Aula 1 - Clonagem

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5. Clonagem de DNA
 
Sinopse da aula:
 
5.1. Um velho sonho da humanidade
5.2 Primeiros passos
5.3 Restrição e modificação: a ferramenta escondida na bactéria
5.4 Ainda um pouco sobre as enzimas de restrição
5.5 Clonando DNA num plasmídeo
5.6 Biblioteca genômica: todo o genoma em pedaços
5.7 Vetores para pedaços maiores...
5.8 Sinopse da triagem de bibliotecas genômicas
 
 
******************************************
 
5.1. Um velho sonho da humanidade 
 
 Criar seres novos têm sido, por bilhões de anos, o privilégio da Natureza, através do
processo contínuo de mutação e seleção natural e por outros mecanismos de alteração do DNA que
agora começam a ser compreendidos. Mas a humanidade sempre "criou" seus próprios seres,
geralmente extraordinários. Os gregos eram particularmente imaginativos, e a mitologia clássica é
cheia de monstros como a Quimera, o cão Cérbero, o Minotauro, a Medusa e um sem-número de
outros híbridos. Como se verá mais adiante, a palavra quimera foi tomada de empréstimo na
mitologia para designar as construções artificiais de moléculas (em geral DNA). Inicialmente a
imaginação do homem atribuía a algum deus a geração dos seres monstruosos ou, ao contrário,
extraordinariamente belos. A idéia de que estes seres podiam ser fabricados por um ser humano
só veio muito depois, mas em várias partes do mundo os homens criaram "protocolos" para a
geração de vida a partir de material "morto", desde simples insetos até o próprio ser humano. A
partir do meio do século XVIII a ciência começou a mostrar a verdadeira face da criação e a
esclarecer a origem das ossadas que eram em parte o combustível para a imaginação dos homens
naquele tempo: a vida só podia ser criada a partir da vida e os ossos imensos ou estranhos achados
em toda a parte eram de seres extintos, mas que tinham sido produto da Natureza, como todos os
demais.
 
 Ainda assim, alguns seres exóticos mais "queridos" da humanidade permaneceram por
todo o século XVIII e boa parte do século XIX e alguns passaram "vivos" pelo século XX até
hoje! O unicórnio "viveu" feliz por todo o século XVIII ( ainda permanece vivo na mente de
alguns acadêmicos...), as serpentes marinhas monstruosas alcançaram a metade do século XX e os
duendes e fadas estão muito bem de saúde, "vivendo" entre nós, civilizados (anjos, elementais e
duendes; gnomos e fadas). Os lobisomens e vampiros andam mais desacreditados, mas sempre se
deve esperar um retorno triunfal, às custas do cinema ou de um livro, lançados por bons
marqueteiros...Vale a pena conferir o genial poema "A Orgia dos Duendes", de Bernardo
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Guimarães, escrito há várias décadas e que tem uma versão mais curta, musicada, para cantar para
as crianças antes de dormir! Neste poema os duendes não são exatamente bonzinhos, como na
imaginação das donzelas, mas bastante pervertidos... 
 
 Por falar em cinema, na falta de meios de criar novos seres, o homem usou e abusou da
imaginação na telona (e agora, na telinha também). Vale a pena conferir o site Recife Assombrado,
começando pela página de filmes de monstros e assombrações famosos
(http://www.orecifeassombrado.com.br/cul-vamp.htm). Uma enorme coleção de seres fantásticos
povoou rapidamente as salas de cinema e alguns deles tornaram-se tão corriqueiros que quase
chegamos a acreditar que existam de verdade. É o caso dos lobisomens, vampiros e afiliados, que
tiveram milhares de versões no cinema, a partir de variações do texto principal de Bram Stoker,
Drácula: Nosferatu, M - o Vampiro de Düsseldorf, etc. Seres fantásticos, produtos da mistura de
dois ou mais seres pré-existentes, também aparecem com frequência no cinema, e são a versão
moderna das quimeras, unicórnios, minotauros e coisas do tipo. A Ilha do Dr. Moreau, filme
baseado no livro de H.G.Wells, tornou-se um clássico, com seres monstruosos, híbridos de bicho e
gente. Recentemente, ganhou versão em jogo para PC. A recriação de seres extintos também foi
abordada no cinema, sendo o Parque dos Dinossauros a mais célebre.
 
 Entretanto, a criação de híbridos de verdade é muito mais difícil do que insinua o cinema
ou pensam as pessoas, porque a maior parte das espécies têm algum tipo de restrição para o
cruzamento com uma espécie diversa. Na melhor das hipóteses o híbrido costuma ser estéril. Esta
é a regra entre animais. Os híbridos entre vertebrados, por exemplo, são raros, e quando ocorrem,
em geral são estéreis. É o caso da mula e do burro, híbridos de cavalos e jumentos. Entre plantas,
contudo, a obtenção de híbridos é muito mais fácil e uma enorme fração das plantas que hoje
cultivamos é produto de cruzamento entre duas ou mais espécies.
 
 Uma abordagem mais simples (ao menos em teoria) é a clonagem de genes de um organismo
e a transfecção destes para outro organismo. A vantagem desta abordagem é que se pode
selecionar da espécie doadora apenas as marcas que interessam, evitando a introdução de genes
indesejados. Adicionalmente, ela permite (também em teoria...) total controle sobre a construção
final, contornando as recombinações que a Natureza produz durante a reprodução sexuada (entre
indivíduos da mesma espécie ou não).
 
 Clonar genes parece simples a princípio, mas as ferramentas para cortar DNA e
"emendar" os fragmentos com um vetor (DNA que se replica e que desta forma conserva o pedaço
"emendado" nele, chamado inserto) não eram conhecidas até o meio da década de 70.
 
 
5.2 Primeiros passos
 
 As primeiras tentativas de clonagem de genes foram feitas no fim da década de 70 com um
vírus que infecta células de primatas (inclusive seres humanos): o SV40 (simian virus 40). Este
vírus é capaz de entrar na célula do mamífero e em alguns casos integrar-se ao DNA
cromossômico, em qualquer lugar do genoma. Ao sair, ocorre muitas vezes uma excisão anômala, e o
vírus deixa no genoma da célula hospedeira uma parte de si, levando, ao contrário, um pequeno
segmento do genoma da célula do primata. Ao invadir uma nova célula, o segmento transportado
insere-se num outro ponto do DNA da célula hospedeira, totalmente diverso do que estava antes.
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Este procedimento embaralha o genoma e pode, ao acaso, produzir uma construção interessante,
mas é muito grosseiro para permitir um avanço concreto no campo da clonagem. Adicionalmente, o
SV40, assim como o fago l, do qual falaremos em outra aula, e vários outros vírus, têm uma
limitação séria quanto ao tamanho de inserto que podem carregar, pois devem ser encapsulados
para sair de uma célula e invadir a outra, e o volume do capsídeo não comporta muito mais DNA do
que o que é normal no vírus. Desta forma, vetores virais empacotados em capsídeos devem ser
previamente engenheirados de forma a que se retire um certo número de genes dispensáveis in
vitro, fazendo espaço para mais bases do inserto.
 
 Como não havia uma forma simples e precisa de cortar DNA numa sequência ou posição
específicas, produzindo segmentos de extremidades conhecidas, era impossível unir de forma
eficiente um segmento de DNA de doador com as extremidades de um vetor (viral ou plasmidial,
como veremos mais adiante). A falta desta tesoura molecular restringiu durante anos o avanço da
nascente "engenharia genética", nome que a mídia deu ao que se chama nos meios acadêmicos de
tecnologia do DNA recombinante. Além disso, o fato de todos os primeiros vetores de clonagem
terem sido vírus que infectam o homem fez da engenharia genética uma tecnologia de alto risco. As
legislações foram, compreensivelmente, duríssimas no princípio, com uma opinião pública
inteiramentedesfavorável, como ocorre hoje com a questão da clonagem de mamíferos. O cuidado
era, contudo, muito importante. Apesar de todo cuidado, e um pouco antes das tentativas de se
fazer engenharia genética de forma sistemática e abrangente, o SV40 acabou sendo o
protagonista de uma infecção acidental de milhões de pessoas, através da vacina de poliomielite,
nas décadas de 50 e 60. A infecção pelo SV40 não provocou, até onde se pode saber, qualquer
problema de saúde nos indivíduos infectados, apesar de potencialmente ser possível a ação direta
do vírus no organismo ou através de sua recombinação in vivo com o S2, um vírus humano.
 
 A legislação evolui bastante à medida em que a engenharia genética tornava-se mais
segura. Paralelamente, a ciência da Biossegurança emergiu da união entre conceitos de biologia e
de direito, resultando num corpo de normas e diretrizes bastante coerente, que se atualiza
continuamente através de workshops, congressos e outros encontros técnicos entre especialistas
do mundo todo.
 
Biossegurança: um novo conceito (apud CTNBio)
 
 Em 1975, a primeira conferência sobre biossegurança foi realizada em Asilomar, na Califórnia,
quando elevados padrões de biossegurança foram estabelecidos para evitar riscos decorrentes de
pesquisas com biologia molecular (Berg et al., 1975). 
 Em 1990, o primeiro simpósio internacional sobre biossegurança reuniu em Kiawah, Carolina do Sul,
pesquisadores de diferentes países, tanto do setor público quanto do privado (MacKenzie e Henry,
1990). Embora algumas das preocupações com os transgênicos se mostrassem infundadas, alguns
autores, nesse simpósio, recomendaram que a cautela inicial não fosse abandonada (Muench, 1990). 
 Um segundo simpósio internacional, realizado no ano de 1992 em Goslar, Alemanha, discutiu a
biossegurança dos transgênicos à luz do progresso científico alcançado à época. Os cientistas reunidos
nesse encontro chegaram ao consenso de que o risco está relacionado à caraterística do transgênico e
não é inerente à tecnologia utilizada para desenvolvê-lo (Tiedje et al., 1989; Crawley, 1992; Date et al.,
1992). 
 Vários outros simpósios e "workshops" aconteceram desde então. No Brasil, cientistas dos setores
público e privado se reuniram no "Workshop Biowork" de 1998, em Viçosa, MG, para discutir a
biossegurança dos transgênicos no Brasil. Uma das principais conclusões foi de que, embora o público
tenha certo ceticismo em relação aos transgênicos, o Brasil deveria continuar formando massa crítica e
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estar pronto para analisar solicitações de comercialização de transgênicos no território nacional (Borém
et al., 1998).
 O Conselho Técnico Nacional de Biossegurança (CTNBio) é o órgão responsável pela normatização e
fiscalização dos trabalhos que envolvem transgênicos e engenharia genética de forma geral, inclusive os
aspectos éticos.
 
Referências:
1. Berg, P.; Baltimore, D,; Brenner, S.; Robin, R. O. e Singer, M.F. 1975. Summary statement of the
Aislomar conference on recombinant DNA molecules. Proc. Nat. Acad. Sei USA 72:1981-1984.
2. Berg, P.; Battimore, D. e Boyer, H.W. 1974. NAS ban on plasmid engineering. Nature 250:175.
3. Borém, A. Giúdice, M.P.; Sakiyama, N.S.; Sediyama, T.; Moreira, M.A. e Portugal, R.S. 1998.
Biowork. Viçosa: JARD Produções Gráficas. 182p.
4. MacKenzie, D. R. e Henry, S.C. 1990. Biological Monitoring of Genetically Engineered Plants and
Microbes - Proceeding of the Kiawah Island Conference. Bethesda: Agricultural Research
Institute Press.
 
5.3 Restrição e Modificação: a ferramenta escondida na bactéria
 
 Os bacteriófagos, partículas virais que invadem e destroem bactérias, tiveram um papel
central no desenvolvimento da Biologia Molecular. Já na década de 40 uma série de experimentos
mostrou como funcionavam os genes de vários destes vírus. Uma geração depois experimentos com
fagos levaram a uma descoberta fundamental - as enzimas de restrição. Estas "tesouras"
moleculares, que a bactéria emprega para se defender dos bacteriófagos, poderiam ser
aproveitadas para a pesquisa. Elas de fato forneceram a ferramenta há muito desejada pelos
biólogos moleculares para estudar e manipular o DNA e fundamentaram o caminho para o
desenvolvimento da engenharia genética.
 
 A descoberta das enzimas de restrição aconteceu ao longo de mais de duas décadas e
demonstrou que as bactérias desenvolveram, durante a evolução, um eficiente mecanismo de defesa
contra vírus a DNA. Fagos que se desenvolvem bem numa certa linhagem de bactéria,
frequentemente produzem uma progênie pequena quando infectam pela primeira vez uma outra
linhagem da mesma bactéria, mas os poucos fagos sobreviventes prosperam. O fenômeno, conhecido
como restrição controlada pelo hospedeiro, foi descrito pela primeira vez no início da década de
50. Werner Arber, um microbiologista suíço, encontrou uma explicação molecular para o
fenômeno. Ele sugeriu que as bactérias controlam os fagos com um sistema de reações
geneticamente controladas que ele designou restrição - modificação. A seguir analisaremos as
observações de Arber.
 
 Quando os bacteriófagos entram numa bactéria da linhagem A, são em sua maioria mortos
no interior da bactéria, que corta (cliva) o DNA em um ou mais pontos. Os poucos fagos que se
replicam no interior da bactéria, contudo, parecem "aprender" a evitar o ataque da bactéria e,
numa segunda infecção, já produzem um grande número de partículas virais novas. Quando estes
fagos procuram infectar uma bactéria da mesma espécie, porém de uma outra linhagem (digamos,
B), inicialmente produz uma progênie pequena e apenas na segunda infecção na mesma linhagem
bacteriana é que se adapta e produz um grande número de partículas virais novas. Se
transportado a um tubo de ensaio com a bactéria A original, o fenômeno se repete, como se o fago
tivesse "desaprendido" a infectar a bactéria do tipo A. A situação está mostrada na figura
abaixo.
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Fig 5.1. A restrição controlada pela hospedeira: Fagos que se desenvolvem bem numa certa linhagem de bactéria,
frequentemente produzem uma progênie pequena quando infectam pela primeira vez uma outra linhagem da mesma
bactéria, mas os poucos fagos sobreviventes prosperam.
 
 Como poderia ser este "aprendizado"? Afinal, quando um fago entra na bactéria, apenas o
seu DNA subsiste e se replica, ficando o capsídeo do lado externo da hospedeira. Então, todo o
processo de adaptação teria que estar ligado ao DNA. Vejamos a hipótese de Arber (mostrada de
forma esquemática na figura a seguir):
Inicialmente temos que admitir que a bactéria possui um sistema de proteção de seu DNA
contra a sua própria enzima de restrição (a "tesoura" molecular), que consiste na
modificação, em geral por metilação, de duas bases numa certa sequência fita-dupla. Na
figura abaixo a bactéria da linhagem A protege desta forma as sequências marcadas em
amarelo (por exemplo 5´-GAATTC-3 )´, enquanto a da linhagem B protege outras sequências,
marcadas em azul (por exemplo, 5´-GGCC-3 )´. Esta proteção é levada a cabo pela enzima de
modificação.
Em seguida vamos admitir que a enzima de restrição que a bactéria produz cliva (corta) o
DNA fita dupla exatamente na mesma sequência que a sua própria enzima de modificação
protege.
Agora imaginemos um fago sem qualquer modificação em seu DNA fita dupla infectando a
bactéria A. Seu DNA será clivado (restrito ou cortado) exatamente na sequência amarela (e
até em mais de uma, se houver). Entretanto, uns poucos fagos serão replicados antes de
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serem clivados e imediatamente modificados pela enzima de modificação da bactéria, que
metila as sequências amarelas independentemente de sua origem, bacteriana ou viral.
Alternativamente,poderão sobreviver porque foram metilados antes mesmo de replicarem.
 Aqui cabe uma pergunta: como a bactéria "decide" se uma sequência deve ser modificada
ou restrita? As enzimas de restrição (E.R.) estão dispersas no citosol bacteriano, mas as de
modificação em geral têm uma proximidade com o aparato de replicação do DNA. Por isso, um
DNA invasor é mais provavelmente restrito antes de ser modificado. Ao contrário, o DNA
bacteriano recém sintetizado (uma fita nova, já que a outra, velha, já está modificada) será
provavelmente modificado na fita nova antes de ser restrito. Além disso, uma hemi-metilação
também confere um razoável grau de proteção contra o ataque de enzimas de restrição, o que faz
com que o DNA bacteriano seja essencialmente imune à ação da enzima de restrição da própria
bactéria. De forma equivalente, o DNA viral, que não tem nenhuma metilação, é muito mais sensível
ao corte pela E.R..
 
Os poucos fagos sobreviventes terão suas duas fitas modificadas exatamente na sequência
reconhecida pela E.R da bactéria hospedeira. Consequentemente, quando entram na próxima
bactéria da mesma linhagem, seus DNAs estão imunes ao ataque da E.R. bacteriana. Todos os
fagos da progênie, igualmente modificados, sobrevivem daí por diante nesta linhagem de
hospedeira.
Quando, na segunda parte da figura, os fagos provenientes de A penetram na hospedeira da
linhagem B, eles estão todos modificados na sequência amarela. Mas a hospedeira agora corta
o fago na sequência azul (digamos, 5´-GGCC-3 )´, de forma que a proteção na sequ~encia
GAATTC de nada adianta. Quase todos os fagos terão seu DNA clivado, mas os poucos
sobreviventes terão o DNA metilado na posição correta, pela enzima de modificação da
bactéria da linhagem B. A modificação na sequência amarela vai se diluindo na população,
pois a replicação é semi-conservativa e a progênie viral muito grande (mais de 200 fagos por
fago infectante). Apos a segunda infecção na bactéria do tipo B todos os fagos estarão
agora modificados e protegidos na sequência azul, e terão "desaprendido" a sobreviver na
bactéria do tipo A.
O processo recomeça quando o fago tenta infectar uma bactéria da linhagem A outra vez.
 Esta explicação molecular foi fundamental para espantar o espectro de lamarckismo que
obviamente ronda um experimento desta natureza.
 
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Fig. 5.2 Interpretação molecular do fenômeno da restrição pela hospedeira, de acordo com Werner Arber. As
círculos vermelhos e verdes representam as modificações.
 
 Era notável a especificidade destas reações e os bioquímicos ficaram bastante
esperançosos de que as enzimas de restrição pudessem ser empregadas para estudar e clivar o
DNA, se pudessem ser purificadas. Enquanto Arber trabalhava com E. coli, outros pesquisadores
experimentavam com outras bactérias, encontrando resultados similares. As esperanças,
entretanto, enfraqueceram quando a primeira das enzimas purificada parecia cortar in vitro o
DNA de forma aleatória, e não numa sequência de bases específica (conhecida como sítio de
restrição). Passaram muitos anos sem que as enzimas de restrição voltassem a ser pesquisadas
como ferramenta para a engenharia genética.
 
 As esperanças ressurgiram na década de 70, através de uma série de trabalhos
balizadores de Hamilton Smith, um biólogo molecular que trabalhava na Johns Hopkins University
School of Medicine. Ele purificou a primeira enzima sítio-específica, a enzima Hind II, da
bactéria Haemophilus influenzae. Esta descoberta crucial foi obra do acaso (com tantas outras):
incubando bactérias e fagos juntos, Smith observou que o DNA do fago degradava aos poucos. Ele
e seus colaboradores conseguiram purificar a enzima responsável pela degradação e
posteriormente identificaram a sequência de seis pares de bases que ela reconhece e cliva, sempre
na mesma posição, sempre da mesma forma! Logo muitas outras enzimas foram descobertas e agora
há mais de 3000 já descritas. Cada enzima cliva o DNA num sítio específico e com estas enzimas
foi possível manipular o DNA como nunca antes. Um dos trabalhos mais festejados, que vieram na
cola das descobertas de Arber e Smith, foi o de Daniel Nathans com SV40, que pela primeira vez
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empregou estas enzimas para mapear fisicamente o DNA. Seus experimento levaram em 1972 à
primeira tentativa bem sucedida de clonagem de DNA, conseguida por Paul Berg.
 
 Pelas suas descobertas, Hamilton Smith recebeu o Prêmio Nobel em Fisiologia ou Medicna
em 1978, dividindo a premiação, merecidamente, com Arber e Nathan. As palestras dos três
laureados, Arber, Nathans e Smith, com uma descrição de seus trabalhos, estão também
disponíveis no site de downloads, no formato pdf.
 
 
5.4 Ainda um pouco sobre as enzimas de restrição
 
 Como vimos acima, cada bactéria possui em geral uma enzima que reconhece uma sequência
de DNA curta, com 4 a 12 pares de bases. Nas diferentes bactérias estes sítios têm em sua
maioria uma característica comum: a de terem a mesma sequência de bases quando lidas nas duas
fitas complementares. As sequências abaixo, reconhecidas pela enzimas de restrição EcoR1
(obtida da Escherichia coli) e HindIII (obtida de Hemophilus influenzae) exemplificam o que
chamamos de sítio de restrição. Observe a sequência e veja sua simetria. Sequências de DNA fita
dupla com estas características são chamadas palíndromos. 
 
 
Fig 5.3 As setas indicam a ponte fosfodiester clivada pelas enzimas EcoRI e HindIII. A linha pontilhada indica o
eixo de simetria do palíndromo. A linha laranja mostra o corte oblíquo das duas enzimas, que geram extremidades
coesivas.
 
 Quando uma enzima de restrição digere o DNA, ela produz um corte em cada fita, podendo
resultar em extremidades colantes ou adesivas, como as geradas pelas enzimas acima, ou
extremidades cegas, isto é, sem bases despareadas. Este é o caso, por exemplo, do sítio GGCC, que
é clivado reto entre o segundo o G e o C nas duas fitas. Esta forma de corte está mostrado na
figura 5.3a abaixo.
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 Cada vez que as enzimas de restrição encontram um sítio de restrição que lhes é próprio, clivam
o sítio. Chama-se esta clivagem de digestão do DNA por enzimas de restrição e chamamos os
fragmentos gerados de fragmentos de restrição. Podemos empregar uma digestão com
concentrações reduzidas de enzima, o que vai gerar uma digestão parcial: nem todos os sítios de
reconhecimento da enzima serão clivados, e isto vai permitir obter fragmentos que contenham um
gene inteiro, mesmo que dentro dele haja um ou mais sítios de restrição para a enzima que estamos
empregando.
 
Fig 5.4 Ação da enzima de restrição EcoR1, com geração de extremidades colantes e união de fragmentos de DNA de
origens distintas
 
 Os sítios de restrição ocorrem ao acaso no DNA e tanto mais freqüentes são quanto mais
curtos. A probabilidade de se ter uma seqüência qualquer definida de seis bases é (1/4)6, isto é 1:
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4096. Uma enzima que reconheça um sítio de restrição de 12 bases cortará o DNA com uma
freqüência muito baixa. Após a digestão de um DNA longo por uma enzima de restrição muitos
fragmentos são gerados, tanto maiores quanto maior for o sítio de restrição.
 
 Embora os sítios de restrição apareçam ao acaso, há regiões do genoma pobres em sítios
de restrição: são aquelas ricas em repetições, longas ou curtas. Suponha, por exemplo, que você
tenha uma região com 350 repetições de uma sequência de 200 bases. Será um trecho de 70.000
bases. Se, nesta sequência de 200 bases, não houver o sítio de restrição para a enzima que você
está usando (e as chances de não existir serão grandes, se sua enzimacortar, por exemplo um sítio
com 6 bases, já que você só acha um sítio assim ao acaso a cada 4000 bases), a região não poderá
ser cortada internamente e um enorme fragmento será gerado, não sendo possível cloná-lo num
plasmídeo. Ao contrário, se existir o sítio, a enzima vai cortar o segmento em todas as repetições,
produzindo uma grande quantidade de pequenos fragmentos, em geral inúteis para a genética
molecular.
 
 Para finalizar: qual a vantagem para um fago ter um sítio de restrição alvo de uma
determinada enzima? Nenhuma, evidentemente, mas como os sítios ocorrem ao acaso, é provável
que um fago possa ser restrito por várias de suas potenciais hospedeiras. Por outro lado, qual a
vantagem para uma bactéria em ter uma enzima de restrição que reconhece sítios com 10 pb? Não
será muito raro encontrar um sítio destes num fago? Provavelmente estas bactérias têm uma gama
bastante restrita de fagos que lhes são infectivos e por isso não precisam estar prontas para
clivar sítios frequentes, mas apenas aqueles que existem nos seus fagos invasores. Como a
Natureza estabelece este balanço é uma questão de estudos ainda.
 
 
 
5.5 Clonando DNA num plasmídeo
 
 Finalmente podemos discutir as bases da clonagem de DNA. Para exemplificar o
procedimento empregaremos um plasmídeo como vetor de clonagem e cortaremos o plasmídeo e o
DNA a ser clonado com uma enzima de restrição que forma extremidades coesivas. É preciso ter
em mente contudo, que existem vários outros vetores de clonagem (dos quais discutiremos, em
outro capítulo, o fago lambda e suas variantes comerciais) e diferentes formas de fragmentar e
clonar o DNA (com enzimas de restrição que deixam extremidades cegas, com ou sem posterior
encaudeamento, com nebulização, com prensa francesa, etc.). Em atualizações futuras cada uma
destas técnicas será discutida. Por enquanto, recomendamos a visita do site português sobre
vetores, para uma visão geral sobre os vários vetores de clonagem. A consulta aos livros-texto da
disciplina se impõe, evidentemente. Criamos uma página com vários plasmídeos de clonagem, tanto
para construção de bibliotecas genômicas, como para de cDNA. Recomendamos fortemente sua
visita.
 
 Um vetor de clonagem deve ter certas características, que estão sumarizadas na figura
abaixo. Ao longo desta aula e da próxima, cada característica vai ser comentada.
 
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Figura 5.5.a. - Características essenciais e adicionais (desejáveis) de um vetor de clonagem. Apesar da maior parte
dos vetores serem compostos de fitas duplas de DNA, há exceções, como o fago filamentoso, com DNA fita simples.
 
 O processo se inicia pela extração do DNA das células doadoras e do plasmídeo (neste
exemplo, um plasmídeo pequeno, de aprox. 4,5 kpb, da bactéria E. coli). A extração de DNA não é
um processo complexo: resumidamente, as células são lisadas com um detergente, os restos
celulares e boa parte das proteínas precipitadas por centrifugação em presença de uma
concentração elevada de sal (em geral acetato de potássio) e o sobrenadante, transferido para
outro tubo, é misturado com isopropanol. O DNA não é solúvel neste álcool, mesmo diluído com
água, e tende a precipitar. Para acelerar o processo centrifuga-se o material a 13.000 rpm por
alguns minutos e o precipitado é ressuspenso em água ou num tampão adequado. O DNA que se
obtém desta forma não é muito limpo, mas serve para uma boa parte das aplicações corriqueiras
de laboratório. Atualmente kits comerciais permitem a extração rápida de DNA de praticamente
qualquer tipo de célula, em quantidades e grau de pureza que satisfaçam ao mais exigente
pesquisador.
 
 A extração do plasmídeo é semelhante à descrita acima, mas é preciso usar um
estratagema para separar o plasmídeo do DNA bacteriano. O DNA plasmidial é muito menor que
os fragmentos de DNA cromossômico bacteriano. O truque então consiste em adicionar à solução
de lise uma certa quantidade de álcali. O pH alto desnatura o DNA. Logo em seguida adiciona-se
ácido acético gracial e acetato de potássio: o ácido neutraliza o álcali e os DNAs tendem a
renaturar. Porém, a presença de sal provoca a precipitação de todas as moléculas que não forem
muito solúveis em água. O DNA desnaturado é pouco solúvel em água e precipita. É o caso dos
fragmentos grandes de DNA cromossômico, que não conseguem se renaturar e precipitam (por
centrifugação), junto com as proteínas da bactéria e restos celulares. O DNA plasmidial, ao
contrário, renatura-se rapidamente e torna-se muito solúvel em água, não podendo ser precipitado.
Assim, recolhendo o sobrenadante, teremos essencialmente DNA plasmidial, com uma contaminação
pequena de DNA cromossômico bacteriano.
 
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A figura a seguir mostra um plasmídeo de clonagem clássico, o pBR322, precursos de muitos
plasmídeos modernos de clonagem. Ele foi usado para a construção de bibliotecas genômicas, pois
não permite a expressão do gene clonado. Nele a clonagem é feita em um sítio de restrição dentro
do gene tet, que confere à bactéria hospedeira do plasmídeo a resistência ao antibiótico
tetraciclina. Quando a clonagem é feita dentro da ORF deste gene, ele perde sua função. Outra
marca de resistência, representada pelo gene bla, confere à bactéria hospedeira do plasmídeo a
resistência à ampicilina. A figura 5.5.a abaixo mostra o mapa deste plasmídeo. Observe que o gene
tet pode ser cortado, para fins de clonagem, por várias enzimas de restrição. As mais comumente
usadas são a BamHI (posição 375) e a SalI (651).
 
 
Figura 5.5.b. Mapa do plasmídeo de clonagem pBR322. Observe os dois genes que conferem resistência a antibióticos
(tet patatetraciclina e bla para ampicilina). Os sítios de restrição ao longo da sequência de nucleotídeos estão
indicados em azul, com o nome da enzima. Observe também que as enzimas BamHI e SalI só ocorrem uma vez ao longo
de todo o plasmídeo (dentro do gene tet) e por isso são próprias para a clonagem.
 
 Uma vez com os dois DNAs disponíveis (doador e plasmidial), resta cortá-los com a
enzima de restrição escolhida e misturar os dois DNAs. A tendência será parear as extremidades
coesivas, formando construções híbridas, ou quimeras. A adição de ligase completa a cadeia
fosfodiéster em cada uma das fitas de DNA. Este passo está representado na parte superior da
figura 5.5.b abaixo.
 
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Figura 5.5.c. Esquema para a obtenção de plasmídeos recombinantes, a partir do uso de uma enzima de restrição que
cria extremidades coesivas. Para maiores detalhes veja o texto acima.
 
 Ao menos 5 produtos distintos podem ser formados a partir desta mistura. O produto 1 é
o desejado, no qual um inserto (verde) foi clonado no plasmídeo (vermelho). Mas, lamentavelmente,
outras construções também aparecem: o produto 2 é o mais danoso ao processo, pois se trata do
plasmídeo vazio, fechado sem inserto. Ele é perfeitamente funcional e não pode ser descartado do
processo. O produto 3 é a circularização de vários fragmentos de DNA do doador, numa ordem
qualquer. Este "lixo" não é problemático, porque não contém uma origem de replicação bacteriana.
É um DNA que será perdido ao longo do tempo. O produto 4 é a união de dois (ou mais) plasmídeos
e não se replica tão rápido quando o plasmídeo vazio ou carregado com apenas um inserto, de
forma que acaba desaparecendo ao longo do tempo. O último "lixo" é o plasmídeo carregado com
vários insertos catenados (ligados em cadeia) ou com um inserto muito grande. É uma construção
instável, também, e tende a desaparecer. Assim, excetuando o plasmídeo vazio, todos as outras
quimeras "lixo", uma vez na bactéria, tendem a desaparecer e não são um problema para o
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experimentador.
 
 Uma vez ligado o inserto com o plasmídeo (e produzidos os vários possíveis lixos,
também), é preciso introduzir estas construções na bactéria hospedeira. Isto é feito pela entrada
passiva de DNA através da membrana de bactérias previamente tratadas com uma solução de
cloreto de cálcio, ou ativamente, através de choques elétricos, num processo chamado
eletroporação. A eficiência de transformação (entrada de DNA na bactéria) é bastante baixa
(10-3 a 10-8), mas os transformantes terão o plasmídeo dentro deles, o que lhes deve conferir
propriedades novas, que permitam uma seleção positiva. De fato, os plasmídeos têm uma gene que
confere à bactéria a resistência a um certo antibiótico (suponhamos, ampicilina), de forma que
basta adicionar ampicilina ao meio e eliminaremos rapidamente todas as bactérias que não tiverem
plasmídeo (vazio ou carregado).
 
 E como se ver livre do "lixo" representado pelas bactérias que têm o plasmídeo vazio?
Não é possível, pois o plasmídeo vazio confere a mesma resistência ao antibiótico que o plasmídeo
carregado. Entretanto, é possível averiguar ao menos se, no conjunto de plasmídeos formados, a
maior parte está carregada (com inserto) ou, ao contrário, vazia. Para tal os plasmídeos de
clonagem têm uma segunda marca de resistência a antibióticos (em geral, tetraclina), que é perdida
quando o plasmídeo é aberto e o inserto é clonado. Significa dizer que o sítio de clonagem é
interno ao gene para a resistência à tetraciclina. Significa também dizer que as bactérias que têm
plasmídeos vazios são resistentes a ampicilina e tetraciclina, enquanto as que têm plasmídeos com
inserto só mostram resistência a ampicilina. O procedimento baseia-se na obtenção de uma réplica
de uma placa de Petri contendo colônias crescidas em presença de ampicilina, que é então
carimbada sobre uma nova placa de Petri contendo tetraciclina. As colônias que crescerem
também em tetracilcina não interessam, mas podem ser contadas. A figura abaixo mostra
esquematicamente o procedimento, desenvolvido para outros fins, há quase 50 anos, por Joshua
Lederberg, que também recebeu o Prêmio Nobel pelos seus estudos (Joshua Lederberg, George
Beadle e Edward Tatum receberam o prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1958. Lederberg
provou a existência da recombinação genética em bactérias e contribuiu de forma importante
para o conhecimento da organização gênica de microrganismos. Beadle e Tatum mostraram que os
genes agem regulando eventos químicos definidos. As Palestras Nobel dos três pesquisadores estão
disponíveis no site de downloads).
 
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Figura 5.6 O processo conhecido como réplica, na qual um carimbo de veludo estéril, facilmente improvisado sobre
um cilindro de madeira, serve para transferir um pouco de bactérias de cada colônia de uma placa para outra. Após
24 horas o crescimento na nova placa é avaliado. Neste caso a primeira placa contém meio de cultura adicionado de
ampicilina, enquanto na segunda o meio contém tetraciclina. Da figura pode-se concluir que a maior parte das
bactérias da amostra é sensível à tetraciclina e alberga, portanto, plasmídeos recombinantes (quiméricos, ou com
inserto).
 
 
5.6 Biblioteca genômica: todo o genoma em pedaços... 
 
 O conjunto de bactérias albergando plasmídeos quiméricos ou recombinantes construídos a
partir de DNA genômico é chamado biblioteca genômica. Em princípio, se cortamos um genoma de
um organismo qualquer em pedaços com uma enzima e construímos uma biblioteca suficientemente
grande (isto é, com muitos clones, ou bactérias, diferentes uns dos outros), teremos uma
probabilidade alta de termos qualquer fragmento de DNA desejado em algum dos clones. Esta
meta, contudo, não é tão simples de ser alcançada. As enzimas de restrição só cortam nos seus
sítios específicos e as regiões ricas em repetições muitas vezes não têm nenhum sítio de restrição.
Como o DNA dos eucariotos superiores é muito rico em regiões repetidas, o que ocorre é que uma
parte relativamente grande do genoma não pode ser clonada desta forma.
 
 O recurso para obter fragmentos de tamanho razoável (1 a 4 kpb) ao longo de todo o
genoma é a fragmentação do DNA por nebulização ou por outro método mecânico qualquer e a
clonagem dos fragmentos em um vetor aberto com uma enzima que produz extremidades cegas.
Desta forma pode-se obter mais facilmente uma biblioteca genômica que represente efetivamente
todo o genoma.
 
 
5.7 . Vetores para pedaços maiores...
 
 Quando queremos clonar fragmentos grandes de DNA (e há uma porção de razões para
isto), podemos optar por outros vetores não-plasmideais. A tabela abaixo mostra alguns deles e os
tamanhos de inserto que acomodam. Por enquanto, para maior detalhamento, o leitor deve procurar
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o site português sobre vetores da Universidade de Évora.
 
Tabela 5.1: Sinopse dos vetores mais empregados par clonagem de fragmentos de DNA
Designação
Tamanho
do inserto
Descrição
Plasmídeo 1b-10 kb DNA circular fita dupla
Fago (bacteriófago) até 20 kb DNA linear fita dupla
Cosmídeo até 40 kb
DNA linear fita dupla, que se circulariza para
converter a forma de fago em plasmídeo
BAC - cromossomo
artificial de bactéria
até 250 kb
DNA circular fita dupla (com sinais de cromossomo
bacteriano)
YAC - cromossomo
artificial de levedura
até 2 Mb
DNA linear fita dupla (com sinais de cromossomo de
levedura, como telômeros, centro organizador de
nucléolo, etc.)
 
 
5.8 Sinopse da triagem de bibliotecas genômicas
 
A meta da construção da biblioteca genômica é a obtenção de clones de nosso interesse. Podem
ser, por exemplo, clones com fragmentos de um determinado gene. Como proceder para encontrar
clones que contenham sequencias de DNA que façam parte do gene que procuramos?
 
Em geral temos que nos valer da propriedade que uma fita simples de DNA tem de hibridizar com
uma fita que lhe seja complementar. Assim, uma fita de DNA marcada radiativamente, chamada
sonda de DNA, pode funcionar como um "sistema de busca" de sequências de DNA que tenham
alguma complementaridade com ela. Esta sonda em geral não é muito grande, podendo ter entre
200 e 100 bases. Ela representa, portanto, um trecho do gene no qual estamos interessados.
Portanto, ela vai hibridizar apenas com um trecho do gene. Como exemplo, imagine que construímos
uma sonda de DNA com 250 bases que hibridiza com um trecho do 3o. exon de um gene, cujo
comprimento total é de 4.500 pb (veja Figura 5.7). Qualquer que seja o tamanho do fragmento do
gene clonado, ele irá ser reconhecido pela sonda desque contenha um trecho complementar ao
menos a um pedaço da sonda (usualmente pelo menos 50%). Como os fragmentos gerados são
aleatórios, poderemos conseguir vários clones que representam trechos distintos, em geral
parcialmente sobrepostos, de nosso gene de interesse.
 
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Figura 5.7 A sonda de DNA de 250 bases dirigida contra a parte final do 3o. exon do gene de 4.500 pb é capaz de
reconhecer clones com insertos de fragmentos do gene, desde que contenham alguma parte que hibridize com a sonda.
Na figura, os primeiros 3 fragmentos vão ser identificados pela sonda, e os dois últimos não.
 
Visto isso, podemos discutir a metodologia geral de identificação dos clones de interesse dentro
de uma biblioteca genômica. A técnica é conhecida como triagem ou screening e está representada
na figura 5.8 abaixo.
a) Tudo começa com o plaqueamento de uma alíquota da biblioteca genômica em placas de Petri.
Cada bactéria formará uma colônia. Como elas carregam plasmídeos recombinantes, cada colônia
conterá, além do DNA genômico das bactérias, também o DNA plasmidial e, dentro dele, um
trecho do DNA do genoma do organismoem estudo.
b) Quando as colônias estiverem pequeninas ainda, deve-se cobrir a placa de Petri com uma
membrana de nylon ou outro material que tenha tendência a ligar DNA (há um produto chamado
Hybond, muito usado.
c) Depois de 2 a 4 horas o filtro (membrana) é retirado, obtendo-se assim uma réplica das
colônias da placa no filtro. A placa de Petri original, chamada master, vai para a geladeira, bem
selada com plástico adesivo para não secar nem contaminar.
d) A réplica obtida na membrana ainda tem as bactérias íntegras (e vivas) e o DNA está dentro
delas! Então, precisamos inicialmente lisar as bactérias (o que se faz com vapor de clorofórmio e
depois imersão da membrana em uma solução com SDS e lisozima). Esta etapa libera os DNAs, que
ficam aderidos ao nylon da membrana. Ela é então colocada num saquinho plástico e incubada com a
sonda marcada radiativamente. Para isso o DNA precisa estar aberto, o que pode ser obtido
aquecendo previamente a membrana a 85 - 90 oC ou usando soluções desnaturantes. Após adição
da sonda as condições de hibridização são restauradas.
e) Depois da incubação com a sonda, o excesso dela é lavado e a membrana e sobreposta a um filme
de raio X, indo o conjunto num cassete plástico para o freezer.
f) revelação do autoradiograma mostrará a localização da (ou das) colônia(s) que contiver(em) os
clones de interesse. Volta-se então à placa master e repica-se as colônias selecionadas para tubos
de ensaio com o meio de cultura adequado.
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g) ao final, se quisermos saber o que cada plasmídeo (clone) está carregando, será preciso
sequenciar. Por isso, todos os plasmídeos de clonagem já vem construídos de forma a facilitar o
sequenciamento bi-direcional dos insertos. Para sequenciamento, veja aula 8.
 
 
 
Figura 5.8 Esquema demonstrativo dos passos necessários à triagem de bibliotecas genômicas em plasmídeo
empregando sondas radiativas;
 
 
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