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Bioquímica Experimental - 2023
Revisão dos relatórios
1
Juçara Gastaldi Cominal
2
AULA 1 – PROPRIEDADES ÁCIDO-BASE DE AMINOÁCIDOS
Estrutura geral
• Cadeia lateral (grupo variável)
• Caráter anfotérico em solução aquosa
• Grupos ionizáveis capacidade de sistema tampão 
NH2
COOHCR
H
Grupo 
carboxila
Grupo 
amino
PRÁTICA 1: Titulação potenciométrica de um aminoácido
Ácido fraco
pK1 ~ 2
Base fraca
pK2 ~ 9
Titulação HCl Titulação NaOH
pH neutro
fisiológico
pH ácido pH básico
3
• O estado de ionização dos grupos carboxila e amino varia com o pH
R R R
A titulação ácido-base envolve a adição ou remoção gradual de prótons
pK1= 2,17 pK2= 9,04 pKR= 12,48
4
pK1
pK2 pKR
Arginina
PRÁTICA 1: Titulação potenciométrica de um aminoácido
Titulação NaOH
Titulação HCl
Ph inicial 7,26
Titulação NaOH
5
PRÁTICA 1: Titulação potenciométrica de um aminoácido
Arginina
• Curva de titulação depende dos grupos ionizáveis presentes na estrutura do aminoácido 
Titulação HCl
Curva de titulação ideal para arginina
p
H
Equivalentes OH-
Equivalente de OH-
6
Glicina
pK1= 2,34
pK2= 9,60 Poder 
tamponante
máximo
PRÁTICA 1: Titulação potenciométrica de um aminoácido
Glutamato
pK1= 2,19
pK2= 4,25
pKR= 9,67
7
pI=3,22
0
pI=(2,19+4,25)/2 = 3,22
PRÁTICA 1: Titulação potenciométrica de um aminoácido
• Os aminoácidos possuem no mínimo dois 
grupos ionizáveis
• A reação de protonação e desprotonação 
depende do pH da solução
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Cromatografia em papel PRÁTICA 2: Cromatografia em papel
• Separação dos aminoácidos com base na sua polaridade
• Fase móvel = solvente (solução ácido acético/butanol)
• Fase estacionária = papel
• Migração depende da afinidade do aminoácido pela fase móvel e 
pela fase estacionária
origem
Aminoácido menos polar
Aminoácido mais polar
9
D
d
𝑅𝑓 =
𝑑𝑖𝑠𝑡â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑒𝑙𝑜 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 (𝑑)
𝑑𝑖𝑠𝑡â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑝𝑒𝑟𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑒𝑙𝑜 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 (𝐷)
Ácido, carga -
Alifático, 
não polar
Básico, carga +
Alifático, 
não polar
Polar, não 
carregado
Aromático
PRÁTICA 2: Cromatografia em papel
Ácido glutâmico
Arginina
Leucina Prolina
Tirosina
Alanina
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RF de aminoácidos determinados nas seguintes condições: solvente de Partridge, 
n-butanol/ácido acético glacial/água (4:1:1), papel Whatman no1 e à 20 ºC.
PRÁTICA 2: Cromatografia em papel
Quanto menor o Rf mais polar é o aminoácido
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Revelador = ninidrina
PRÁTICA 2: Cromatografia em papel
E a prolina?
12
(iminoácido)
PRÁTICA 2: Cromatografia em papel
Exceção N terminal faz 
uma ligação 
covalente com o 
próprio radical da 
Prolina 
Grupo amino não 
livre
Reação com a 
ninidrina é 
incompleta
Complexo amarelo
Ninidrina oxidada Prolina
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PRÁTICA 1: Reação de Biureto
Verificar a presença de ligações peptídicas
14
NaOH 2N – desnaturação, alcalinização
PRÁTICA 1: Reação de Biureto
• Verificar a presença de ligações peptídicas
Interação similar Biureto
+ CuSO4
Coloração 
violeta
15
Água Ovoalbumina Gelatina Glicina Ureia 
XX
PRÁTICA 1: Reação de Biureto
?
16
+ CuSO4
Decomposição da uréia (aquecimento) gera Biureto
Coloração 
violeta
Solução alcalina
PRÁTICA 1: Reação de Biureto
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AULA 2 – REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO DE 
AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS
Solubilidade pode ser afetada:
• Desnaturação e posterior precipitação da proteína
• Sem quebra de ligações covalentes na cadeia polipeptídica
Variação extrema de pH
• Afeta carga dos grupos ionizáveis das proteínas
• Causa repulsão ou diminuição da força de atração eletrostática
• Quebra de pontes de hidrogênio
Presença de solventes orgânicos miscíveis com a água (álcool, acetona) 
OU presença de solutos (uréia) 
• Quebra de interações hidrofóbicas que mantém estáveis proteínas 
globulares
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PRÁTICA 2: Acetato de Chumbo
• Detecção de enxofre pela degradação do grupo SH ou SS em aminoácidos sob condições 
fortemente alcalinas em altas temperaturas
Tubo 2: Mecha de cabelo (α-queratina)
Tubo 3: Ovoalbumina
Ricas em cisteína
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Tubo 1: Gelatina (Colágeno)
Composição do colágeno
35% Gly
11% Ala
21% Pro ou HyPro
PRÁTICA 2: Acetato de Chumbo
Ausência de íons de 
enxofre livre - cisteína
Estrutura do colágeno 
Prolina
AlaninaGlicina
Hidroxiprolina
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Ovoalbumina
Ácido nítrico Ácido clorídrico 
PRÁTICA 3: REAÇÕES DE PRECIPTAÇÃO DE PROTEÍNAS
B1) Efeito de Ácidos fortes: repulsão entre as cargas da proteína
pH < pI = carga líquida positiva = favorece interação da molécula com os ânions do ácido
Variação extrema de pH
• Afeta carga dos grupos ionizáveis das proteínas
• Causa repulsão ou diminuição da força de atração eletrostática
• Quebra de pontes de hidrogênio
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B2) Precipitação fracionada por soluções salinas concentradas
Salting in
A adição de sal em baixas 
concentrações neutraliza cargas 
da proteína e aumenta sua 
solubilidade
Salting out
Altas concentrações de sais com 
carga removem a água de 
solvatação das proteínas e as 
regiões hidrofóbicas entram em 
contato precipitando a proteína
Interação proteína-proteína é 
favorecida 
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Efeito salting out
Ovoalbumina + (NH4)2SO4 (sulfato de amônio) 
B2) Precipitação fracionada por soluções salinas concentradas
Cada proteína tem um ponto de 
salting-out característico, o que 
pode ser explorado em separações 
de misturas proteicas
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Diminuição da constante dielétrica
favorece a precipitaçãoÁgua-proteína
Proteína -proteína
+ -
- +
B2) Precipitação por acetona (solvente orgânico)
1 2 3 4 
Interação entre os grupos polares impede a 
hidratação, resultando na diminuição da 
solubilidade e precipitação proteica 
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Precipitação isoelétrica = interações hidrofóbicas
pI da caseína 4,6
Próximo ao seu PI
• Atração eletrostática das proteínas
• Repulsão é mínima. 
C) Determinação do ponto Isoelétrico de uma proteína
256,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0
Caseína pI=4,6
C) Determinação do ponto Isoelétrico de uma proteína
Métodos não-destrutivos e seletivos
280 nm
260 nm
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D) Dosagem de proteínas
Espectros de absorção da Tirosina, Triptofano e 
Fenilalanina. Presença de grupamentos aromáticos em 
sua estrutura são responsáveis pelas propriedades de 
absorção das proteínas na região do ultravioleta 
2727
Espectrofotômetro
Seletor λ
I0
It
I0 =Luz incidente
It =Luz transmitida
Métodos não-destrutivos e seletivos
D) Dosagem de proteínas
Lei de Lambert-Beer
log I0/I = e l c
Absorbância
Coeficiente de extinção molar 
mols / litro / cm
A absorbância é proporcional à concentração da espécie química
absorvente, sendo constantes o comprimento de onda, a
espessura atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores.
L = caminho óptico
C= concentração do analito (mol/L)
28
29
Curva padrão
Métodos Destrutivos
D) Dosagem de proteínas
30
Abs 595 nm
Coomassie GProteína
Aa radicais básicos e 
aromáticos
D) Dosagem de proteínas – Reagente Bradford (Comassie Brillant Blue G-250)
+
• Comprimento de onda que a substância 
absorve corresponde à cor complementar que 
ela apresenta
• Métodos espectrofotométricos - escolher a 
cor, correspondente a um comprimento de 
onda, que a substância em questão absorve 
com maior intensidade. 
31
2 5 10 15 20 0 ug de BSA
0,0
D) Dosagem de proteínas – Reagente Bradford (Comassie Brillant Blue G-250)
32
BSA ug/mL ABS
0 0,0000
2 0,0130
5 0,0900
10 0,2120
15 0,2870
20 0,4630
0,0
y = 0,0228x - 0,0205
R² = 0,9842
-0,1000
0,0000
0,1000
0,2000
0,3000
0,4000
0,5000
0 5 10 15 20 25
A
b
s
[BSA ug/mL]
D) Dosagem de proteínas – Reagente Bradford (Comassie Brillant Blue G-250)
33
y = 0,0228x - 0,0205
R² = 0,9842
-0,1000
0,0000
0,1000
0,2000
0,3000
0,4000
0,5000
0 5 10 15 20 25
A
b
s
[BSA ug/mL]
Y=0,0228x-0,0205
0,163=0,0228x-0,0205
X=8,04 ug/mL
Amostra desconhecida
0,0
34
Vantagem: 
• Sensibilidade
•rapidez 
• simplicidade
Desvantagens: 
• Interferentes (ureia, 
detergentes, mercaptoetanol, 
gliceraol, lipídeos, polifenois)
• Composição de aa
• Instabilidade dos reagentes 
(precipita com tempo, por isso 
dilui na hora)
D) Dosagem de proteínas – Reagente Bradford (Comassie Brillant Blue G-250)
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D) Dosagem de proteínas – Reagente Bradford (Comassie Brillant Blue G-250)
36
ELETROFORESE - SDS-PAGE
AULA 3 – CROMATOGRAFIA E ELETROFORESE
SDS-PAGE
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38
DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR NO GEL DESNATURANTE
39
DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR NO GEL DESNATURANTE
40
CROMATOGRAFIA DE FILTRAÇÃO EM GEL
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Eficiência: Capacidade de eluição 
com o mínimo de dispersão do 
analito.
Resolução: separação efetiva entre 
dois picos adjacentes
Seletividade: Interagir 
diferencialmente com os 
componentes da amostra.
42
Comprimento 
Percurso analítico resolução 
Percurso analítico tempo de análise 
Diâmetro
Volume eficiência resolução
diâmetros maiores propiciam maior difusão lateral 
proteínas eluem por completo em um intervalo de volume 
maior (alargamento do pico)
Exemplo
43
Altura 7 cm 
Diâm. 1,6 cm 
Altura 7 cm 
Diâm. 2,1 cm 
Altura 14 cm 
Diâm. 1,6 cm 
Altura 14 cm 
Diâm. 2,1cm 
Azul de metileno 
Hemoglobina
Determinação da Massa Molecular Aparente em Solução
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Volume de eluição de moléculas que não 
penetram nos poros do gel (V0)
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Dúvidas???
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