamente contagiosa e pode
ocorrer em qualquer momento:
do plantio à industrialização,
passando pela colheita,
armazenamento e transporte.
“A melhor forma é prevenir”,
ressalta Véras, acrescentando
que temperaturas elevadas e
períodos de seca na fase de pré-
florescimento favorecem o
aparecimento do fungo. Nesse
sentido, o clima do Tocantins é
extremamente propício à
contaminação. “No período de
plantio temos um clima quente e
úmido e isso é tudo o que o fungo
quer para se reproduzir”, detalha
ele.

Foto: Embrapa
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

Para prevenir a doença, o
produtor deve tomar uma série
de medidas, a começar pela
escolha de híbridos mais
resistentes e plantar na época
certa, evitando o estresse hídrico
na fase do pré-florescimento.
Também é preciso controlar os
insetos, pois eles fazem furos na
planta que favorecem à
contaminação do fungo.
Segundo o pesquisador, a
colheita também deve ser na
época correta, evitando deixar o
milho por longos períodos no
campo. Além disso, as máquinas
de trabalho precisam estar
devidamente calibradas para
evitar quebra dos grãos durante
a colheita – pois isso também
favorece a entrada do fungo.
Limpeza e secagem correta dos
grãos, além de armazenamento
adequado em depósitos em boas
condições higiene são medidas
que devem ser adotadas para
evitar a ocorrência de
micotoxinas.
“O produtor de Tocantins deve
ser extremamente cuidadoso.
Temos a ideia inclusive de criar
um grupo de trabalho voltado
para alertar todos os agentes
envolvidos na cadeia do milho
para que esse problema não
prejudique ainda mais a
produção. O que aconteceu
esse ano já é um alerta”, conclui
Véras.

Fonte:
https://www.canalrural.com.br/no
ticias/agricultura/milho/toxina-
impede-comercializacao-milho/

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

ATIVIDADE PRÁTICA 7
EXAME MICROSCÓPICO DIRETO PARA
FUNGOS COM TINTA-DA-CHINA OU
NANQUIM
INTRODUÇÃO
Criptococose é uma micose sistêmica
causada por duas espécies do
basidiomiceto encapsulado:
Cryptococcus neoformans e C.
gattii,
que, respectivamente, causam infecção
em indivíduos imuno-comprometidos e
em hospedeiros imuno-competentes,
respectivamente. Pacientes com
deficiência em células T são mais
suscetíveis. A infecção se inicia por
lesões pulmonares assintomáticas e a
doença disseminada frequentemente
cursa com meningoencefalite. A
importância médica da criptococose
aumentou significativamente em
consequência da epidemia da AIDS e dos
transplantes de órgãos.
A pesquisa de leveduras do gênero
Cryptococcus pode ser realizada em
qualquer material clínico, mas é usual a
solicitação a partir de líquido
cefalorraquidiano (líquor) para
investigação em suspeita de meningite
criptocócica.
Base metodológica: Os grânulos de
nanquim (tinta-da-china) ou não são
capazes de penetrar na cápsula dessas
leveduras, ficando de fora das
estruturas celulares capsuladas, e
preenchendo o ambiente externo pelos
grânulos negro, permitindo o fácil
reconhecimento das leveduras
encapsuladas, que permanecem claras.
As amostras são reveladas com tinta-da-
china ou nanquim, com a finalidade de
visualizar as leveduras encapsula
Sua presença é indicativa de
criptococose, portanto patognomônico,
e seu achado é fundamental para
confirmação diagnóstica, embora não
permita garantir que as leveduras
estejam viáveis.
Sua viabilidade deverá ser avaliada, pela
confirmação por realização da cultura
para fungos, visto que podem
permanecer presentes no exame direto
por um longo tempo, mesmo após o
tratamento, sem, no entanto, serem
viáveis. Portanto, não representam um
bom parâmetro para controle de cura.
Assim como para pacientes
imunossuprimidos, pode haver um falso
negativo, quando as leveduras não são
estimuladas a produzirem capsulas,
como defesa frente ao sistema
imunológico competente.
Fonte: SEVERO, Cecília Bittencourt;
GAZZONI, Alexandra Flávia and SEVERO,Luiz Carlos. Capítulo 3: criptococose
pulmonar. J. bras. pneumol. [online].
2009, vol.35, n.11, pp.1136-1144. ISSN
1806-3713.
http://dx.doi.org/10.1590/S1806-
37132009001100012.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES

Laudo: presença de leveduras
capsuladas
Laudos possíveis:
1. Presença de leveduras capsuladas
por “coloração” por tinta da China.
2. Ausência de leveduras capsuladas
por “coloração” por tinta da China.
PROPOSTA DE TRABALHO
Material necessário
- suspensão de cultura de criptococos
- suspensão de tinta da China
- lâminas e lamínulas limpas e desinfetadas
METODOLOGIA
Solicitar Cultura para leveduras e posterior identificação por tinta da china
Cultura: Cultivos em Ágar Sabouraud Dextrose, para avaliação do possível crescimento
de fungos.
Teste da Tinta Nanquim Conforme Silva (2004) e Gullo (2012), os fungos crescidos em
Ágar Sabouraud Dextrose devem ser examinados ao microscópio óptico, após detecção
com tinta da china, para identificação da cápsula polissacarídica e assim analisar o
gênero encontrado.
Leitura
Desenhe, um campo observado em
aumento de 1000X, considerando
quantidade e arranjos celulares observados.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA 30090025 – MICROBIOLOGIA
PROFESSORA DULCINÉA BLUM MENEZES