Controle da Expressão Gênica

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4. O controle da expressão gênica
 
 Como dissemos anteriormente, as necessidades de um microrganismo como a bactéria Escherichia coli são muito
variadas e mudam constantemente. Para cada situação determinada a bactéria precisa lançar mão de uma bateria de
enzimas e proteínas, que não estavam disponíveis momentos antes e que provavelmente não serão mais necessárias minutos
depois. Como consegue o organismo ligar e desligar genes, que comandarão a síntese de mRNAs, que darão origem por fim
às proteínas necessárias? A este processo chamamos controle da expressão gênica.
 
O operon lac
 
 Há muitos diferentes mecanismos de controle da expressão gênica, mesmo se considerarmos apenas a bactéria E. coli.
Por isso procuraremos nos concentrar na análise de um deles, que tem muita aplicação em engenharia genética. Este
mecanismo foi elucidado pelos franceses François Jacob e Jacques Monod, que receberam por isso o Prêmio Nobel em
Medicina, em 1965, juntamente com Andre Lwoff (as Palestras Nobel estão disponíveis no site de downloads). Eles
estudaram os genes que codificam as enzimas responsáveis pela degradação da lactose em E. coli. O modelo que discutimos
a seguir já incorpora as modificações subseqüentes, fruto das contribuições de grupos de pesquisa no mundo todo, e
exemplifica de forma didática um mecanismo que é comum a muitos outros microrganismos e observado na regulação de
muitos genes.
 Através de experimentos em genética clássica (empregando mutantes e plasmídeos que transportavam genes e sítios
reguladores para a bactéria hospedeira, criando assim diplóides parciais) Jacob e Monod criaram um modelo no qual o
sítio promotor, associado a um outro sítio chamado operador, controlava a expressão de todos os genes imediatamente
“abaixo”, isto é, 3’, do promotor. A este conjunto chamaram operon. Como os genes que estudavam eram os responsáveis
pela síntese das proteínas que degradavam lactose, chamaram a este arranjo de genes operon lac. O diagrama básico do
operon lac está representado nas figuras a seguir.
 
 
Figura 1: Distribuição dos genes e módulos de controle do operon lac. O gene i, para o repressor lac, expresso constitutivamente, está situado
próximo ao conjunto dos genes induzíveis lacZ, lacY e lacA, responsáveis pela síntese das proteínas b-galactosidase, permease e transacetilase. O
promotor plac é controlado pelo operador olac, onde se ligam duas moléculas do repressor.
 
 O sítio operador é uma região do DNA logo abaixo do sítio promotor. Na verdade, os dois sítios estão parcialmente
embricados (superpostos), pois o promotor se estende da base -45 até a base +5, enquanto o sítio operador vai da base -8
até a +12. Desta forma, se tivermos uma proteína ligada ao sítio operador, ela vai impedir que este seja ligado pela
RNApol. Uma analogia razoável seria comparar o promotor com uma bota, em cujo bico está o sítio operador. Quando o
bico da bota está ocupado com uma pedra, não se pode calçar a bota. Analogamente, quando o operador está ocupado pelo
represssor lac (produto do gene i, que se liga ao operador na forma de um dímero), a RNA polimerase não pode se ligar ao
promotor. O repressor lac, por sua vez, é o produto de um gene que está próximo ao operon, porém não faz parte integral
dele (na verdade, este gene poderia estar muito distante no genoma de E. coli). Na ausência de lactose, as poucas moléculas
de repressor presentes no citosol da bactéria (menos de 10 por célula!) são suficientes para silenciar a expressão do
operon, ligando-se ao sítio operador. Todos estes eventos estão representados na figura 2a, a seguir.
 
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Figura 2a: Esquema representativo do controle da transcrição dos genes para as enzimas responsáveis pelo uso da lactose em E. coli. O repressor,
produto do gene i, liga-se ao operador (em verdade, duas moléculas), impedindo a ligação da RNApol ao sítio promotor Plac e bloqueando a
transcrição. O repressor está representado por elipses vermelhas.
 
Na presença de lactose, contudo, o repressor é inativado pela ligação de um produto do metabolismo da lactose, a
alolactose. Inicia-se, então, a transcrição dos genes lacZ, lacY e lacA, formando-se um mRNA policistrônico. Este mRNA é
imediatamente traduzido para formar três enzimas da via de degradação da lactose: a b-galactosidase (b-gal), a permease
e a transacetilase. A b-gal degrada a lactose a galactose e glicose e a permease aumenta muitas vezes a permeabilidade da
célula à lactose. Com isto a lactose do meio de cultura é rapidamente assimilada e utilizada pela célula. Quando a
concentração de lactose reduz-se muito, até as moléculas que estão ligadas ao repressor acabarão sendo clivadas pela b-
gal. A consequência disto é a ligação dos repressores, agora ativos, ao sítio operador, provocando a parada da transcrição
dos genes lacZ, lacY e lacA. Estes eventos estão representados na figura 2b a seguir.
 
 
 
Figura 2a: Esquema representativo do controle da transcrição dos genes para as enzimas responsáveis pelo uso da lactose em E. coli. A lactose no
citosol bacteriano (rigorosamente, a alolactose, produto obtido pela transformação da lactose no interior da bactéria) liga-se ao repressor,
inativando-o e liberando o promotor para ser ligado pela RNApol. O processo de transcrição estará liberado até que a concentração citosólica de
lactose seja insuficiente para garantir a inativação das moléculas do repressor. Os produtos dos genes lacZ, lacY e lacA, b-galactosidase,
permease transacetilase, respectivamente, estão representados por elipses azuis, em três tonalidades. O repressor está representado por elipses
vermelhas.
 
 
 Este é o exemplo clássico de um operon que funciona por repressão. Há muitos outros semelhantes, que controlam em
geral a síntese de enzimas responsáveis pela degradação de um determinado produto nem sempre disponível no ambiente.
Há também genes operons que estão sempre “ligados” e que devem ser silenciados em determinadas situações. São em geral
os genes para biossíntese de algum produto que a bactéria pode obter do ambiente. Somente quando falta este produto no
meio de cultura é que a bactéria ativa a transcrição dos genes que irão produzir as enzimas necessárias à biossíntese do
produto em falta.
 
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Um ponto que fica obscuro na explicação acima é: como a lactose entrou na célula, se a permease não estava presente na
membrana para transportá-la do exterior para o citosol? A razão é a seguinte: há sempre um pouco de permease na
membrana, porque o operon "vaza", isto é, um pouco dos três produtos gênicos é sempre produzido. E vaza porque os
repressores se desligam por breve momento do operador, já que a ligação de moléculas uma às outras por forças fracas
não é eterna. No instante em que o operador estiver livre uma RNA polimerase pode transcrever o operon, o que de fato
acontece. O vazamento é observado em todos os genes e operons bacterianos e, em grau muito menor, na maioria dos
genes dos demais organismos. Pode parecer um gasto de energia desnecessário, mas o vazamento é inevitável. Por outro
lado, sem ele a maior parte dos operons não funcionaria, porque não teria como ser disparado.
 
 
 Além destes dois sistemas há ainda outros, bastante mais complexos, que modulam de forma fina a expressão de
genes nos procariotos. Há mesmo operons que são controlados por repressão e ativação simultaneamente. Vale ressaltar que
o próprio operon lac tem uma particularidade, descoberta muitos anos depois de sua elucidação por Jacob e Monod: é o
controle da sua expressão exercido por uma proteína chamadaCAP (“catabolite gene activator protein”), uma proteína
dimérica como o repressor lac, com aprox. 45.000 Da. A proteína CAP não tem qualquer influência na expressão do operon
enquanto não estiver ligada ao AMP cíclico. Entretanto, uma vez ligada, ela se associa a um sítio acima (5’) do promotor, o
que permite uma ligação muito mais rápida e efetiva da RNApol ao sítio promotor. Na analogia da bota que fizemos acima,
o complexo CAP-cAMP funcionaria como uma calçadeira: na ausência de pedra na ponta da bota (repressor) a calçadeira
(CAP-cAMP) facilitaria muito a entrada do pé (RNApol) na bota (promotor). Este curioso mecanismo de controle positivo
do operon lac também foi observado em diversos outros operons bacterianos. Qual seu objetivo, afinal? A explicação é
simples: quando a bactéria não tem glicose para degradar, ela passa por um processo de “fome” celular, com conseqüente
aumento dos níveis de cAMP celulares. Este cAMP se liga à proteína CAP, permitindo uma expressão aumentada de todos
os operons que são responsáveis pela degradação de açúcares e outros produtos energéticos. A figura a seguir ilustra e
comenta o fenômeno da "indução" da expressão pelo consumo da glicose.
 
 
P.: Quando se adicional lactose ao meio de cultura da bactéria E.
coli, há um aumento da produção de b-galactosidase, mas de apenas
10X. Somente depois de alguns minutos é que a produção de b-gal
dispara para 100.000 X o valor final. Como se explica isso, que está
representado no gráfico abaixo?
 
 
R: O fenômeno pode ser explicado pela conversão do promotor lac
de fraco em forte. Na natureza, o promotor deste operon em E. coli
é fraco, isto é, mesmo quando liberado, ele não será sempre
reconhecido pela RNApol. Consequentemente, a expressão dos genes
do operon vai ser discreta. Assim que adicionamos lactose ao meio
de cultura (que tinha uma pequena fração de glicose, sem que os
experimentadores se dessem conta disso), o promotor é liberado,
pois os repressores que estavam ligados ao operador são retirados.
Mas sendo o promotor fraco, o aumento de expressão é de apenas
10X. Após um intervalo de tempo (Dt) a glicose residual presente no
meio de cultura é degradada, o que faz com que a concentração do
cAMP da célula comece a aumentar (indicando a fome celular). O
cAMP se liga a uma proteína citosólica denominada CAP, e o
complexo CAP-cAMP vai ligar-se ao DNA bacteriano um pouco acima
do promotor lac (em torno da posição -45). Assim que isso ocorre, o
promotor converte-se de fraco em forte, obrigando a toda RNApol
que passar por ele a transcrever uma fita de RNA. O resultado é a
produção explosiva de b-galactosidase, que vai ser usada para
degradar e aproveitar rapidamente a lactose do meio, "matando a
fome" da bactéria. Enfim, o gráfico demonstra a conversão de um
promotor fraco num promotor forte e a predileção da E. coli pela glicose como fonte de energia.
 
 
 
Figura 4: Controle do operon lac pela proteína CAP
 
 Novo! Veja mais sobre a maneira como o complexo CAP-cAMP controla a transcrição dos genes lacZ. lacY e lacA no
link
 
 
 
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Que importância tem o operon lac na genética molecular? Muitos dos vetores de expressão, sejam eles fagos ou plasmídeos,
empregados em engenharia genética, têm o gene clonado sob o controle de um promotor/operador lac. Este sistema
propicia o controle da expressão do gene clonado através da adição de um análogo da lactose, o IPTG
(isopropiltiogalactosídeo). Este produto é muitas vezes mais efetivo que a lactose na indução da expressão do operon lac,
além de não ser degradado. Veremos mais adiante como podemos tirar vantagem destas construções artificiais de genes
para a produção de proteínas recombinantes.
 
 
 
O operon triptofano (operon tryp)
 
 A biossíntese de aminoácidos é um processo muito caro em termos energéticos. Por isso, quando há, por exemplo, 
triptofano disponível no meio de cultura, a Escherichia coli imediatamente cessa de produzir as enzimas necessárias à
biossíntese do aminoácido. O processo é alcançado pela ativação de um repressor solúvel que, na ausência de triptofano, é
inativo. A ativação é feita, compreensivelmente, pelo próprio triptofano que assim, estando presente, bloqueia sua própria
síntese endógena. A figura abaixo representa este processo. Quando a concentração de triptofano diminui muito, o
complexo repressor-triptofano se desfaz e o operon é ativado. A figura mostra de forma esquemática que o operon tem
uma região que antecede os genes da via biossintética propriamente ditos, trypE, trypD, trypC, trypB e trypA. Esta
sequência é conhecida como sequência líder e tem um papel fundamental no processo que será discutido mais adiante,
chamado atenuação. Observe que cada gene inicia com um códon ATG e termina com um códon TGA (ou qualquer dos outros
dois códons de parada).
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5: Esquema representativo do controle da transcrição dos genes para as enzimas responsáveis pela síntese de triptofano na E. coli, no nível
de repressão do operador. O repressor é inativo logo após sua síntese e necessita do triptofano para ativar-se. Quando isto ocorre, ele se liga ao
operador , impedindo a ligação da RNApol ao sítio promotor Ptryp e bloqueando a transcrição. O processo de transcrição é de novo liberado
quando a concentração citosólica de triptofano é insuficiente para garantir a ativação das moléculas do repressor.
 
 
 Pela primeira vez ao longo deste texto enfatizamos a presença de uma sequência que antecede a região a ser
traduzida, representada na figura pela sigla SD. É a sequência de Shine-Delgarno, ou sítio ligador de ribossomos (RBS) da
E. coli. Os demais procariotos têm estruturas muito semelhantes e os eucariotos não são muito diferentes neste aspecto. A
sub-unidade leve do ribossomo, ainda antes de agregar-se à sub-unidade pesada, associa-se ao mRNA através desta
sequência e desliza no sentido 3 ´até alcançar o primeiro códon AUG. De acordo com o conhecimento atual o tRNA para
formil-metionina (nos procariotos) também se liga à sub-unidade leve associada ao mRNA, ainda no RBS, e é ele que
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determina a parada do complexo "sub-unidade leve-tRNA" no primeiro códon AUG (que o anti-códon do tRNA para
metionina reconhece). À frente de todo gene ou região que será traduzida (como a parte da sequência líder do operon
triptofano, da qual falaremos em breve, que dá origem a um peptídeo líder) deve haver fatalmente um RBS, como mostrado
na figura acima e nas demais abaixo, neste sub-item, sem o que não haverá síntese protéica. A existência de um RBS entre
genes de um mRNA policistrônico é a forma pela qual a natureza garante a tradução do gene após a liberação das duas
sub-unidades do ribossomo quando termina a tradução do gene anterior.
 Uma vez liberado o operador, há a transcrição imediata do DNA. O RNA produzido inicia-se pelas 4 sequências
representadas em vermelho, que têm uma particularidade interessante: podem parear duas a duas, 1 com 2, 2 com 3 ou 3
com 4, formando sempre grampos. Apenas o grampo 3-4 é um grampo de terminação, pois é seguido de um poli-U. Por
outro lado, apenas a primeira sequência possui códons para triptofano (dois seguidos, neste caso). Para que existe esta
sequência-líder à frente dos genes da via biossintética? Como veremos a seguir, ela serve para interromper precocemente
a síntese de RNA caso ainda haja algum triptofano no citosol bacteriano, insuficiente para ativar o repressor mas
suficiente para garantir a produção de proteínas. O que a bactéria mede com este sistema? A concentração de tRNA
carregado com triptofano, que é exatamente o "precursor" deste amonoácido necessário à cadeia polipeptídoca nascente.
 A figura a seguir mostra asituação em que a quantidade de triptofano na célula é tão reduzida que não há tRNA
carregado com triptofano disponível para a síntese protéica.
 
 
Figura 6:Esquema representativo do controle da transcrição dos genes para as enzimas responsáveis pela síntese de triptofano na E. coli, no nível
de atenuação. A parada dos ribossomos sobre a região 1 (I) permite o pareamento das regiões 2 e 3 (II) que, distantes do poli-U que sucede a
região 4, não configuram um grampo de terminação. A transcrição progride (III), dando ao final a síntese das 5 enzimas que formam a via
biossintética do triptofano.
 
 A síntese do mRNA inicia-se assim que o operador é liberado.O ribossomo se liga à sequência de Shine Delargno
acima (5 )´ da região 1 e desliza até encontrar o primeiro AUG. Ao entrar na região 1 o ribossoma vai encontrar dois
códons para triptofano. Na situação prevista nesta figura não há tRNA carregado com triptofano. A síntese protéica
pára. A síntese de RNA continua, pois é independente destes fatores, transcrevendo as regiões 2 e 3, que pareiam entre
si, já que a região 1 está protegida contra pareamentos pelos ribossomos que a estão cobrindo. Em seguida a RNApol
transcreve a região 4 e a sequência poli-A, dando origem a uma sequência poli-U. Este poli-U está muito distante do
grampo 2-3 formado anteriormente e não configura um grampo de terminação. A síntese de RNA, portanto, avança pela
região dos genes da biossíntese do triptofano e termina por permitir a síntese das 5 enzimas da via biossintética. Todo
este processo faz sentido nesta situação, pois não há definitivamente triptofano suficiente para garantir a síntese das
proteínas pela bactéria.
 Ao contrário, quando há ainda um pouco de triptofano, insuficiente para ativar o repressor mas suficiente para
garantir a síntese protéica, o pareamento das sequências que compões a sequência-líder muda. A figura seguinte
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representa esta nova situação.
 
Figura 7: Esquema representativo do controle da transcrição dos genes para as enzimas responsáveis pela síntese de triptofano na E. coli, no nível
de atenuação. A cobetura das regiões 1 e 2 pelos ribossomos, na presença de tRNA carregado com triptofano no citosol bacteriano, permite o
pareamento das regiões 3 e 4 que, próximas do poli-U que sucede a região 4, configuram agora um grampo de terminação. A transcrição é
encerrada precocemente, não dando origem à síntese das 5 enzimas que formam a via biossintética do triptofano.
 
 Nesta nova situação a quantidade de triptofano é muito pequena, porém suficiente para garantir a presença de
tRNAs carregados com triptofano no citosol. Com isto, os ribossomos não param sobre a região 1 e progridem para a
região 2, quando a RNA polimerase está transcrevendo a região 3. Antes que toda a tradução da região 2 seja, feita a
RNApol já transcreveu a região 4 e formou o poli-U, o que dá origem ao grampo de terminação mostrado na figura acima.
ativado. É bom relembrar que as regiões 1 e 2 não podem parear pois estão recobertas e protegidas pelos ribossomos
engajados na síntese do peptídeo líder. Quando este fenômeno acontece, a síntese de RNA é encerrada antes da
transcrição dos genes da via biossintética, e nenhuma enzima da via será produzida. De fato, a atenuação da transcrição
economiza energia da bactéria, que não precisa sintetizar enzimas para a produção de um aminoácio que ela ainda dispõe,
embora em pequena quantidade.
 O mesmo mecanismo descrito para o triptofano é empregado em outras vias biossíntéticas de aminoácidos. A razão
parece ser o alto custo energético destas vias. A Natureza criou com este sistema uma forma de discriminar entre pouco e
insuficiente, contornando a forma tosca com que o sistema repressor/operador controla a expressão gênica (lembre-se de
que o repressor se desliga ocasionalmente do operador, dando origem ao vazamento, que é importante para a expressão
gênica, particularmente ao disparo de certos operons, como o lac). É possível que se um sistema de repressão simples como
o das bactérias fosse "regulado" para não ser aberto ou fechado senão em circunstâncias extremas, ele jamais
funcionaria, ficando sempre fechado ou sempre aberto, conforme o caso.
 
 
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