SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO DE DNA 2

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1 ALGETEC – SOLUÇÕES TECNOLÓGICAS EM EDUCAÇÃO 
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LABORATÓRIO DE GENÉTICA FORENSE 
SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO DE DNA 
 
 
INSTRUÇÕES GERAIS 
 
 
1. Neste experimento, você irá realizar as etapas envolvidas no processo de 
sequenciamento de ácidos nucleicos para análise subsequente. 
 
2. Utilize a seção “Recomendações de Acesso” para melhor aproveitamento da 
experiência virtual e para respostas às perguntas frequentes a respeito do 
VirtuaLab. 
 
3. Caso não saiba como manipular o Laboratório Virtual, utilize o “Tutorial 
VirtuaLab” presente neste Roteiro. 
 
4. Caso já possua familiaridade com o Laboratório Virtual, você encontrará as 
instruções para realização desta prática na subseção “Procedimentos”. 
 
5. Ao finalizar o experimento, responda aos questionamentos da seção “Avaliação 
de Resultados”. 
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RECOMENDAÇÕES DE ACESSO 
 
PARA ACESSAR O VIRTUALAB 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. Caso utilize o Windows 10, dê preferência ao navegador Google Chrome; 
2. Caso utilize o Windows 7, dê preferência ao navegador Mozilla Firefox; 
3. Feche outros programas que podem sobrecarregar o seu computador; 
4. Verifique se o seu navegador está atualizado; 
5. Realize teste de velocidade da internet. 
 
Na página a seguir, apresentamos as duas principais dúvidas na utilização dos 
Laboratórios Virtuais. Caso elas não se apliquem ao seu problema, consulte a nossa seção 
de “Perguntas Frequentes”, disponível em: https://algetec.movidesk.com/kb/pt-br/ 
Neste mesmo link, você poderá usar o chat ou abrir um chamado para o contato com 
nossa central de suporte. Se preferir, utilize os QR CODEs para um contato direto por 
Whatsapp (8h às 18h) ou para direcionamento para a central de suporte. Conte conosco! 
ATENÇÃO: 
O LABORATÓRIO VIRTUAL DEVE SER ACESSADO POR COMPUTADOR. ELE NÃO DEVE SER 
ACESSADO POR CELULAR OU TABLET. 
O REQUISITO MÍNIMO PARA O SEU COMPUTADOR É UMA MEMÓRIA RAM DE 4 GB. 
SEU PRIMEIRO ACESSO SERÁ UM POUCO MAIS LENTO, POIS ALGUNS PLUGINS SÃO 
BUSCADOS NO SEU NAVEGADOR. A PARTIR DO SEGUNDO ACESSO, A VELOCIDADE DE 
ABERTURA DOS EXPERIMENTOS SERÁ MAIS RÁPIDA. 
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PERGUNTAS FREQUENTES 
 
 
1) O laboratório virtual está lento, o que devo fazer? 
 
a) No Google Chrome, clique em “Configurações” -> “Avançado” -> “Sistema” -> 
“Utilizar aceleração de hardware sempre que estiver disponível”. Habilite a 
opção e reinicie o navegador. 
 
b) Verifique as configurações do driver de vídeo ou equivalente. Na área de 
trabalho, clique com o botão direito do mouse. Escolha “Configurações 
gráficas” e procure pela configuração de performance. Escolha a opção de 
máximo desempenho. 
Obs.: Os atalhos e procedimentos podem variar de acordo com o driver de 
vídeo instalado na máquina. 
 
c) Feche outros aplicativos e abas que podem sobrecarregar o seu computador. 
 
d) Verifique o uso do disco no Gerenciador de Tarefas (Ctrl + Shift + Esc) -> 
“Detalhes”. Se estiver em 100%, feche outros aplicativos ou reinicie o 
computador. 
 
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2) O laboratório apresentou tela preta, como proceder? 
 
a) No Google Chrome, clique em “Configurações” -> “Avançado” -> “Sistema” -> 
“Utilizar aceleração de hardware sempre que estiver disponível”. Habilite a 
opção e reinicie o navegador. Caso persista, desative a opção e tente 
novamente. 
 
b) Verifique as configurações do driver de vídeo ou equivalente. Na área de 
trabalho, clique com o botão direito do mouse. Escolha “Configurações 
gráficas” e procure pela configuração de performance. Escolha a opção de 
máximo desempenho. 
Obs.: Os atalhos e procedimentos podem variar de acordo com o driver de 
vídeo instalado na máquina. 
 
c) Verifique se o navegador está atualizado. 
 
 
 
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DESCRIÇÃO DO LABORATÓRIO 
 
 
MATERIAIS NECESSÁRIOS 
 
• Sequenciando automático; 
• Capela de fluxo laminar; 
• Termociclador; 
• Centrifuga; 
• Estufa de secagem; 
• Placa de 96 poços; 
• Isopropanol; 
• Adhesive PCR; 
• Formamida; 
• Kit BigDye terminator; 
• Primer F; 
• Primer R; 
• Papel alumínio. 
 
PROCEDIMENTOS 
 
1. SEGURANÇA DO EXPERIMENTO 
 
Inicialmente, higienize as mãos e coloque os equipamentos de proteção individual 
localizados no armário de EPIs. 
 
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2. PREPARANDO A MISTURA DE SEQUENCIAMENTO 
 
Em uma capela de fluxo laminar separe dois tubos eppendorf. Adicione 2 µl do 
reagente BigDye Mix, 1 µl do BigDye buffer, 1 µl do Primer F, 1 µl da amostra de PCR 
e 5 µl de água ultrapura no primeiro tubo. Adicione esses mesmos componentes no 
segundo eppendorf substituindo apenas o Primer F por 1 µl Primer R. 
 
3. AMPLIFICANDO A AMOSTRA 
 
Transfira 10 µl da mistura de sequenciamento com o primer F para o primeiro poço 
da placa de 96 poços e, 10 µl da mistura contendo o primer R para o segundo poço. 
Cubra a placa com papel alumínio, leve-a para o termociclador e ligue o equipamento. 
 
4. LAVAGEM DA AMOSTRA 
 
Após realização do PCR, adicione 60 µl de isopropanol em cada poço. Sele a placa com 
o adesivo (Adhesive) e misture o conteúdo por inversão 3 vezes. Deixe a placa 
repousar por 15 minutos ao abrigo da luz. Transcorrido o tempo, centrifugue a placa 
por 45 minutos a 3400rpm. Descarte o excesso de isopropanol na pia e, em seguida, 
inverta a placa sobre o papel toalha. Adicione 60 µl de isopropanol em cada poço e 
centrifugue a placa por 10 minutos. Descarte o excesso isopropanol e repita o último 
passo do processo mais uma vez. 
 
5. COLOCANDO A PLACA NO SEQUENCIADOR 
 
Seque a placa na estufa por 15 minutos. Após isso adicione 10 µl de formamida e 
submeta a placa a reação de desnaturação no termociclador (5 minutos a 96°C). 
Resfrie a amostra por 1 minutos em um recipiente contendo gelo e, após essa etapa, 
encaminhe a placa ao sequenciador automático. 
 
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6. AVALIANDO OS RESULTADOS 
 
Siga para a seção “Avaliação dos Resultados”, neste roteiro, e responda de acordo 
com o que foi observado nos experimentos. 
 
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AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS 
 
 
 
1. Explique o funcionamento do sequenciador automático. 
 
 
 
 
2. Qual a finalidade do PrimerR e Primer R na reação? 
 
 
 
 
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TUTORIAL VIRTUALAB 
 
 
1. SEGURANÇA DO EXPERIMENTO 
 
Higienize as mãos clicando com o botão esquerdo do mouse sobre a torneira da pia. 
 
 
 
 
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Visualize o armário de EPIs clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o 
nome “EPIs” localizada dentro do painel de visualização no canto superior esquerdo da 
tela. Se preferir, também pode ser utilizado o atalho do teclado “Alt+2”. 
 
 
 
Abra o armário de EPIs clicando com o botão esquerdo do mouse sobre as portas. 
 
 
 
 
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Selecione os EPIs necessários para a realização do ensaio clicando com o botão esquerdo 
do mouse sobre eles. Nesse experimento, é obrigatório o uso de jaleco e luvas de látex. 
 
 
 
 
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2. PREPARANDO A MISTURA DE SEQUENCIAMENTO 
 
Visualize o interior da capela de fluxo laminar clicando com o botão esquerdo do mouse 
sobre a câmera “Capela”, ou utilizado o atalho do teclado “Alt+03”. 
 
 
 
Ajuste o volume da micropipeta para 2 µl clicando com o botão direito do mouse sobre 
ela e selecionando a opção “Reajustar volume”. 
 
 
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Perceba que irá abrir uma caixa de texto onde deve ser inserido o volume utilizado. 
 
 
 
Coloque a micropipeta sobre o BigDye mix clicando com o botão direto do mouse sobre 
ela e selecionando a opção “Colocar em BigDye Mix”. 
 
 
 
 
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Transfira o líquido aspirado para o tubo 1 clicando com o botão direito do mouse sobre 
a micropipeta e selecionando a opção “Colocar em tubo 1”. 
 
 
 
Troque a ponteira e retorne a micropipeta para o suporte clicando com o botão direito 
do mouse sobre a micropipeta e selecionando a opção “Trocar ponteira”. 
 
 
 
 
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Repita o procedimento desprezando 2 µl do BigDye Mix no tubo 2. 
 
 
 
Ajuste o volume para 1 µl e coloque a micropipeta sobre o recipiente que contém BigDye 
Buffer clicando com o botão direito do mouse sobre a micropipeta e selecionando a 
opção “Colocar em BigDye Buffer”. 
 
 
 
 
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Mova a micropipeta para o tubo 1 clicando com o botão direito do mouse na 
micropipeta e selecionando a opção “Colocar em tubo eppendorf”. Troque a ponteira e 
repita o procedimento para o tubo 2. 
 
 
 
Coloque a micropipeta sobre o Primer F clicando com o botão direto do mouse sobre 
ela e selecionando a opção “Colocar em Primer F”. 
 
 
 
 
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Transfira o líquido aspirado para o tubo 1 clicando com o botão direito do mouse sobre 
a micropipeta e selecionando a opção “Colocar em tubo 1”. Troque a ponteira após o 
uso. 
 
 
 
Coloque a micropipeta sobre o Primer R clicando com o botão direto do mouse sobre 
ela e selecionando a opção “Colocar em Primer R”. 
 
 
 
 
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Transfira o líquido aspirado para o tubo 2 clicando com o botão direito do mouse sobre 
a micropipeta e selecionando a opção “Colocar em tubo 2”. Troque a ponteira após o 
uso. 
 
 
 
Coloque a micropipeta sobre a amostra de DNA clicando com o botão direto do mouse 
sobre ela e selecionando a opção “Colocar em Amostra DNA”. 
 
 
 
 
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Transfira o líquido aspirado para o tubo 1 clicando com o botão direito do mouse sobre 
a micropipeta e selecionando a opção “Colocar em tubo 1”. Troque a ponteira após o 
uso e repita o procedimento desprezando a amostra no tubo 2. 
 
 
 
Ajuste o volume para 5 µl e coloque a micropipeta sobre o recipiente que contém água 
ultra pura clicando com o botão direito do mouse sobre a micropipeta e selecionando a 
opção “Colocar em água ultra pura”. 
 
 
 
 
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Transfira o líquido aspirado para o tubo 1 clicando com o botão direito do mouse sobre 
a micropipeta e selecionando a opção “Colocar em tubo 1”. Troque a ponteira após o 
uso e repita o procedimento desprezando a amostra no tubo 2. 
 
 
 
 
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3. AMPLIFICANDO A AMOSTRA 
 
Ajuste o volume para 10 µl e coloque a micropipeta sobre o tubo 1 clicando com o botão 
direito do mouse sobre a micropipeta e selecionando a opção “Colocar em tubo 1”. 
 
 
 
 
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Despreze o aspirado no poço 1 clicando com o botão direito do mouse sobre a 
micropipeta e selecionando a opção “Colocar em poço 1”. Troque a ponteira após o uso 
e repita o procedimento desprezando a amostra no tubo 2. 
 
 
 
Cubra a placa com papel alumínio clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o 
papel. 
 
 
 
 
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Mova a placa para o termociclador clicando com o botão direito do mouse sobre ela e 
selecionando a opção “Colocar em termociclador”. 
 
 
 
Feche a tampa do termociclador clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o 
equipamento. 
 
 
 
 
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Ligue o termociclador clicando com o botão direito do mouse sobre ele e selecionando 
a opção “Ligar”. 
 
 
 
Aguarde por 1 hora e 20 minutos. Se preferir, avance o tempo clicando com o botão 
esquerdo do mouse na opção “Avançar tempo”. 
 
 
 
 
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Abra o termociclador e retire as amostras clicando com o botão direito do mouse sobre 
o equipamento e selecionando a opção “Retirar amostra”. 
 
 
 
 
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4. LAVAGEM DA AMOSTRA 
 
Retire a folha de papel alumínio da placa clicando com o botão direito do mouse sobre 
ela e selecionando a opção “Retirar papel alumínio”. 
 
 
 
Visualize as micropipetas clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera 
“Pipetagem” ou através do atalho do teclado “Alt+5”. 
 
 
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Ajuste o volume da micropipeta para 60 µl e coloque-a sobre o recipiente que contém 
isopropanol clicando com o botão direito do mouse sobre a micropipeta e selecionando 
a opção “Colocar em isopropanol”. 
 
 
 
Despreze o aspirado no poço 1 clicando com o botão direito do mouse sobre a 
micropipeta e selecionando a opção “Colocar em poço 1”. Troque a ponteira após o uso 
e repita o procedimento desprezando a amostra no tubo 2. 
 
 
 
 
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Sele a placa com o filme adesivo clicando sobre ele com o botão esquerdo do mouse 
sobre ele. 
 
 
 
Homogeneíze a solução da placa clicando com o botão direito do mouse sobre ela e 
selecionando a opção “Misturar por inversão”. 
 
 
 
 
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Aguarde por 15 minutos. Se preferir, avance o tempo clicando com o botão esquerdo 
do mouse na opção “Avançar tempo”. 
 
 
 
Coloque a placa na centrífuga clicando com o botão direito do mouse sobre ela e 
selecionando a opção “Colocar em centrífuga”. 
 
 
 
 
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Feche a tampa da centrífuga clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o 
equipamento. 
 
 
 
Ligue a centrífuga clicando com o botão direito do mouse sobre ela e selecionando a 
opção “Ligar”. Avance o tempo para acelerar o processo. 
 
 
 
 
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Abra a centrífuga e retire a placa clicando com o botão direito do mouse sobre ela e 
selecionando a opção “Retirar placa”. 
 
 
 
Retire o adesivo selante clicando com o botão direito do mouse sobre a microplaca e 
selecionando a opção “Retirar adesivo”. 
 
 
 
 
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Descarte o excesso de solução contida na microplaca clicando com o botão direito do 
mouse sobre ela e selecionando a opção “Descartar excesso”. 
 
 
 
Adicione 60 µl de isopropanol nos dois poços, sele a placa com adesivo, centrifugue por 
10 minutos e descarte o excesso. Esse processo deve ser repetido duas vezes. 
 
 
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SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO DE DNA 
 
 
5. COLOCANDO A PLACA NO SEQUENCIADOR 
 
Coloque a placa para secar na estufa clicando com o botão direito do mouse na 
microplaca e selecionando a opção “Colocar na estufa”. 
 
 
 
Feche a estufa clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o equipamento. Aguarde 
por 15 minutos. 
 
 
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Abra a estufa e retire a microplaca clicando com o botão direito do mouse sobre o 
equipamento. 
 
 
 
Pipete 10 µl de formamida clicando com o botão direito do mouse sobre a micropipeta 
e selecionando a opção “Colocar em formamida”. 
 
 
 
 
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Transfira o líquido aspirado para o poço 1 da microplaca clicando com botão direito do 
mouse na micropipeta e selecionando a opção “Colocar em poço 1”. Troque a ponteira 
após o uso e repita o procedimento no poço 2. 
 
 
 
Mova a placa para o termociclador clicando com o botão direito do mouse sobre ela e 
selecionando a opção “Colocar em termociclador”. 
 
 
 
 
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Feche a tampa do termociclador clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o 
equipamento. 
 
 
 
Configure o termociclador para executar o ciclo de desnaturação clicando com o botão 
direito do mouse sobre o equipamento e selecionando a opção “Programar ciclo de 
desnaturação”. 
 
 
 
 
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Ligue o termociclador clicando com o botão direito do mouse sobre ele e selecionando 
a opção “Ligar”. Aguarde por 5 minutos. 
 
 
 
Abra o termociclador e retira as amostras clicando com o botão direito do mouse sobre 
o equipamento e selecionando a opção “Retirar amostra”.mailto:contato@algetec.com.br
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Resfrie a amostra no gelo clicando como botão direito do mouse na microplaca e 
selecionando a opção “Colocar em recipiente com gelo”. Aguarde por 1 minuto. 
 
 
 
Coloque a amostra no sequenciador automático clicando com o botão direito do mouse 
na microplaca e selecionando a opção “Colocar em sequenciador”. 
 
 
 
 
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6. AVALIANDO OS RESULTADOS 
 
Siga para a seção “Avaliação dos Resultados”, neste roteiro, e responda de acordo com 
o que foi observado no experimento. 
 
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