Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e Eletroforese em Gel de Agarose 2

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LABORATÓRIO DE GENÉTICA FORENSE 
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) E ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 
 
 
 
INSTRUÇÕES GERAIS 
 
 
1. Neste experimento, você irá ampliar seus conhecimentos sobre a reação em 
cadeia da polimerase. Essa técnica permite observar a amplificação da molécula 
de DNA e sua observação através da eletroforese em gel de agarose. 
 
2. Utilize a seção “Recomendações de Acesso” para melhor aproveitamento da 
experiência virtual e para respostas às perguntas frequentes a respeito do 
VirtuaLab. 
 
3. Caso não saiba como manipular o Laboratório Virtual, utilize o “Tutorial 
VirtuaLab” presente neste Roteiro. 
 
4. Caso já possua familiaridade com o Laboratório Virtual, você encontrará as 
instruções para realização desta prática na subseção “Procedimentos”. 
 
5. Ao finalizar o experimento, responda aos questionamentos da seção “Avaliação 
de Resultados”. 
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RECOMENDAÇÕES DE ACESSO 
 
PARA ACESSAR O VIRTUALAB 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. Caso utilize o Windows 10, dê preferência ao navegador Google Chrome; 
2. Caso utilize o Windows 7, dê preferência ao navegador Mozilla Firefox; 
3. Feche outros programas que podem sobrecarregar o seu computador; 
4. Verifique se o seu navegador está atualizado; 
5. Realize teste de velocidade da internet. 
 
Na página a seguir, apresentamos as duas principais dúvidas na utilização dos 
Laboratórios Virtuais. Caso elas não se apliquem ao seu problema, consulte a nossa seção 
de “Perguntas Frequentes”, disponível em: https://algetec.movidesk.com/kb/pt-br/ 
Neste mesmo link, você poderá usar o chat ou abrir um chamado para o contato com 
nossa central de suporte. Se preferir, utilize os QR CODEs para um contato direto por 
Whatsapp (8h às 18h) ou para direcionamento para a central de suporte. Conte conosco! 
ATENÇÃO: 
O LABORATÓRIO VIRTUAL DEVE SER ACESSADO POR COMPUTADOR. ELE NÃO DEVE SER 
ACESSADO POR CELULAR OU TABLET. 
O REQUISITO MÍNIMO PARA O SEU COMPUTADOR É UMA MEMÓRIA RAM DE 4 GB. 
SEU PRIMEIRO ACESSO SERÁ UM POUCO MAIS LENTO, POIS ALGUNS PLUGINS SÃO 
BUSCADOS NO SEU NAVEGADOR. A PARTIR DO SEGUNDO ACESSO, A VELOCIDADE DE 
ABERTURA DOS EXPERIMENTOS SERÁ MAIS RÁPIDA. 
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PERGUNTAS FREQUENTES 
 
 
1) O laboratório virtual está lento, o que devo fazer? 
 
a) No Google Chrome, clique em “Configurações” -> “Avançado” -> “Sistema” -> 
“Utilizar aceleração de hardware sempre que estiver disponível”. Habilite a 
opção e reinicie o navegador. 
 
b) Verifique as configurações do driver de vídeo ou equivalente. Na área de 
trabalho, clique com o botão direito do mouse. Escolha “Configurações 
gráficas” e procure pela configuração de performance. Escolha a opção de 
máximo desempenho. 
Obs.: Os atalhos e procedimentos podem variar de acordo com o driver de 
vídeo instalado na máquina. 
 
c) Feche outros aplicativos e abas que podem sobrecarregar o seu computador. 
 
d) Verifique o uso do disco no Gerenciador de Tarefas (Ctrl + Shift + Esc) -> 
“Detalhes”. Se estiver em 100%, feche outros aplicativos ou reinicie o 
computador. 
 
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2) O laboratório apresentou tela preta, como proceder? 
 
a) No Google Chrome, clique em “Configurações” -> “Avançado” -> “Sistema” -> 
“Utilizar aceleração de hardware sempre que estiver disponível”. Habilite a 
opção e reinicie o navegador. Caso persista, desative a opção e tente 
novamente. 
 
b) Verifique as configurações do driver de vídeo ou equivalente. Na área de 
trabalho, clique com o botão direito do mouse. Escolha “Configurações 
gráficas” e procure pela configuração de performance. Escolha a opção de 
máximo desempenho. 
Obs.: Os atalhos e procedimentos podem variar de acordo com o driver de 
vídeo instalado na máquina. 
 
c) Verifique se o navegador está atualizado. 
 
 
 
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DESCRIÇÃO DO LABORATÓRIO 
 
 
MATERIAIS NECESSÁRIOS 
 
• Termociclador; 
• Cuba de eletroforese horizontal; 
• Fonte; 
• Suporte para gel; 
• Capela fluxo laminar; 
• Micropipeta; 
• Balança analítica; 
• Eppendorf; 
• Béquer; 
• Tampão AmplF; 
• Oligonucleotídeos; 
• Enzima Taq DNA polimerase; 
• Brometo de etídeo; 
• Tampão TAE1x e TAE 5x; 
• Padrão de corrida; 
• Agarose. 
 
 
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PROCEDIMENTOS 
 
1. SEGURANÇA DO EXPERIMENTO 
 
Inicialmente, higienize as mãos e coloque os equipamentos de proteção individual 
localizados no armário de EPIs. 
 
2. PREPARANDO MIX DE REAÇÕES 
 
Adicione em um eppendorf 105 µl do tampão de reação AmpF, 55 µl de 
oligonucleotídeos e 51 µl da enzima Taq DNA polimerase (ATENÇÃO: a quantidade de 
cada reagente utilizado para fazer o mix de reações varia de acordo com o número 
de amostras que serão analisadas, portanto, todos os valores citados anteriormente 
foram calculados para o uso em 5 amostras de DNA diferentes). Transfira 30 µl do 
mix de reações para 5 eppendorf previamente identificados (controle negativo, mãe, 
pai 1, pai 2 e filho). Adicione 20 µl da amostra de DNA de cada paciente para seu 
respectivo eppendorf e 20 µl de água ultra pura no eppendorf do controle negativo. 
 
3. AMPLIFICANDO A AMOSTRA 
 
Leve os eppendorf que contém a amostra do paciente com o mix de reações para o 
termociclador e aguarde por 3 horas. 
 
4. PREPARANDO GEL DE AGAROSE 
 
Pese 1,0 g de agarose na balança analítica em um béquer. Adicione 100 mL do tampão 
TAE 1x e aqueça a solução no micro-ondas por 1 minuto e 30 segundos até 
homogeneizar. Acrescente 4 µl de brometo de etídeo na solução morna de agarose. 
Transfira a solução para o suporte, coloque o pente do suporte e espere o gel 
solidificar. Após solidificação do gel, coloque o suporte na cuba de eletroforese e 
adicione o tampão TAE 1x até cobrir toda superfície. 
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5. ADICIONANDO A AMOSTRA NO GEL 
 
Colete 3 µl de cada amostra amplificada e do padrão de corrida, transfira para um 
eppendorf vazio e acrescente 1 µl do tampão de corrida 5x em cada. Pipete 4 µl de 
cada uma das amostras e transfira para os poços do gel de agarose respeitando a 
seguinte ordem: padrão de corrida, controle negativo,amostra da mãe, amostra do 
pai, amostra do outro homem e amostra do filho. Coloque a tampa da cuba de 
eletroforese e ligue a fonte de energia. 
 
6. OBSERVANDO O RESULTADO 
 
Retire o gel da cuba de eletroforese e observe o resultado no transiluminador. 
 
7. AVALIANDO OS RESULTADOS 
 
Siga para a seção “Avaliação dos Resultados”, neste roteiro, e responda de acordo 
com o que foi observado nos experimentos. 
 
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AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS 
 
 
 
1. Esquematize o resultado observado e informe qual dos suspeitos é o verdadeiro 
pai da criança. Justifique sua resposta. 
 
 
 
 
2. Explique o funcionamento da eletroforese. 
 
 
 
 
 
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TUTORIAL VIRTUALAB 
 
 
1. SEGURANÇA DO EXPERIMENTO 
 
Higienize as mãos clicando com o botão esquerdo do mouse sobre a torneira da pia. 
 
 
 
 
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Visualize o armário de EPIs clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o 
nome “EPIs” localizada dentro do painel de visualização no canto superior esquerdo da 
tela. Se preferir, também pode ser utilizado o atalho do teclado “Alt+2”. 
 
 
 
Abra o armário de EPIs clicando com o botão esquerdo do mouse sobre as portas. 
 
 
 
 
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Selecione os EPIs necessários para a realização do ensaio clicando com o botão esquerdo 
do mouse sobre eles. Nesse experimento, é obrigatório o uso de jaleco e luvas de látex. 
 
 
 
 
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2. PREPARANDO MIX DE REAÇÕES 
 
Visualize a bancada clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera com o nome 
“Experimento” ou através do atalho do teclado “Alt+3”. 
 
 
 
Ajuste o volume da micropipeta para 105 µl clicando com o botão direito do mouse 
sobre ela e selecionando a opção “Reajustar volume”. 
 
 
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Perceba que irá abrir uma caixa de texto onde deve ser inserido o volume utilizado. 
 
 
 
Coloque a micropipeta sobre o tampão de reação clicando com o botão direto do mouse 
sobre ela e selecionando a opção “Colocar em tampão de reação”. 
 
 
 
 
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Transfira o líquido aspirado para o eppendorf clicando com o botão direito do mouse na 
micropipeta e selecionando a opção “Colocar em tubo eppendorf”. 
 
 
 
Troque a ponteira clicando com o botão direito do mouse sobre a micropipeta e 
selecionando a opção “Trocar ponteira”. 
 
 
 
 
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Ajuste o volume para 55 µl e coloque a micropipeta sobre o recipiente que contém os 
oligonucleotídeos clicando com o botão direito do mouse sobre a micropipeta e 
selecionando a opção “Colocar em oligonucleotídeos”. 
 
 
 
Transfira o líquido aspirado para o eppendorf clicando com o botão direito do mouse na 
micropipeta e selecionando a opção “Colocar em tubo eppendorf”. Descarte a ponteira 
após o uso. 
 
 
 
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Ajuste o volume da micropipeta para 5 µl e coloque-a sobre o recipiente que contém a 
enzima Taq DNA polimerase clicando com o botão direito do mouse sobre a micropipeta 
e selecionando a opção “Colocar em enzima Taq”. 
 
 
 
Transfira o líquido aspirado para o eppendorf clicando com o botão direito do mouse na 
micropipeta e selecionando a opção “Colocar em tubo eppendorf”. Descarte a ponteira 
após o uso. 
 
 
 
 
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Tampe o eppendorf que contém os reagentes clicando com o botão esquerdo do mouse 
sobre ele. 
 
 
 
Mova o suporte de eppendorf para a capela de fluxo laminar clicando com o botão 
direito do mouse sobre ela. 
 
 
 
 
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Ajuste o volume da micropipeta para 30 µl e coloque-a sobre o eppendorf que contém 
o mix de reação clicando com o botão direito do mouse sobre a micropipeta e 
selecionando a opção “Colocar em tubo eppendorf”. 
 
 
 
Transfira o líquido aspirado para o eppendorf do controle negativo clicando com o botão 
direito do mouse na micropipeta e selecionando a opção “Colocar em eppendorf 
controle”. Descarte a ponteira após o uso. 
 
 
 
 
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Repita os dois últimos passos em todos os eppendorf localizados na região frontal do 
suporte. 
 
 
 
Ajuste o volume da micropipeta para 20 µl e, em seguida, mova para o microtubo que 
contém a amostra de DNA da mãe clicando com o botão direito do mouse sobre a 
micropipeta e selecionando a opção “Colocar em DNA da mãe”. 
 
 
 
 
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Despreze a amostra de DNA pipetada no eppendorfque contém o mix de reações 
correspondente clicando com o botão direito do mouse na micropipeta e selecionando 
a opção “Colocar em eppendorf mãe”. Descarte a ponteira após o uso. 
 
 
 
Repita esse processo com todas as amostras de DNA para seus respectivos tubos 
contendo mix de reações. 
 
 
 
 
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Pipete 20 µl de água ultra pura clicando com o botão direito do mouse sobre a 
micropipeta e selecionando a opção “Colocar em água ultra pura”. 
 
 
 
Transfira o líquido pipetado para o eppendorf controle negativo clicando com o botão 
direito na micropipeta e selecionando a opção “Colocar em eppendorf controle”. 
 
 
 
 
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3. AMPLIFICANDO A AMOSTRA 
 
Leve as amostras para o termociclador clicando com o botão direito do mouse sobre o 
suporte de eppendorf. 
 
 
 
Feche a tampa do termociclador clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o 
equipamento. 
 
 
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Ligue o termociclador clicando com o botão direito do mouse sobre ele e selecionando 
a opção “Ligar”. 
 
 
 
Aguarde por 3 horas. Se preferir, avance o tempo clicando com o botão esquerdo do 
mouse na opção “Avançar tempo”. 
 
 
 
 
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Abra o termociclador e retira as amostras clicando com o botão direito do mouse sobre 
o equipamento e selecionando a opção “Retirar amostra”. 
 
 
 
 
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4. PREPARANDO O GEL DE AGAROSE 
 
Mova o suporte de eppendorf para área da bancada destina ao preparo do gel clicando 
com o botão direito do mouse sobre ele. 
 
 
 
Ligue a balança analítica clicando com o botão esquerdo do mouse no botão power. 
 
 
 
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Coloque o béquer na balança clicando com o botão direito sobre ele e selecionando a 
opção “Colocar em balança analítica”. 
 
 
 
Zere a balança clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão tara. 
 
 
 
 
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Retire a tampa do recipiente que contém a agarose clicando com o botão esquerdo do 
mouse sobre ele. 
 
 
 
Coloque a espátula sobre o recipiente que contém a agarose clicando com o botão 
direito do mouse sobre ela e selecionando a opção “Colocar no pote”. 
 
 
 
 
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Transfira a agarose para o béquer clicando com o botão esquerdo do mouse sobre a 
espátula e selecionando a opção “Colocar agarose no béquer”. Repita esse passo até 
obter a quantidade de 1,0 g. 
 
 
 
Retorne a espátula para bancada clicando com o botão direito do mouse sobre ela e 
selecionando a opção “Colocar na posição inicial”. 
 
 
 
 
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Tampe o recipiente que contém agarose clicando com o botão esquerdo do mouse sobre 
ele. 
 
 
 
Coloque o béquer na bancada clicando com o botão direito do mouse sobre ele e 
selecionando a opção “Retirar objeto”. 
 
 
 
 
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REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) E ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 
 
 
Adicione 100 mL do tampão TAE 1x no béquer clicando com o botão direito do mouse 
sobre o recipiente e selecionando a opção “Colocar no béquer”. 
 
 
 
Mova a solução do béquer para o microondas clicando com o botão direito e 
selecionando a opção “Colocar em microondas”. 
 
 
 
 
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Feche o microondas clicando com o botão esquerdo do mouse sobre ele. 
 
 
 
Ligue o microondas por 30 segundos clicando com o botão direito do mouse e 
selecionando a opção “Ligar”. 
 
 
 
 
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Abra o microondas e homogeneíze a solução do béquer clicando com o botão direito 
sobre a vidraria e selecionando a opção “Homogeneizar solução”. Repita esse processo 
de aquecimento e homogeneização mais 2 vezes. 
 
 
 
Retire o béquer do microondas clicando com o botão direito do mouse sobre ele e 
selecionando a opção “Retirar objeto”. 
 
 
 
 
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Aguarde por 2 minutos. Se preferir, avance o tempo clicando com o botão esquerdo do 
mouse na opção “Avançar tempo”. 
 
 
 
Ajuste o volume da micropipeta para 4 µl e coloque-a sobre o recipiente que contém 
brometo de etídeo clicando com o botão direito do mouse sobre ela e selecionando a 
opção “Colocar em brometo de etídeo”. 
 
 
 
 
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Despreze o líquidoaspirado no béquer clicando com o botão direito do mouse sobre a 
micropipeta e selecionando a opção “Colocar no béquer 100 mL”. Descarte a ponteira 
após o uso. 
 
 
 
Transfira a solução do béquer para a cuba de eletroforese clicando com o botão direito 
do mouse sobre o béquer e selecionando a opção “Despejar em cuba”. 
 
 
 
 
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Adicione o pente clicando com o botão direito do mouse sobre o suporte e selecionando 
a opção “Colocar pente”. 
 
 
 
Aguarde o gel solidificar. Se preferir, avance o tempo clicando com o botão esquerdo do 
mouse na opção “Avançar tempo”. 
 
 
 
 
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Desmonte o suporte clicando com o botão direito do mouse sobre ele e selecionando a 
opção “Desmontar suporte”. 
 
 
 
Coloque o suporte dentro da cuba de eletroforese clicando com o botão direito do 
mouse sobre ele e selecionando a opção “Colocar na cuba de eletroforese”. 
 
 
 
 
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Adicione o tampão TAE 1x na cuba de eletroforese clicando com o botão direito do 
mouse no recipiente e selecionando a opção “Colocar na cuba de eletroforese”. 
 
 
 
 
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5. ADICIONANDO A AMOSTRA NO GEL 
 
Visualize as amostras amplificadas clicando com o botão esquerdo do mouse na câmera 
“Pipetagem de eletroforese” ou através do atalho do teclado “Alt+9”. 
 
 
 
Ajuste o volume da micropipeta para 1 µl e pipete o tampão TAE 5x clicando com o botão 
direito do mouse sobra a micropipeta e selecionando a opção “Colocar em TAE 5x”. 
 
 
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Despreze o líquido pipetado no tubo de controle negativo clicando com o botão direito 
do mouse na micropipeta e selecionando a opção “Colocar em tubo controle”. 
 
 
 
Repita esse processo em todos os tubos. Descarte a ponteira após o uso. 
 
 
 
 
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Ajuste o volume da micropipeta para 3 µl e aspire a amostra amplificada clicando com 
o botão direito do mouse sobre a micropipeta e selecionando a opção “Colocar em 
eppendorf mãe”. 
 
 
 
Transfira a amostra para o tubo que contém o tampão TAE 5x clicando com o botão 
direito na micropipeta e selecionando a opção “Colocar em tubo mãe”. Repita esse 
processo com todas as amostras amplificadas. 
 
 
 
 
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Pipete 3 µl do padrão de corrida clicando com o botão direito do mouse sobre a 
micropipeta e selecionando a opção “Colocar em padrão de corrida”. 
 
 
 
Transfira o líquido aspirado para o tubo com o tampão TAE 5x clicando com o botão 
direito do mouse na micropipeta e selecionando a opção “Colocar no tubo padrão”. 
 
 
 
 
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Ajuste o volume da micropipeta para 4 µl e transfira a solução contendo amostras + 
tampão TAE 5x para o poço do gel clicando com o botão direito do mouse sobre a 
micropipeta e selecionando a opção “Colocar em poço escola padrão”. 
 
 
 
Repita esse processo até que todas as amostras sejam colocadas no gel de agarose. 
 
 
 
 
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Visualize a cuba de gel e a fonte elétrica clicando com o botão esquerdo do mouse na 
câmera “Eletroforese” ou através do atalho do teclado “Alt+8”. 
 
 
 
Coloque a tampa da cuba clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o 
equipamento. 
 
 
 
 
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Ligue a fonte de energia clicando com o botão esquerdo do mouse sobre o botão power. 
 
 
 
Aguarde por 60 minutos. Se preferir, avance o tempo clicando com o botão esquerdo 
do mouse na opção “Avançar tempo”. 
 
 
 
 
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6. OBSERVANDO O RESULTADO 
 
Retire a tampa da cuba de eletroforese clicando com o botão esquerdo do mouse sobre 
ela. 
 
 
 
Coloque o gel no transiluminador clicando com botão direito do mouse sobre a cuba de 
eletroforese. 
 
 
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Observe o resultado e selecione a opção correta. 
 
 
 
 
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7. AVALIANDO OS RESULTADOS 
 
Siga para a seção “Avaliação dos Resultados”, neste roteiro, e responda de acordo com 
o que foi observado no experimento. 
 
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