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DEFINIÇÃO Caracterização do genoma, sua compactação, organização dos genes, cromatinas, plasticidade celular e heranças genéticas. Apresentação dos conceitos de marcador genético e polimorfismo genético e sua aplicação forense. PROPÓSITO Apresentar alguns conceitos básicos de genética, que dão suporte ao conhecimento das regiões polimórficas do genoma consideradas como marcadores para individualização ou estabelecimento de vínculo genético, bem como técnicas para explorar estes polimorfismos. OBJETIVOS MÓDULO 1 Reconhecer a organização do genoma humano MÓDULO 2 Descrever o polimorfismo genético MÓDULO 3 Descrever os métodos de análise molecular aplicados à genética forense MÓDULO 4 Identificar os marcadores genéticos complementares INTRODUÇÃO No genoma humano, as sequências de DNA são 99,9% idênticas. Porém, encontramos sequências de nucleotídeos, denominados marcadores genéticos, que caracterizam de forma única cada indivíduo. Vários marcadores são passados dos pais para os filhos, permitindo, assim, que sejam usados para estabelecer vínculo genético. Além disso, apresentam estabilidade em diferentes ambientes. A descoberta dos marcadores genéticos a partir dos estudos do genoma humano permitiu grande avanço na aplicação do DNA em genética forense. Neste tema, vamos apresentar e discutir os principais marcadores genéticos usados na rotina de genética forense e as técnicas associadas. MÓDULO 1 Reconhecer a organização do genoma humano COMPACTAÇÃO DO GENOMA – METILAÇÃO / ACETILAÇÃO DAS HISTONAS Após a fecundação, o zigoto passa, na primeira semana, por mitoses sucessivas (clivagem). Isso faz com que surjam várias células com o mesmo potencial de diferenciação e proliferação. Durante esse processo, fatores ambientais tais como: estresse, nutrição, toxinas, patógenos, dentre outros, podem interferir no processo de diferenciação celular a partir da regulação de genes. A partir da clivagem do zigoto, quando ele atinge a fase de mórula, ocorre um desequilíbrio hídrico que permite a entrada de água em seu interior, fazendo com que os blastômeros sejam achatados e empurrados para a periferia. MÓRULA Uma estrutura com 64 células iguais onde cada célula é chamada de blastômero. Este fenômeno permitirá que os genes dos blastômeros passem a ser expressos (funcionar) levando a uma individualidade dessas células, que passam a regular genes próprios. Este fato determina o começo da diferenciação celular modulada pela compactação do DNA. Até os genes do embrião serem ligados, os blastômeros sobrevivem em função dos RNAs mensageiros contidos no citoplasma dos ovócitos que foram fecundados. A partir do momento em que as células da mórula começam a se diferenciar para dar origem primeiramente ao embrioblasto (dará origem ao embrião) e ao trofoblasto (dará origem à placenta), serão chamados de blastocisto - formará os folhetos embrionários (ectoderma, mesoderma, endoderma) para dar origem ao embrião. Todas essas modificações morfofuncionais pelas quais passa a mórula, a compactação do DNA durante os estádios iniciais do desenvolvimento embrionário, serão as grandes responsáveis por iniciar e manter a memória celular para a diferenciação celular, levando o zigoto a se converter em embrião. ATENÇÃO A compactação do DNA é uma grande característica de genomas eucarióticos e se deve à interação do DNA com o octâmero de histonas que formará o nucleossoma. Esse por sua vez, dependendo do nível de metilação, influenciará no estado físico do material genético: cromossoma (no máximo de condensação – nucleossomas muito próximos) ou cromatina (descondensados – nucleossomas afastados). Para entendermos esta dinâmica, podemos fazer uma analogia com água na forma líquida e gelo: Ambas formadas por moléculas de H2O, entretanto, no gelo, as moléculas estarão muito próximas, enquanto na forma líquida essa distância será padrão. Fonte: Adaptado de Wikimedia Detalhe da estrutura do cromossomo. Esta compactação leva a uma regulação epigenética a partir do que chamamos de “Código de Histonas”. Neste código, ocorrem modificações nas histonas, que são proteínas estruturais que interagem com o DNA (se enrolam), sempre formando um conjunto de 8 (octâmero) – 2 H2A, 2 H2B, 2 H3, 2 H4 - e mais a H1. Para que ocorra o Código de Histonas, dois processos são fundamentais: a metilação e a acetilação. METILAÇÃO A metilação é a adição de um radical metil (CH³) às histonas. Isso faz com que a região do genoma que esteja hipermetilada esteja desligada, ou seja, os genes contidos na área hipermetilada não sejam ativados para fins de expressão gênica. A metilação é catalisada pelas enzimas Metiltransferase de Histonas, que adiciona o radical metil aos resíduos de lisina e arginina das histonas H3 e H4. O aumento dos radicais metil inativa a transcrição (desliga genes). ACETILAÇÃO Inversamente proporcional à metilação, tem-se a acetilação, ou seja, a adição de radicais Acetil (COCH³) nos resíduos de lisina e arginina das histonas H3 e H4. Este processo ativa transcrição (liga os genes). Tudo é catalisado pelas enzimas Acetiltransferase de Histonas (HAT). Logo, quanto mais metilado/menos acelilado, o gene está desligado; quanto mais acetilado/menos metilado, o gene está ligado. ATENÇÃO Quanto maior o nível de metilação, menor a interação com fatores de iniciação da transcrição (impede que o complexo de iniciação se ligue ao TATABOX para exposição do sítio promotor e iniciação da transcrição). TATABOX Região rica em Adenina e Timina, e fica a -25pb antes do sítio promotor. Esta região é fundamental para iniciar a transcrição, pois, a partir de sua ativação, o sítio promotor fica exposto e pode interagir com a RNA polimerase fazendo fitas de RNA. Como foi dito anteriormente, essa relação interferirá na compactação do DNA, Código da Histona e disposição da cromatina. O Código das Histonas é estabelecido ainda no início do período embrionário e vai comandar e determinar a diferenciação celular, permitindo que as diferentes células do corpo de um indivíduo sejam morfofuncionalmente diferentes, apesar de apresentarem o mesmo DNA. EUCROMATINA/ HETEROCROMATINA A partir do Código das Histonas, ocorrem modificações de natureza conformacional no material genético contido no núcleo das células que acabaram de ser geradas a partir das mitoses advindas do zigoto. Estas células ficarão estacionadas em G1 (1ª fase da intérfase do ciclo celular) até que ocorram estímulos para que ela evolua no ciclo, e se divida. Nessas células, o material genético encontra-se na forma de cromatina (material genético descondensado), de maneira a ser utilizado para fins de expressão gênica. Ocorre que, durante a formação do Código das Histonas, algumas áreas da cromatina ficarão diferentes de outras, dando origem à formação da heterocromatina e eucromatina. Fonte: Wikipedia Organização da cromatina. HETEROCROMATINA A heterocromatina é a parte da cromatina menos descondensada, em comparação ao restante da cromatina (o nível de metilação das histonas é maior que o nível de acetilação), de maneira que genes contidos na área de heterocromatina estão desligados. Do ponto de vista estrutural, haverá uma maior aproximação dos nucleossomas (octâmero de histonas que interage com o DNA) e isso impede que os reativos da transcrição ativem e transcreva os genes. EUCROMATINA A eucromatina é a parte da cromatina mais descondensada que a anterior (o nível de acetilação é maior que o nível de metilação), que faz com que os genes contidos nesta área sejam ligados, ou seja, o complexo de iniciação da transcrição poderá iniciar a transcrição. ATENÇÃO Existe um controle genético prévio que permite que as relações entre áreas de eucromatina e heterocromatina se mantenham em todas as gerações celulares. Isso posto, este mecanismo explica por que um neurônio e um fibroblasto de uma mesma pessoa, embora apresentem o mesmo DNA, manifestam áreas de eucromatina e heterocromatina diferentes.Isso permitirá que, embora o neurônio apresente o gene do colágeno, este não se expressará em função de estar contido em uma área de heterocromatina. Da mesma maneira que observamos no fibroblasto da mesma pessoa, com relação à adrenalina: apesar de apresentar o gene da adrenalina, o fibroblasto não expressa, em função deste gene estar contido em uma área de heterocromatina. Já o gene do colágeno apresenta- se dentro de uma área de eucromatina e, por isso, pode ser expresso. Outro aspecto importante da heterocromatina é o fenômeno de compensação de doses que ocorre em um dos cromossomas X das mulheres. Por volta da 13ª semana de gestação, ocorre uma inativação parcial de um dos cromossomas X das mulheres com objetivo de equiparar as concentrações das proteínas dos genes do cromossoma X entre mulheres e homens, já que os homens apresentam um cromossoma X e as mulheres apresentam dois. Dessa maneira, um dos X da mulher fica inoperante parcialmente. Essa inativação parcial é mantida a parir da formação de heterocromatina em toda área cromossomial, a partir da hipermetilação das histonas. A heterocromatinização é feita de maneira aleatória para cada célula, ou seja, há célula em que o X paterno inativa, há célula em que o X materno inativa, porém, se na primeira célula foi o X paterno, todas as células que forem originadas desta terão o X paterno inativado parcialmente. Essa heterocromatina facultativa é comum no núcleo de células em interfase de mulheres citogeneticamente normais, e são chamadas de “Corpúsculo de Barr”. O princípio da diferenciação celular é justificado pela formação das áreas de eucromatina e heterocromatina, que em função de um controle genético ainda não elucidado completamente, se manterão constantes ao longo das gerações celulares. Isso porque, todos os fibroblastos, por exemplo, que surgirem a partir de um primeiro, terão as mesmas áreas de heterocromatina e eucromatina da célula original e, por isso, produzirão colágenos e não adrenalina. Fonte: ustas7777777/Shutterstock ORGANIZAÇÃO DOS GENES O gene é a unidade funcional do metabolismo. Ele controla as atividades da célula a partir da síntese de proteínas, tanto enzimáticas, sinalizadoras, quanto as estruturais. Sob o ponto de vista bioquímico, é uma sequência de nucleotídeos, na molécula de DNA, responsável pela codificação de uma proteína, embora existam genes que não produzam proteínas, como é o caso do gene para RNA ribossomal e RNA transportador, assim como os pseudogenes. Sob uma ótica Mendeliana, o gene é um segmento cromossomial responsável por uma característica visualizável. PSEUDOGENES Genes que perderam a funcionalidade ao longo do processo de evolução das espécies. MENDELIANA O biólogo e botânico Gregor Mendel (1822-1884) é o criador das Leis de Mendel, que tratam da transmissão dos caracteres hereditários. Um gene é composto por nucleotídeos unidos entre si por ligações fosfodiéster, que são estabelecidas entre a hidroxila do carbono 3 da desoxirribose, com fosfato do carbono 5 do nucleotídeo seguinte. Os genes apresentam uma extremidade 3’ (da hidroxila livre) e uma extremidade 5’ (do fosfato livre). Essas extremidades têm importância em função das enzimas do fluxo da expressão gênica reconhecerem a Hidroxila livre, pois, durante a transcrição de um gene, apenas a fita senso (3’-5’) será convertida em RNA mensageiro, sendo a outra fita mera figurante no processo. Do ponto de vista genético, o radical mais importante seria a base nitrogenada: Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) e Timina (T), pois é em função da ordem delas que se permite a individualidade genética. A diferença básica entre os indivíduos é, em primeira instância, a ordem das bases nitrogenadas. Estruturalmente simplificado, um gene apresenta 3 partes distintas: SÍTIO PROMOTOR ÉXON ÍNTRON SÍTIO PROMOTOR Promove a transcrição a partir da ligação com a RNA polimerase, que faz a fita complementar de RNA. ÉXON É uma sequência de nucleotídeos que apresenta correlação com o código genético e, portanto, será convertido em códon. ÍNTRON É uma sequência de nucleotídeos que não apresenta correlação com o código genético e que serão retirados no RNA transcrito primário, no processamento, permitindo que este se converta em RNA mensageiro (apresenta só éxon). ATENÇÃO Embora os íntrons, em princípio, não apresentem função direta à síntese de proteínas, serão, para o geneticista forense, de suma importância, visto que as sequências polimórficas comparadas para vínculo genético estão contidas neles. Fonte: Wikimedia Estrutura de um gene, evidenciando éxons e íntrons, região de união dos éxons (splicing) no RNAm, mostrando as etapas de transcrição e tradução. Do ponto de vista funcional, os genes vão apresentar sequências de nucleotídeos que, muitas vezes, não estão contidas em sua estrutura, porém fazem parte de sua funcionalidade. Podemos citar a região denominada TATABOX, como vimos acima. Fonte: Wikimedia Elementos estruturais do TATABOX, com a sequência de consenso TATAWAWA (esta mesma sequência de estrutura e função similares em diferentes organismos), onde W tanto pode ser A ou T. A ORGANIZAÇÃO DO GENOMA HUMANO Veja, a seguir, um vídeo sobre a organização do genoma humano, sequenciados a partir do Projeto Genoma Humano, que levará aos polimorfismos genéticos de interesse forense. VERIFICANDO O APRENDIZADO 1. NO FLUXO DA EXPRESSÃO GÊNICA, A METILAÇÃO TEM COMO FINALIDADE: A) Acelerar B) Ativar C) Inativar D) Retardar 2. OS GENES APRESENTAM 3 PARTES DISTINTAS, NA ORIENTAÇÃO 3’-5’, QUE SÃO: A) Sítio promotor-Éxon-Íntron. B) Éxon-Íntron-Sítio promotor. C) Sítio repressor-Éxon-Íntron. D) Íntron-Éxon-Sítio repressor. GABARITO 1. No Fluxo da expressão gênica, a metilação tem como finalidade: A alternativa "C " está correta. Visto que a metilação das histonas permite a condensação de trechos do DNA, o que faz com que o complexo de iniciação não ative o TATABOX, o qual inativa os genes contidos. 2. Os genes apresentam 3 partes distintas, na orientação 3’-5’, que são: A alternativa "A " está correta. Na orientação da fita senso (3’-5’), o gene possui o Sítio promotor-Éxon-Íntron, que participam do processo de transcrição. MÓDULO 2 Descrever o polimorfismo genético TIPOS DE HERANÇA GENÉTICA Nem tudo que é genético é hereditário, mas tudo que é hereditário é genético! ATENÇÃO Partindo dessa premissa, um fenômeno genético (aquele que tem implicações no fluxo da expressão gênica) passa a ser hereditário, a partir do momento que se observa a repetição daquela característica ao longo das gerações em uma família. Tal princípio foi usado pelos operadores da lei no século XIX e início do XX para estabelecer vínculo genético, pois observavam traços fisionômicos em comum em indivíduos envolvidos em uma ação de paternidade. Ao longo da história da genética forense, muitos casos foram elucidados a partir do confronto de traços fisionômicos entre o filho e o suposto pai: o juiz chamava um expert que fazia o confronto, de maneira que incluía ou excluía o vínculo genético dos envolvidos. Essa ferramenta deu origem aos primeiros marcadores genéticos para uso da genética forense. SAIBA MAIS A partir dos estudos de Gregor Mendel com as ervilhas, em que foi proposto mecanismo aos quais as características obedeciam ao serem transmitidas aos descendentes e, em consequência, foi possível prever a repetição dessas características, utilizando essas informações para a consulta genética. O trabalho de Mendel deu origem à herança monogênica ou mendeliana. Alguns conceitos são importantes para a compreensão do módulo: GENE Segmento cromossomial responsável por uma característica visualizável. ALELO Forma alternativa de um gene em um locus. Cada alelo é recebido de um dos genitores na fecundação. LOCUS/ LOCI Local/locais onde o gene é inserido no cromossoma. HOMOZIGOTO Quando os alelos são iguais (ex. AA, aa). HETEROZIGOTO Quando os alelos são diferentes(ex. Aa). DOMINANTE Quando o alelo manifesta a característica em homozigose ou heterozigose (ex. AA ou Aa). RECESSIVO Quando o alelo manifesta a característica apenas em homozigose (ex. aa). CODOMINÂNCIA Quando os 2 alelos manifestam suas características na mesma proporção (ex. IA IB no grupo sanguíneo AB). GENÓTIPO Conjunto de alelos para uma característica. FENÓTIPO É a manifestação morfológica do genótipo e que pode sofrer influência do meio ambiente. Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal FORMAS BÁSICAS DE TRANSMISSÃO DAS CARACTERÍSTICAS Existem três formas básicas de transmissão de características: MONOGÊNICA OU MENDELIANA Herdada a partir de um único gene em um único locus. Pode ser bialélica (envolve 2 alelos. Ex. A e a), ou polialélica (envolvendo vários alelos, como no caso dos marcadores VNTR e STR). Podem ser: Autossômicas - quando o gene/marcador passado está contido entre os cromossomas do par 1 ao 22 – autossoma, ligado ao cromossomo X; ou Holândrica - quando o gene/marcador está contido no cromossomo Y. Com relação à manifestação do fenótipo, pode ser: Dominante - basta um alelo, independente do 2º para manifestar a característica; Recessivo - deve ter os 2 alelos iguais para a característica se manifestar; e Codominante - quando os 2 alelos se manifestam igualmente. Determinam caráter qualitativo. POLIGÊNICA E/OU MULTIFATORIAL A herança Poligênica e/ou Multifatorial será transmitida a partir da alternância de vários genes em vários loci diferentes, e a combinação dos genes/alelos determinará o fenótipo, com participação do meio ambiente, por exemplo: altura ou peso; ou sem a participação do meio ambiente, por exemplo: cor do olho. Determina caráter quantitativo. MITOCONDRIAL OU EXTRA NUCLEAR A herança Mitocondrial ou Extra Nuclear é aquela que surge a partir do DNA contido nas mitocôndrias que vieram da mãe, visto que, em princípio, as mitocôndrias que temos em nossas células são provenientes das que estavam no citoplasma do ovócito na hora da fecundação. As mitocôndrias paternas ficam na base da cauda do espermatozoide, e que degeneram junto com ela, já que só entra, para fins de fecundação, a cabeça. Fonte: Wikimedia Esquema mostrando a fertilização do óvulo pelo espermatozoide. Após a fusão das membranas, a cabeça do espermatozoide penetra o óvulo e se separa da cauda. Dessa forma, as mitocôndrias do embrião serão provenientes da mãe. A mitocôndria, de acordo com as teorias de origem da vida na terra, foi uma bactéria não patogênica que infectou uma célula eucariótica e a partir daí, estabeleceu uma relação interespecífica de simbiose. Fonte: PopTika/Shutterstock CONCEITO DE MARCADORES GENÉTICOS, ALELO, GENÓTIPO, IMPRESSÕES DIGITAIS DE DNA O genoma humano possui 3.300 Mb (megabases) e cerca de 50.000 genes, excluindo o DNA mitocondrial. A partir do início do século XXI, com o sequenciamento do genoma pelo projeto genoma, muito evoluiu o diagnóstico genético (incluindo a genética forense), pois muitas sequências de nucleotídeos novas puderam ser utilizadas, tanto para fins diagnósticos, quanto para fins prognósticos pela genética médica. 3.300 MB (MEGABASES) Apenas 0,1% apresentam uma variação na sequência (polimorfismo) que possibilita a diferenciação entre indivíduos. As sequências de nucleotídeos novas que permitiram elucidar fenótipos com precisão chamamos de marcadores genéticos. Muitos desses marcadores são herdados e assim, usados para estabelecer vínculo genético, pois são polimórficos, herdados de maneira monogênica polialélica e apresentam estabilidade em diferentes ambientes. Fonte: fizkes/Shutterstock MARCADOR GENÉTICO É uma característica identificável no genoma capaz de distinguir entre dois ou mais indivíduos ou organismos. Ele deve ser capaz de diferenciar os progenitores e ser reproduzido com precisão na progênie. São características desejáveis de um marcador genético: alto nível de polimorfismo e estabilidade. Outro aspecto dos marcadores genéticos moleculares é que não necessariamente são importantes na codificação de proteínas, mas sua presença individualiza fenótipos. Esses marcadores, em laboratório, são chamados de alelos (embora não necessariamente sejam genes), pois se apresentam sempre em número de dois. ATENÇÃO Outro ponto relevante é que os marcadores são encontrados ao longo do genoma, de maneira que, após análise de vários marcadores, poderemos individualizar pessoas, já que o conjunto desses marcadores (a partir de uma tipagem por DNA) gera o que chamamos de “impressões digitais” ou “perfil por DNA”, fazendo uma analogia às cristas dermatóglifas (Impressões digitais) que são pessoais e particulares. MARCADORES GENÉTICOS POLIMÓRFICOS E APLICAÇÕES FORENSES CNP (POLIMORFISMO POR NÚMERO DE CÓPIAS), VNTR, STR, INDELS São admitidos como marcadores genéticos polimórficos, aqueles que apresentam alelos com frequência superior a 1% na população em geral. Todos os polimorfismos surgem a partir de mutações durante a replicação de DNA, que podem ser espontâneas ou provocadas por mutágenos. Cerca de 95% do genoma apresentam sequências polimórficas que são suscetíveis à mutagênese, gerando mais variação e, em consequência, mais polimórficas. O genoma é composto por mais de 10 bilhões de nucleotídeos que se agregam de várias maneiras, gerando vários tipos de polimorfismos, onde alguns são de interesse forense. De mais relevância forense, temos: MUTÁGENOS Agentes de natureza química, física ou biológica que induza à mutação. CNP (POLIMORFISMO POR NÚMERO DE CÓPIAS) Equivale a uma parte considerável do genoma humano duplicada ou deletada em porções bastante largas, variando entre 200 pb até 1 Mb. As cópias extras ou faltantes do genoma nos CNPs podem ser detectadas por hibridação com sondas de oligonucleotídeos de DNA. Podem ser detectados usando métodos baseados em microarranjos, mas estes têm uma resolução relativamente baixa quando comparados com abordagens baseadas em sequenciamento. Devem ser utilizados concomitantemente aos marcadores STR. São muito utilizados para estudos de frequência populacional. VNTR (NÚMERO VARIÁVEL DE REPETIÇÕES IN TANDEM) São sequências constituídas por unidades de repetição de 9 a 100 pares de bases que podem se repetir até 35 vezes em um mesmo locus. Estão contidas nos íntrons gênicos. Foram as primeiras sequências apresentadas por Alec Jeffreys e aplicadas para fins forenses. Por serem sequencias maiores, são analisadas pela técnica de RFLP (polimorfismo no comprimento dos fragmentos de restrição), que utiliza enzimas de restrição. VNTR são sequências mais aplicadas a casos de paternidade simples (suposto pai-filho-mãe), e realizadas a partir de sangue periférico, gerando DNA íntegro. São tão polimórficos que a análise de seis loci já permite com exatidão elucidar o vínculo genético. Fonte: Wikimedia Diagrama de teste de paternidade por DNA. Resultados da “impressão digital genética” de amostras obtidas da mãe (M), filho (F) e dos supostos pais (1, 2, 3). As bandas de DNA de diferentes tamanhos na amostra do filho poderiam ser uma combinação das amostras da mãe e do pai. STR (SEQUÊNCIAS CURTAS IN TANDEM) São sequências extremamente polimórficas e distribuídas ao longo de todo o genoma, por estarem contidas nos íntrons gênicos. Apresentam unidades de repetição compostas por 3 a 7 pb (pares de bases). Por apresentarem tamanho menor que 350 pb, sua análise é feita a partir da técnica da PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). Essas características permitem que os marcadores STR sejam os mais apropriados para a análise forense, visto que é possível a análise de quantidades ínfimas de amostras biológicas, inclusive degradadas. São analisadas um mínimo de 16 regiões STR, para um poder de inclusão incontestável. Tal análise é permitida a partir do uso de sistemas MULTIPLEX, onde vários Primers orientam a amplificação simultânea de todas as regiões analisadas. INDELS Os polimorfismosdo tipo INDELS apresentam variações de comprimento geradas por inserções ou deleções de um ou mais nucleotídeos dentro de uma região do DNA. Esses marcadores vêm demostrando grande relevância como ferramenta forense por apresentarem características funcionais dos SNPs (polimorfismo de único nucleotídeo), como, por exemplo, apresentar fragmentos curtos com baixas taxas de mutação, além de apresentarem facilidade na genotipagem, assim como os STR, em uma única reação de PCR, e sendo detectados por eletroforese. Quando usados, faz-se concomitante com o uso de genotipagem de STR. POLIMORFISMOS GENÉTICOS Assista ao vídeo sobre polimorfismo genético e critérios estatísticos, principal ferramenta usada pelo geneticista forense. VERIFICANDO O APRENDIZADO 1. NA HERANÇA AUTOSSÔMICA, OS GENES EM QUESTÃO ESTÃO CONTIDOS NOS CROMOSSOMAS: A) X B) Y C) Par 23 D) Par 1 ao 22 2. UM MARCADOR GENÉTICO É DITO POLIMÓRFICO QUANDO: A) Sua frequência for menor do que 1%. B) Sua frequência for maior do que 20%. C) Sua frequência for maior do que 1%. D) Sua frequência for maior do que 50%. GABARITO 1. Na herança autossômica, os genes em questão estão contidos nos cromossomas: A alternativa "D " está correta. Na herança autossômica, os genes estarão contidos nos cromossomas do par 1 ao 22, pois estes são os autossomas, visto que não participam diretamente da diferenciação sexual do embrião. 2. Um marcador genético é dito polimórfico quando: A alternativa "C " está correta. Um marcador genético é dito polimórfico quando sua frequência na população for maior do que 1%, ou seja quando, em um grupo de 100 pessoas, mais de uma apresente aquele marcador. MÓDULO 3 Descrever os métodos de análise molecular aplicados à genética forense HIBRIDIZAÇÃO DE DNA (RFLP) Desde a década de 1980, quando Alec Jeffreys realizou os primeiros usos de marcadores genéticos para estabelecer vínculo genético e contribuiu com suas pesquisas para a área criminal, muitos foram os avanços observados no setor técnico. A seguir vamos apresentar as principais técnicas de rotina em genética forense. ALEC JEFFREYS Alec Jeffreys (1950) é um pesquisador e professor britânico, considerado o fundador da área que ficou internacionalmente conhecida como DNA Fingerprint. Hibridização de DNA (RFLP) – Restriction Fragment Lenght Polymorphism São amplamente usados em genética forense. Trata-se da diferença nas sequências de DNA homólogas que podem ser detectadas pela presença de fragmentos de diferentes comprimentos. Para esta análise, é realizado o processo de digestão das amostras do DNA em questão com endonucleases de restrição específicas. Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal O RFLP, como marcador molecular, é específico para uma única combinação de clone/enzima de restrição. A maioria dos marcadores de RFLP é codominante (ambos os alelos na amostra heterozigótica serão detectados) e altamente específicos do local. Uma sonda de RFLP é uma sequência de DNA marcada que hibridiza com um ou mais fragmentos da amostra de DNA digerida após serem separados por eletroforese em gel, revelando assim um padrão de mancha único característico para um genótipo específico em um local específico. Os clones de DNA ou cDNA genômico de cópia curta ou única, ou baixa cópia são tipicamente usados como sondas de RFLP. ATENÇÃO A técnica básica para a detecção de RFLPs envolve a fragmentação de uma amostra de DNA com a aplicação de uma enzima de restrição, que pode clivar seletivamente uma molécula de DNA sempre que uma sequência curta e específica for reconhecida em um processo conhecido como resumo da restrição. Fonte: taraki/Shutterstock Os fragmentos de DNA produzidos pela digestão são então separados por comprimento através de um processo conhecido como eletroforese em gel de agarose e transferidos para uma membrana através do procedimento de Southern blot. A hibridação da membrana com uma sonda de DNA marcada determina o comprimento dos fragmentos que são complementares à sonda. Diz-se que um polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição ocorre quando o comprimento de um fragmento detectado varia entre indivíduos, indicando homologias de sequência não idênticas. Cada comprimento de fragmento é considerado um alelo, se ele realmente contém uma região de codificação ou não, e pode ser usado em análises genéticas subsequentes. Notas (A) As sondas RFLP são frequentemente usadas no mapeamento do genoma e na análise de variações (genotipagem, análise forense, testes de paternidade, diagnóstico de doença hereditária etc.). (B) RFLP é uma técnica que explora variações nas sequências de DNA homólogas, conhecidas como polimorfismos, para distinguir indivíduos, populações ou espécies, ou para identificar a localização dos genes em uma sequência. Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal PCR E SUAS VARIAÇÕES A técnica de PCR – Reação em Cadeia da Polimerase – é amplamente usada na genética forense e em outros campos do diagnóstico e pesquisa. A PCR é um método usualmente empregado para gerar rapidamente de milhões a bilhões de cópias de uma amostra específica de DNA, permitindo que os cientistas que colham uma amostra muito pequena de DNA e a amplifiquem em uma quantidade suficientemente grande para estudar em detalhes. VOCÊ SABIA A PCR foi inventada em 1984 pelo bioquímico americano Kary Mullis na Cetus Corporation. É fundamental para muitos dos testes genéticos, incluindo análise de amostras antigas de DNA e identificação de agentes infecciosos. Usando PCR, cópias de quantidades muito pequenas de sequências de DNA são amplificadas exponencialmente em uma série de ciclos de mudanças de temperatura. A PCR agora é uma técnica comum e, muitas vezes, indispensável usada em pesquisas de laboratório médico e laboratório clínico para uma ampla variedade de aplicações, incluindo pesquisa biomédica e forense criminal. A maioria dos métodos de PCR depende de ciclos térmicos. A ciclagem térmica expõe os reagentes a ciclos repetidos de aquecimento e resfriamento para permitir diferentes reações dependentes da temperatura - especificamente, fusão do DNA e replicação de DNA acionada por enzimas. A PCR emprega dois reagentes principais: Iniciadores - que são fragmentos curtos de DNA de cadeia simples conhecidos como oligonucleotídeos que são uma sequência complementar à região de DNA alvo Uma polimerase de DNA. Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal DESNATURAÇÃO ANELAMENTO OU HIBRIDAÇÃO DOS PRIMERS EXTENSÃO OU POLIMERIZAÇÃO DESNATURAÇÃO Na primeira etapa da PCR, denominada desnaturação, as duas cadeias da dupla hélice do DNA são separadas fisicamente em alta temperatura em um processo chamado desnaturação do ácido nucleico. ANELAMENTO OU HIBRIDAÇÃO DOS PRIMERS No segundo passo, chamado anelamento ou hibridação dos primers (iniciadores), a temperatura é reduzida e os iniciadores se ligam às sequências complementares de DNA. As duas fitas de DNA tornam-se modelos para a DNA polimerase montar enzimaticamente uma nova fita de DNA a partir de nucleotídeos livres, os blocos de construção do DNA. EXTENSÃO OU POLIMERIZAÇÃO À medida que a PCR progride, o próprio DNA gerado é usado como modelo para replicação, pondo em movimento uma reação em cadeia, na qual o modelo original de DNA é amplificado exponencialmente (extensão ou polimerização). Quase todas as aplicações de PCR empregam uma polimerase de DNA estável ao calor, como a polimerase Taq, uma enzima originalmente isolada da bactéria termofílica Thermus aquaticus. Se a polimerase utilizada fosse suscetível ao calor, ela desnaturaria sob as altas temperaturas da etapa de desnaturação. Antes do uso da polimerase Taq, a polimerase de DNA precisava ser adicionada manualmente a cada ciclo, o que era um processo tedioso e caro. ATENÇÃO A maioria dos laboratórios forenses emprega a técnica de PCR na avaliação de marcadoresSTR. PCR EM TEMPO REAL É uma variação do tema da PCR que combina a amplificação normal do DNA pela PCR com a detecção simultânea do produto de amplificação, geralmente, em um único tubo de reação. Na PCR, a quantidade de DNA de fita dupla aumenta a cada ciclo. Após múltiplos ciclos de PCR, há um grande aumento na quantidade de DNA. Na PCR em tempo real, também chamada de PCR quantitativa, ou qPCR, um agente que se liga ao DNA de fita dupla é adicionado à reação de PCR. À medida que o DNA de fita dupla é produzido, o agente se liga ao DNA recém-sintetizado e produz um sinal que permite que a reação seja monitorada em tempo real. Embora o objetivo da PCR seja a amplificação do DNA, o objetivo da PCR em tempo real é a análise de uma amostra ou reação de DNA. PCR FLUORESCENTE EM TEMPO REAL É uma combinação de amplificação por PCR e detecção de fluorescência. Na sua forma mais simples, a PCR fluorescente em tempo real envolve o uso de um corante orgânico que é fluorescente apenas quando ligado a um duplex de DNA. Quando esse corante é adicionado no início de uma reação de PCR, ocorre um aumento na fluorescência à medida que o número de duplexes de DNA aumenta, e isso é indicativo de PCR bem-sucedido. SYBR Green é um exemplo de molécula que se liga ao DNA de fita dupla e se torna fluorescente na ligação (o complexo dsDNA-corante é fluorescente). ELETROFORESE CAPILAR E ELETROFEROGRAMA DE DNA A eletroforese capilar (CE) é a principal metodologia usada para separar e detectar alelos STR em laboratórios forenses de DNA em todo o mundo. Para obter uma tipagem STR confiável, três condições devem ser atendidas: Primeiro, é necessária resolução espacial para separar os alelos STR que diferem em tamanho por um único nucleotídeo. Segundo, é necessária uma resolução espectral para separar as cores dos corantes fluorescentes umas das outras, para que os produtos de PCR dos locais marcados com diferentes corantes possam ser resolvidos. Terceiro, a precisão do dimensionamento do DNA para execução é consistente o suficiente para que as amostras sejam relacionadas a escadas alélicas executadas para fins de calibração. Fonte: Wikimedia Gel de eletroforese de DNA. O diagrama mostra o processo em que uma corrente elétrica é aplicada às amostras de DNA criando fragmentos que podem ser usados para comparação entre amostras de DNA 1) extração do DNA; 2) isolamento e amplificação do DNA; 3) adição do DNA às placas de gel; 4) Corrente elétrica aplicada ao gel; 5) As bandas de DNA são separadas por tamanho; 6) As bandas de DNA são coradas. Os elementos primários de um instrumento de CE básico incluem um capilar de vidro estreito, dois frascos-tampão e dois eletrodos conectados a uma fonte de alimentação de alta tensão. Os sistemas CE também contêm uma fonte de excitação a laser, um detector de fluorescência, a bandeja de amostras e um computador para controlar a injeção e detecção de amostras. SEQUENCIAMENTO DE DNA O início do século XXI testemunhou uma revolução em nosso conhecimento das sequências de DNA de vários organismos; o exemplo mais notável é o sequenciamento do genoma humano. A análise do DNA genômico nos permitirá aprender muito sobre a evolução, a relação entre diferentes organismos, os mecanismos pelos quais os genes são controlados, a suscetibilidade a doenças e as linguagens ocultas na sequência do DNA. ATENÇÃO O sequenciamento de um genoma inteiro ainda não é uma técnica de rotina e outros métodos de análise genética são usados para analisar rápida e efetivamente amostras de DNA. Esses métodos e tecnologias como a impressão digital do DNA também transformaram a ciência forense. Métodos estabelecidos de sequenciamento de DNA, análises genéticas e forenses dependem do uso de oligonucleotídeos marcados e/ou desoxi ou didesoxinucleosídeo trifosfatos e requerem uma etapa de polimerização do DNA. Pode ser a reação em cadeia da polimerase (análise genética na análise STR), uma única extensão de nucleotídeo (minisequenciamento na análise SNP) ou uma combinação de polimerização e terminação da cadeia de DNA. Tudo isso foi possível devido aos métodos desenvolvidos por Fred Sanger em Cambridge, há algumas décadas. Sanger desenvolveu um novo método de sequenciamento de DNA (o método didesoxi), pelo qual recebeu seu segundo Prêmio Nobel, em 1980. SAIBA MAIS Next-generation sequencing (NGS) - O Projeto Genoma Humano alcançou o sequenciamento completo dos 3 pares de bases de bilhão do genoma humano, como resultado de um enorme esforço colaborativo entre 1990 e 2003. O Projeto Genoma Humano contou com o sequenciamento Sanger (embora com alta otimização e automatização). Agora, é possível sequenciar um genoma humano inteiro em questão de dias, graças a uma nova geração de tecnologias de sequenciamento, conhecidas coletivamente como sequenciamento de DNA da próxima geração. PRINCIPAIS MÉTODOS DE ANÁLISE MOLECULAR Veja agora o vídeo sobre as principais ferramentas moleculares para identificação humana: AmpFLP (PCR) e RFLP (Enzima de Restricção). VERIFICANDO O APRENDIZADO 1. SÃO ETAPAS DA PCR - REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE: A) Desnaturação – Anelamento ou hibridização - Extensão ou polimerização. B) Renaturação – DNA polimerase – hibridização. C) Separação das fitas do DNA – Anelamento – Repetição. D) DNA polimerase – ligação – conclusão. 2. O SEQUENCIAMENTO DE DNA É O PROCESSO DE DETERMINAÇÃO DA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS (AS, TS, CS, E GS) EM UM PEDAÇO DE DNA. EM RELAÇÃO AO NGS – NEXT GENERATION SEQUENCING – É CORRETO AFIRMAR QUE: A) Técnica para sequenciar partes pequenas do genoma. B) São novas abordagens feitas em grande escala que aumentam a velocidade e diminuem os custos do sequenciamento. C) Técnica de sequenciamento semiautomatizado. D) Sequenciamento de sequências codificantes do DNA. GABARITO 1. São etapas da PCR - Reação em Cadeia da Polimerase: A alternativa "A " está correta. A PCR padrão é realizada em 3 etapas, a saber: 1 – DESNATURAÇÃO (O DNA genômico contendo a sequência a ser amplificada é desnaturado por aquecimento a 89°C ou mais, por cerca de 30-60 segundos. A dupla fita é aberta (desnaturada), tornando-se uma fita única; 2 – ANELAMENTO OU HIBRIDIZAÇÃO (depois da separação das fitas, um par de iniciadores ou primers (uma fita de DNA específica para o gene que se quer estudar) complementam a fita oposta da sequência de DNA a ser amplificada. Ou seja, um deles é complementar à sequência em uma fita da dupla hélice de DNA e o outro é complementar à sequência na outra fita. O molde é determinado pela posição dos iniciadores que se anelam à fita. Essa etapa ocorre muitas vezes a uma temperatura de 60°C; 3 – EXTENSÃO OU POLIMERIZAÇÃO (com o molde já identificado, a enzima DNA-polimerase adiciona as bases complementares, formando uma nova fita e então tem-se novamente a duplicação da fita de DNA. Esse processo acontece a uma temperatura de 72°C - observe que a enzima escolhida afeta a temperatura da etapa). 2. O sequenciamento de DNA é o processo de determinação da sequência de nucleotídeos (As, Ts, Cs, e Gs) em um pedaço de DNA. Em relação ao NGS – Next Generation Sequencing – é correto afirmar que: A alternativa "B " está correta. A NGS refere-se a método de sequenciamento rápido e de grandes porções de DNA, tendo permitido avanços significativos na genética médica e forense. MÓDULO 4 Identificar os marcadores genéticos complementares LINHAGEM PATERNA Quando falamos em marcadores genéticos complementares, estamos nos referindo aos marcadores presentes nos cromossomos sexuais, X e Y. Desta forma, eles podem ser da linhagem paterna e da linhagem materna. Vamos começar com a paterna. MARCADORES GENÉTICOS NO CROMOSSOMO Y Algumas observações sobre o cromossoma Y e os marcadores Y-STR foram descobertas e introduzidas nas ciências forenses em 1992. OS MARCADORES STR PRESENTES NESTE CROMOSSOMO TÊM UM ALTO VALOR INFORMATIVO PARA ANÁLISES DE POLIMORFISMO EM TESTE DE PATERNIDADE POR ESTABELECERA PATRILINHAGEM, HERANÇA GÊNICA PATERNA, QUE NÃO SOFRE RECOMBINAÇÃO. (BUTLER, 2003) STR STR (Short Tandem Repeats) - repetições curtas in tandem - estudamos no módulo 2. O cromossomo sexual Y pertence ao grupo G, e sua classificação é “pequeno e acrocêntrico”, ou seja, é curto e o centrômero está próximo da extremidade de um dos braços. Ele possui cerca de 60 milhões de pares de bases, sendo o terceiro menor cromossomo do cariótipo humano. O cromossoma Y possui duas regiões homólogas ao X, essas regiões são chamadas de PAR1 (região pseudoautossômica 1) e PAR2 (região pseudoautossômica 2) localizadas nas regiões distais dos braços longo e curto de ambos os cromossomos. Nesta região, encontra-se o gene da amelogenina (componente do esmalte dentário). Marcadores Y-STR podem ser usados para traçar a linhagem paterna de um homem. O cromossomo sexual "Y" (e os marcadores STR que contém) é passado de um pai para seus filhos (herança holândrica); as mulheres não recebem um cromossoma Y dos pais. Testar o cromossomo Y permite investigar a linhagem paterna de um homem e pode ajudar a identificar linhas de sobrenome, parentes vivos cujo cromossomo Y é semelhante ao seu e rotas de migração antigas que seus ancestrais paternos podem ter adotado. Estes marcadores são muito empregados em casos de crime sexual, para facilitar a comparação dos marcadores Y-STR com o perfil do(s) suspeito(s). Perfil haploide pode fazer a interpretação fácil e direta. Estes marcadores não discriminam entre homens de uma mesma linhagem paterna e, por isso, são utilizados para estabelecer a patrilinhagem. É um marcador usado para sexagem (estipular o sexo genético), em casos de ossadas encontradas em covas clandestinas ou sítios arqueológicos. Assim como para os STR autossômicos, é preciso conhecimento prévio das frequências populacionais. Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal HAPLOIDE O haplotipo é um grupo de alelos em um organismo que são herdados juntos, de um único progenitor. ACROCÊNTRICO Quando o centrômero está mais próximo das extremidades do que do centro (mas não nas extremidades de uma cromátide). INTERPRETAÇÃO O conhecimento das taxas de mutações nestes marcadores é mister para que se possa evitar uma falsa exclusão em casos onde seja vista discrepância alélica entre pai biológico e o filho devido a uma mutação (KURIHARA et al., 2004). ATENÇÃO Nota: Ao contrário dos cromossomos independentes de gênero normalmente usados por geneticistas forenses, o cromossomo Y carrega mutações por muitas gerações, fornecendo linhagens masculinas inequívocas. Para diferenciar os cromossomos, os geneticistas usam haplótipos - pedaços de DNA contendo variações genéticas intimamente ligadas, as quais foram herdadas como uma unidade. ESTUDO DE CASO A seguir, um caso é parcialmente apresentado para ilustrar o tema. CASO 1 Um jovem pede reconhecimento de paternidade, com o suposto pai -SP- ausente. Todavia, estão disponíveis dois irmãos do SP, ditos iSP1 e iSP2. Feita a análise de DNA a partir de Y- STR, os resultados são parcialmente dispostos a seguir: Tabela 1 – Resultado parcial das análises de Y-STR do caso 1. Locus Investigado (filho) iSP1 iSP2 DYS392* 13 13 13 DYS390 25 25 25 DYS385 12 ,14 12 ,14 12 ,14 DYS393 13 13 13 DYS89I 14 14 14 Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal Fonte: O autor. Nota: DYS é uma variação de jargão usado onde o segundo caractere reflete o cromossomo, como, por exemplo, D8S1179 para o cromossomo 8. D= DNA Y = Cromossomo Y S= Segmento único Observe que, nesta tabela 1, há coincidência de todos os alelos entre o indivíduo que requer o reconhecimento da paternidade e os irmãos do SP, indicando possibilidade de pertencerem a uma mesma linhagem paterna. Há, contudo, obrigatoriedade de conduzir a análise estatística para inferir a força deste achado. Podemos concluir que o uso dos Y-STR é amplo, sendo especialmente importante para casos de mistura com componentes masculino e feminino, como em agressões sexuais e também em análise de patrilinhagem. O cromossomo Y haploide herdado paternamente compreende o maior componente não recombinante do genoma humano. A maior parte da molécula escapa aos efeitos embaralhados da recombinação e representa a maior região haplotípica do genoma humano. O acúmulo sequencial de dados únicos, substituições de nucleotídeos (SNPs) e pequenas inserções ou deleções (DIPs) através das gerações, podem ser determinados. Os marcadores Y-STR possuem o mesmo poder de discriminação que os STR autossômicos? Um Y-STR é uma repetição curta em tandem (STR) no cromossomo Y. Os Y-STRs são frequentemente usados em testes forenses, paternidade e de DNA genealógico. Os Y-STRs são retirados especificamente do cromossomo Y masculino. Esses Y-STRs fornecem uma análise mais fraca (estatisticamente) que os STRs autossômicos, porque o cromossomo Y é encontrado apenas nos machos, que são transmitidos apenas pelo pai, tornando o cromossomo Y em qualquer linha paterna praticamente idêntico. Isso causa uma quantidade significativamente menor de distinção entre as amostras Y-STR. Os STRs autossômicos fornecem um poder analítico muito mais forte devido à correspondência aleatória que ocorre entre pares de cromossomos durante o processo de formação do zigoto. ATENÇÃO A parte especificamente “masculina” do cromossomo Y humano é amplamente usada na análise de DNA forense, particularmente, nos casos em que o perfil de DNA autossômico padrão não é suficientemente informativo. Marcadores genéticos para o cromossomo Y são aplicados para inferir o sexo biológico de um doador de rastreamento de cena de crime. Os haplótipos compostos por polimorfismos de repetição cromossômica curta em tandem Y (STRs) são usados para caracterizar linhagens paternas de doadores masculinos desconhecidos, especialmente adequados quando homens e mulheres contribuíram para o mesmo traço, como em casos de agressão sexual. Fonte: fizkes/Shutterstock LINHAGEM MATERNA Em muitas investigações é necessário traçar a linhagem materna, bem como marcadores no DNA mitocondrial podem também servir para identificações e comparações realizadas a partir de materiais antigos, como ossadas. MARCADORES GENÉTICOS NO CROMOSSOMO X Algumas observações sobre o cromossomo X e os marcadores X-STR: A origem dos cromossomos sexuais X e Y em humanos parece ser autossômica, com a aquisição por um dos pares autossômicos de um loco de determinação sexual como o fator de determinação testicular (TDF - Testis-determining factor). Indivíduos do sexo feminino possuem duas vezes cópias de genes do cromossomo X, contra somente uma do sexo masculino, ao se considerar o padrão diploide “normal”. Um dos cromossomos X da mulher é parcialmente inativado durante o período embrionário (13ª a 16ª semana) de seu desenvolvimento, sendo a inativação transferida a todas as células somáticas (que não são espermatozoide e óvulo). Na ovogênese, ocorre a reativação do segundo cromossomo X feminino, que se recombina com o primeiro. No sexo masculino, a recombinação do cromossomo X ocorre nas regiões denominadas pseudoautossômicas. O cromossomo X equivale a aproximadamente 5% do genoma das células somáticas em mulheres (2,5% para homens). Os marcadores localizados neste cromossomo têm um padrão de herança particular: as mulheres são dizigóticas e os homens são hemizigotos. Marcadores STR ligados ao cromossomo X possuem aplicação também na genética médica. Uma das aplicações do estudo de marcadores ligados ao cromossomo X está na análise de vinculo genético entre criança do sexo feminino e um suposto pai. O uso de X-STRs requer um conhecimento preciso não somente das frequências de alelos e haplótipos, mas ainda do status de ligação genética e desequilíbrio de ligação entre os marcadores. Marcadores neste cromossomo podem ser úteis para traçar linhagem materna. Exemplos de marcadores de X-STRsusados em genética forense: DXS10159- DXS10162-DXS10164, DXS7132-DXS10079-DXS10074-DXS10075, DXS6809- DXS6789, DXS7424-DXS101, DXS10103-HPRTB-DXS10101 e DXS10134- DXS7423, entre outros. Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal DNA MITOCONDRIAL A mitocôndria é uma organela responsável, dentre outras coisas, pela produção de energia na forma de ATP, a partir da respiração aeróbia. SAIBA MAIS Acredita-se que ela, na origem da vida, foi uma bactéria não patogênica que infectou uma célula eucariótica e, a partir daí, estabeleceu com seu hospedeiro uma relação de simbiose. O que corrobora para este fato é que a mitocôndria apresenta um metabolismo independente de ordens do núcleo celular. Isso porque, ela apresenta DNA (único e circular) e ribossomos próprios. SIMBIOSE Relação entre espécies diferentes, em que ambas se beneficiam. Em seu genoma apresenta cerca de 37 genes diferentes e regiões de interesse forense. O DNA mitocondrial (mtDNA) possui marcadores genéticos (regiões do genoma) utilizáveis em genética forense. Elas são denominadas regiões hipervariáveis HV1 e HV2. A tipagem dessas regiões é utilizada na genética forense para estipular a matrilinhagem, visto que as mitocôndrias que apresentamos em nossas células, são todas herdadas de nossa mãe. Isso ocorre porque as mitocôndrias que temos são as que estavam contidas no citoplasma dos ovócitos durante a fecundação, já que as mitocôndrias do espermatozoide degeneram junto com sua cauda da região controle e compreende o sequenciamento destas com posterior análise e interpretação. Sobre o uso forense do mtDNA pode-se ressaltar que: 1. Em determinadas situações, a análise do DNA nuclear não pode ser aplicada (como em casos onde o DNA está degradado ou em que o material biológico não apresenta o DNA nuclear). Nesses casos, é comum lançar mão da análise de mtDNA. 2. Em um mesmo indivíduo, podem existir populações de mtDNA diferentes, fenômeno denominado heteroplasmia. Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal HETEROPLASMIA Presença de mais do que um tipo de genoma mitocondrial em uma mesma célula ou grupo de células de um organismo, em função de possíveis mutações que o genoma mitocondrial pode sofrer. DEGRADADO Essa degradação da amostra de DNA pode ser causada por exposição a elementos, como: fogo, ou por contaminação de micro-organismos, como bactérias e fungos, que são capazes de danificar a amostra através de processos oxidativos e bioquímicos. Normalmente, os seres humanos herdam o DNA mitocondrial de seu progenitor feminino. Todavia, a partir de dados de sequenciamento dos genomas mitocondriais de famílias, pesquisadores já foram capazes de identificar pessoas que herdaram o mtDNA de ambos os pais. Como é a correspondência (match) entre as amostras de mtDNA? O mtDNA pode ser dividido em três regiões principais: a codificação e as regiões HVR1 e HVR2 altamente variáveis. O mtDNA é comparado a uma sequência de referência conhecida para retornar as diferenças entre eles na forma de uma lista de polimorfismos de nucleotídeo único. Normalmente, uma ou ambas as regiões HVR1 e HVR2 são sequenciadas, pois são muito mais específicas para um indivíduo do que a região de codificação, que é altamente conservada. A amplificação da reação em cadeia da polimerase (PCR), geralmente, é realizada em uma amostra de mtDNA para aumentar a quantidade de DNA disponível para análise, seguida por técnicas como o sequenciamento de Sanger. ATENÇÃO O DNA mitocondrial vem sendo usado para resolver vários mistérios da antiguidade, como a linhagem de múmias dos povos do Egito e Inca. Veja algumas leituras a respeito no “Explore +”. ESTUDO DE CASO CASO 2 Mitochondrial DNA: State of Tennessee v. Paul Ware (DAVIS, 1998). Resumo: Suspeito, Paul Ware, 27 anos, foi preso, acusado de violentar e assassinar uma menina de quatro anos de idade. A prisão deu-se com base em evidências circunstanciais. Na época, a defesa alegou haver outro homem na casa. Ware, contudo, havia sido visto bêbado e próximo ao corpo da vítima. Não foi encontrado sêmen e o sangue da vítima nas roupas do acusado não foi identificado. Contudo, fios de cabelo ruivos foram recuperados do dormitório da vítima e de seu corpo, na autopsia. A partir daí, a extração de mtDNA foi realizada e confrontado com o resultado de uma amostra de saliva do suspeito. Resultado: não eram da mesma pessoa, o que reforçou a alegação da defesa do acusado. Ao se colocarem os dados obtidos de Ware e dos fios de cabelo em um banco de dados da justiça, também não se observou emparelhamento. Notas (1) O mtDNA é, frequentemente, usado em investigações onde as amostras disponíveis são fios de cabelo com raiz e ossos. (2) Em 1995, o FBI Crime Lab conduziu um importante estudo de validação para o uso de mtDNA na esfera criminal. (WILSON et al., 1995) Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal ATENÇÃO O mtDNA é altamente conservado, o que significa que, embora sofra recombinação, ele se recompõe com o que deveria ser cópias idênticas de si mesmo. No entanto, a taxa de mutação do mtDNA é dez vezes maior que a do DNA nuclear. Essa propriedade o torna extremamente útil para estabelecer a evolução das espécies ao longo de muitas gerações através da linha matrilinear. O genoma do mtDNA foi inteiramente sequenciado para muitas espécies e grupos de seres humanos de uma ampla variedade de grupos étnicos. É de fita dupla, assim como o DNA nuclear, embora esteja disposto em uma conformação de loop circular. Fonte:Shutterstock E mais... O debate sobre a validade e a confiabilidade dos métodos científicos, geralmente, surge no tribunal. Quando o governo (ou seja, a Promotoria) é o proponente da evidência, a defesa é obrigada a contestar sua admissibilidade. Independentemente disso, aqueles que procuram usar metodologias de tipagem de DNA para analisar evidências biológicas forenses têm a responsabilidade de entender a tecnologia e suas aplicações, para que possam ser estabelecidas as bases adequadas para seu uso. O DNA mitocondrial (mtDNA), um genoma extranuclear, possui certas características que o tornam desejável para a ciência forense, a saber, alto número de cópias, falta de recombinação e herança matrilinear. A tipificação do mtDNA tornou-se rotina na biologia forense e é usada para analisar ossos, dentes, fios de cabelo e outras amostras biológicas antigas, em que o conteúdo de DNA nuclear é baixo. COMENTÁRIO Para avaliar os resultados obtidos pelo sequenciamento das duas regiões hipervariáveis da região de controle do genoma do mtDNA humano, é preciso considerar as questões geneticamente relacionadas da nomenclatura, bancos de dados populacionais de referência, heteroplasmia, vazamento paterno, recombinação e, é claro, interpretação dos resultados. VANTAGENS E LIMITAÇÕES DE CADA MARCADOR GENÉTICO COMPLEMENTAR Vamos agora discutir alguns tipos de marcadores genéticos usados para identificação humana por DNA e/ou estabelecimento de vínculo genético. Alguns desses, por vezes, são empregados como marcadores complementares, mas também podem ser os marcadores de escolha. AMELOGENINA Este marcador de gênero (identificação ou tipagem de sexo) é usualmente realizado em conjunto com kit de tipagem STR. Os produtos de PCR gerados a partir do gene amelogenina possui tamanhos diferentes para os cromossomos Y e X. Notas (1) A capacidade de determinar o sexo de um indivíduo com base no DNA evidência pode ser crucial em casos como a identificação de vítimas de desastre em massa, investigação de pessoas desaparecidas e casos de agressão sexual. Atualmente, o marcador do cromossomo Y amelogenina é amplamente difundido para determinação do sexo cromossômico de um doador de DNA desconhecido e diferenciando as contribuições relativas do DNA masculino e feminino em uma amostra forense mista. (2) Os laboratórios forenses que atuam no campoda genética devem possuir protocolos de rotina para a determinação de gênero e dispor de métodos alternativos para confirmação ou esclarecimento de resultados dúbios. Atenção! Para visualização completa da tabela utilize a rolagem horizontal MINI-STR As amostras de DNA degradadas são comumente observadas em investigações forenses envolvendo evidências biológicas. A recuperação de informações dessas amostras degradadas, geralmente, é aprimorada pelo uso de produtos de PCR menores. Os amplificadores STR de tamanho reduzido podem ser criados movendo os iniciadores de PCR para frente e para trás na região próxima à repetição do STR. Esses chamados ensaios mini-STR podem ajudar a recuperar informações de amostras de DNA degradadas que, normalmente, produzem perfis parciais e uma perda total de informações de amplificadores STR maiores. MINI-STR Reduced-size STR Amplicons. É possível, no caso dos mini-STRs, submeter à amplificação simultânea de vários loci em uma única reação de PCR, permitindo assim, a análise conjunta dos produtos amplificados. Tal fato proporciona o aumento do poder de discriminação da técnica aplicada e a diminuição não só do tempo de análise, como também das quantidades de DNA e de reagentes utilizados comparado ao kit comercial multiplex STR convencional. Alguns eventos históricos a respeito do uso dos mini-STR: 1994 Análise do caso Branch Davidian fire in Waco, Texas – uso de 4 mini-STR com melhor resultado que os marcadores tradicionais para amostras degradadas. 1997 John Butler e colegas submetem pedido de patente para Sistema multiplex contend mini-STR em espectometria em massa. 2001 Aceito o uso dos mini-STR para análise das vítimas do World Trade Center. ATENÇÃO Os mini-STR são amplicons reduzidos em tamanho dos STR que permitem maior informação a partir de amostras degradadas. USO DE MARCADORES GENÉTICOS COMPLEMENTARES Assista ao vídeo a seguir para aprender mais sobre marcadores genéticos complementares, seus usos e limitações. VERIFICANDO O APRENDIZADO 1. O USO DE MARCADORES DO CROMOSSOMO Y É UMA GRANDE FERRAMENTA PARA O GENETICISTA FORENSE EM FUNÇÃO DE: A) Estipular a origem da calvície. B) Estipular a matrilinhagem. C) Estipular a patrilinhagem. D) Estipular o vínculo genético com avô materno. 2. PODE-SE DEFINIR HETEROPLASMIA COMO SENDO: A) Alteração envolvida na análise dos X-STR e Y-STR. B) Presença de mais do que um tipo de genoma mitocondrial em uma mesma célula ou grupo de células de um organismo. C) Presença de somente um tipo de genoma mitocondrial em uma mesma célula ou grupo de células de um organismo. D) Conceito sem aplicação na genética forense, pois envolve marcadores de baixo nível de polimorfismo. GABARITO 1. O uso de marcadores do cromossomo Y é uma grande ferramenta para o geneticista forense em função de: A alternativa "C " está correta. Em função da herança holândrica, são herdados de seu pai, que, por sua vez, são herdados de seu pai, e assim sucessivamente. Todos os indivíduos do sexo masculino geneticamente relacionados vão, em princípio, apresentar os mesmos marcadores para cromossoma Y. Por isso, conseguimos estipular uma linhagem de homens inteira. 2. Pode-se definir heteroplasmia como sendo: A alternativa "B " está correta. Em função de, possivelmente, ocorrerem mutações pontuais no genoma da mitocôndria, poderemos encontrar incongruência nas tipagens, levando ao resultado falso-negativo. A heteroplasmia torna-se uma vantagem para a genética médica, pois é por conta dela que uma mãe afetada com doença mitocondrial poderá ter filhos normais. O conceito de heterosplamia diz respeito à coincidência de mais do que um tipo de genoma mitocondrial em um organismo. CONCLUSÃO CONSIDERAÇÕES FINAIS Como vimos aqui, a herança genética de uma população e a existência de um perfil genético único para cada indivíduo acabaram se tornando revelações conceituais valiosas no auxílio às técnicas de identificação por DNA, não só nas investigações forenses convencionais, como também na solução de crimes (HILL et al, 2008). Após a ocorrência de um crime, o perito é chamado para auxiliar na identificação e análise de vestígios, buscando entender como, quando e em que circunstâncias o fato aconteceu. Por essa razão, o perito que atua em genética forense precisa conhecer os diferentes marcadores genéticos e suas aplicações, bem como as limitações técnicas de cada tipo. Na investigação de vínculo genético, não é diferente, o perfeito entendimento das necessidades de um caso é necessário para o emprego dos recursos adequados. Em adição, os conhecimentos do perito podem ser usados em outros campos do saber, como na arqueologia e genética médica. AVALIAÇÃO DO TEMA: REFERÊNCIAS AGOSTINHO, L., PARADELA, E. R., FIGUEIREDO, A. L. S, PAIVA, C. Construção de sistema multiplex utilizando cinco marcadores mini-STR (short amplicons) para identificação humana por análise de DNA. Revista Científica da Faminas, 2012. BUTLER, J. M. Recent Developments in Y-Short Tandem Repeat and Y- single Nucleotide poly¬morphism Analysis. Forensic Sci. Rev., 2003. COBLE, M. D., BUTLER, J. M. Characterization of new miniSTR loci to aid analysis of degraded DNA. J Forensic Sci., 2005. DAVIS, L. Mitochondrial DNA: State of Tennessee v. Paul Ware. Profiles in DNA, 1998. FIGUEIREDO, A.L.S; PARADELA, E. Bancos de dados de DNA: Uma ferramenta investigativa útil. In: Âmbito Jurídico. Rio Grande, IX, n. 32, 2006. HILL, C. R. et al. Characterization of 26 miniSTR loci for improved analysis of degraded DNA samples. J Forensic Sci., v. 53, n. 1, 2008. KURIHARA R et al. Mutations in 14 Y-STR loci among japanise father-son haplotipes. Int J Legal Med., 2004. PARADELA, E. R.; FIGUEIREDO, A.; SMARRA, A. A identificação humana por DNA: aplicações e limites. In: Âmbito Jurídico. Rio Grande, IX, n. 30, 2006. STRACHAN, T; READ, A. P. Genética molecular humana. 4. ed. Porto Alegre: Artmed, 2002. WILSON, M.R. et al. Validation of mitochondrial DNA sequencing for forensic casework analysis. Int. J. Leg. Med., 1995. EXPLORE+ Para saber mais sobre os assuntos explorados neste tema: Leia: MARASCIULO, M. 7 testes genéticos que descobrem sua ancestralidade. In: Revista Galileu. Publicado em: 15 abr. 2020. Pesquise: EMPOP. Banco de Dados EMPOP. In: Empop. Atualizado em: 28 nov. 2019. NIST. Banco de Dados de Proteínas Mitocondriais Humanas. In: National Institute of Standards and Technology. Atualizado em: 1 fev. 2017. NIST. Short Tandem Repeat DNA Internet Data Base. In: National Institute of Standards and Technology. Atualizado em: 31 jul. 2020. Obtenha informações do NIST sobre marcadores realizando a pesquisa neste banco de dados de referência. CONTEUDISTA André Luis dos Santos Figueiredo CURRÍCULO LATTES