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X JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2010 – UFRPE: Recife, 18 a 22 de outubro. 
 
 
CROMATOGRAFIA DE AMINOÁCIDOS EM PAPEL EM AULAS 
PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA 
 
Aline Ferreira da Silva Mariano
1
, Priscila Alexsandra de Aguiar Freitas
2
, Vera Lúcia de Albuquerque 
Ramalho
3
 e Janaína de Albuquerque Couto
4
. 
 
 
________________ 
1. Aluna de Graduação e Monitora Bolsista da Disciplina Bioquímica, do Departamento de Bioquímica e Biofísica, Universidade Federal Rural de 
Pernambuco. Rua Manoel de Medeiros s/n. Dois Irmãos. Recife – PE. CEP 52171-900. E-mail: aline18.bio@gmail.com 
2. Aluna de Graduação e Monitora Bolsista da Disciplina Bioquímica, do Departamento de Bioquímica e Biofísica, Universidade Federal Rural de 
Pernambuco. Rua Manoel de Medeiros s/n. Dois Irmãos. Recife – PE. CEP 52171-900. 
3. Professora Adjunta do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Área de Bioquímica e Biofísica. Universidade Federal Rural de 
Pernambuco. Rua Manoel de Medeiros s/n. Dois Irmãos. Recife – PE. CEP 52171-900. 
4. Professora Assistente do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Área de Bioquímica e Biofísica, Universidade Federal Rural de 
Pernambuco. Rua Manoel de Medeiros s/n. Dois Irmãos. Recife – PE. CEP 52171-900. 
Introdução 
Os aminoácidos são os constituintes básicos das 
proteínas, as moléculas mais abundantes dos sistemas 
vivos. Quanto a sua fórmula geral, os aminoácidos são 
formados por um átomo de carbono central (carbono 
α), ligados a um grupo amino (-NH2), um grupo 
carboxila (-COOH), um átomo de hidrogênio e um 
grupo variável chamado cadeia lateral ou grupo R. Em 
pH fisiológico, os grupos amino e carboxila encontram-
se na forma ionizada [1,2]. 
 
De acordo com a polaridade do grupo R, os 
aminoácidos podem ser classificados em: aminoácidos 
apolares, polares sem carga, polares com carga positiva 
e polares com carga negativa [1]. As propriedades do 
grupo R são importantes para a conformação das 
proteínas e, portanto, para sua função. 
 
No âmbito da Bioquímica, o estudo das propriedades 
dos aminoácidos apresenta contribuições importantes 
nas áreas das ciências biológicas, tendo em vista os 
conceitos básicos trabalhados, os quais servirão como 
requisitos em diversos outros temas de estudo. Neste 
contexto, a aplicação de técnicas de separação e 
identificação de aminoácidos constitui uma importante 
ferramenta no estudo de suas propriedades. 
 
Entre estas técnicas, a cromatografia se enquadra 
como um método de análise qualitativa, permitindo a 
identificação e dosagem de componentes de misturas 
de aminoácidos, ácidos graxos, carboidratos e 
derivados, vitaminas, polímeros, etc [3]. 
 
No trabalho em questão, foi escolhida a 
cromatografia em papel, pois separa os aminoácidos 
em função das suas solubilidades no solvente, o que 
depende da estrutura da cadeia lateral (figura 1A), onde 
os que possuem cadeias laterais apolares volumosas 
migram mais rápido do que os aminoácidos com 
cadeias laterais apolares mais curtas ou com cadeias 
laterais polares. Isto reflete a maior solubilidade 
relativa das moléculas polares na fase estacionária e 
das moléculas apolares nos solventes orgânicos, e que o 
comprimento maior da cadeia apolar resulta em maior 
mobilidade [2,3]. 
 
A cromatografia em papel apresenta como vantagem 
o baixo custo, que necessita de pequenas quantidades 
de amostra além de boa resolução, sendo utilizada para 
a identificação de componentes de uma mistura, 
comparando-a com o comportamento de substâncias 
conhecidas, chamadas de padrões, onde o solvente é 
geralmente uma mistura de água, álcoois e ácidos ou 
bases; seus componentes mais polares associam-se ao 
papel (celulose) e formam a fase estacionária, enquanto 
os componentes menos polares formam a fase móvel 
[3]. 
 
Para a identificação das substâncias de uma mistura 
é necessário calcular o fator de retenção (Rf), 
dividindo o valor da distancia percorrida pela 
substância pela distância percorrida pela fase móvel. 
 
Em condições experimentais definidas, o Rf é uma 
constante física própria de cada substância e seu valor 
varia de 0 a 1. Assim, a identificação pode ser feita 
comparando-se o Rf de uma mistura com os valores do 
Rf dos padrões, para isso, normalmente, fazem-se as 
corridas cromatográficas simultaneamente no mesmo 
papel [3]. 
 
Diante do exposto, o objetivo do presente trabalho 
foi realizar uma aula prática onde os alunos pudessem 
aplicar o processo cromatográfico e por meio da 
cromatografia em papel, separar e identificar os 
componentes de uma mistura contendo aminoácidos, 
baseados nos valores dos Rf. Esta prática vem a 
permitir o conhecimento de uma importante técnica de 
análise empregada cotidianamente em laboratórios de 
pesquisa, nas áreas de bioquímica e química orgânica, 
bem como em algumas indústrias, como a farmacêutica 
[4]. 
 
Material e métodos 
O presente trabalho foi realizado no laboratório de 
Bioquímica e Biofísica da Universidade Federal Rural 
de Pernambuco, Dois Irmãos, Recife, PE. Participaram 
desta aula prática alunos de graduação em Bacharelado 
em Ciências Biológicas, onde a primeira etapa foi a 
entrega dos protocolos de aula, seguida da divisão das 
equipes, sendo exigido a utilização dos equipamentos 
de proteção individual. 
 
Antes da aula, foram preparados todos os reagentes. 
Sobre a bancada, além dos reagentes, também estavam 
dispostos os seguintes materiais: pipetas, papel filtro, 
lápis, béqueres, tubos capilares e régua. Cada grupo 
recebeu estes materiais, para que fosse feita a análise. 
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O Procedimento da aula consistiu na realização das 
identificações de aminoácidos presentes em uma 
amostra, seguindo o protocolo entregue, onde os alunos 
observaram as corridas cromatográficas de cada 
aminoácido, calcularam o Rf de cada um, anotaram e 
compararam os resultados para posterior discussão. 
 
A. Preparação do Material 
 
Inicialmente foi preparado o sistema de eluição (fase 
móvel), misturando 40 ml de butanol com 10 ml de 
ácido acético e 50 ml água destilada. Esta solução foi 
mantida em repouso em sistema fechado para saturar, 
por aproximadamente 1 hora. Durante esse tempo, o 
papel filtro foi cortado com 08 cm de largura e 10 cm 
de altura, tomando como referência o diâmetro e a 
altura do béquer. 
 
Em seguida, foi feita a solução reveladora de 
Ninhidrina a 0,2% em butanol a 95%, pois é ela que 
permitirá a visualização da corrida dos aminoácidos, 
pela reação da Ninhidrina com o grupo amino (-NH2) 
dos aminoácidos, formando um produto de coloração 
púrpura ou amarela. Para a solução de butanol a 95%, 
foi pipetado 95 ml de butanol em uma proveta de 100 
ml e completado o volume com água destilada. Em 
seguida, adicionou-se 0,2g de Ninhidrina em um 
béquer, a qual foi dissolvida com 50 ml da solução de 
butanol a 95% com o auxilio de um bastão de vidro, e 
foi transferido para um balão volumétrico de 100 ml e 
completado com o restante da solução de butanol 95%. 
 
Posteriormente, foram feitas as soluções com os 
aminoácidos Alanina, Arginina e Metionina, a partir da 
adição de 50mL de água em 3 Béqueres distintos, 
contendo 0,25g de cada aminoácido. A mistura foi 
preparada a partir da adição de 10mL de cada solução 
de aminoácido. 
 
B. Desenvolvimento do Cromatograma 
 
Decorrido 1 hora, 50 ml do solvente foi colocado em 
um béquer de 500 ml. O papel de filtro utilizado foi 
previamente marcado com linha inferior, superior e 
pontos de aplicação das amostras, a qual foi feita com a 
utilização de tubos capilares. 
 
A aplicação das amostras foi feita de tal modo que a 
mancha formada sobre o papel não excedesse um 
diâmetro de 0,5 cm e para cada solução, utilizando um 
capilar para cada solução. Esperou-se que as manchas 
secassem e o papel foicolocado em um béquer com o 
solvente, onde o mesmo entrou em contato com o 
solvente apenas pela sua extremidade inferior, abaixo 
da linha de aplicação dos compostos. 
 
O papel foi deixado no béquer, onde o solvente 
subiu por capilaridade (figura 1B), até alcançar a linha 
traçada na extremidade superior. Ao ascender, o 
solvente arrasta mais os compostos menos adsorvidos 
na fase estacionária, separando-os dos mais adsorvidos. 
Em seguida, o papel foi colocado na estufa a 100º C, 
para evaporar o solvente. 
 
C. Revelação do cromatograma 
 
Como a maioria dos compostos orgânicos é incolor, 
faz-se necessária a utilização de um processo de 
revelação para que se possa analisar o resultado, por 
isso pulverizou-se o papel com a solução de 
Ninhidrina. Secou-se novamente o cromatograma, na 
estufa a 100º C. Logo após foi verificada as manchas 
coloridas que apareceram no papel. Em seguida, as 
distâncias das manchas dos aminoácidos foram 
medidas com a régua. Por fim foram calculados os Rf e 
identificaram-se os aminoácidos presentes na mistura, 
comparando com os Rf de cada padrão. 
 
Resultados e Discussão 
As tonalidades obtidas na revelação do 
cromatograma permitiram a visualização das distâncias 
percorridas pelos aminoácidos (figura 1C). 
 
Os resultados da análise do cromatograma foram 
expressos através do cálculo do Rf para cada situação. 
A distância percorrida pelo solvente no papel foi de 6 
cm. O primeiro aminoácido, localizado no lado 
esquerdo da figura 1C, foi a Metionina, que devido a 
sua cadeia lateral apolar volumosa migrou mais rápido, 
percorreu 5 cm e obteve um Rf= 0,83; seguindo a 
ordem, o segundo aminoácido, Alanina, também com 
cadeia lateral apolar, porém curta, percorreu 4 cm e 
resultou num Rf= 0,67 e a distância percorrida pela 
Arginina, foi de 3 cm, obtendo um Rf = 0,5, sendo este 
um aminoácido de cadeia lateral polar positiva e por 
isso teve uma migração lenta. 
 
O Rf da mistura foi calculado a partir de cada 
mancha percorrida no papel, com isso foi permitido 
identificar quais os aminoácidos estavam contidos na 
mistura, através da comparação dos Rf de cada 
aminoácido contido na mistura e o Rf dos aminoácidos 
separadamente. 
 
Após a obtenção dos resultados, foram discutidos 
possíveis aplicações desta técnica. Entre estas, a mesma 
pode ser utilizada no diagnóstico de aminoacidopatias, 
que são doenças raras do metabolismo de aminoácidos, 
geralmente relacionadas com a deficiência de enzimas 
que participam do catabolismo dos aminoácidos [5]. A 
partir desta prática, os estudantes de biologia puderam 
aplicar conceitos teóricos trabalhados na disciplina, 
aplicado a uma situação prática. 
 
Agradecimentos 
A Universidade Federal Rural de Pernambuco; 
Aos professores, monitores e alunos que contribuíram 
para a realização desta aula prática. 
 
Referências 
[1] CHAMPE, P. C.; HARVER, R. A.; FERRIER, D. R. 2008. 
Bioquímica ilustrada. Paraná: Editora Artmed. 620p. 
[2] MARZZOCO A.; TORRES, B. B. 2007. Bioquímica Básica. 
Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 388p. 
[3] RIBON, A. O. B.; QUEIROZ, J. H. 2007. Práticas de 
Bioquímica. Minas Gerais: Editora UFV. 120p. 
[4] OLIVEIRA, A. R. M.; SIMONELLI, F.; MARQUES, F. A. 
1998 [online]. Experimentos cromatográficos. Homepage: 
http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc07/exper2.pdf 
[5] NARDY, M. B. C.; STELLA, M. B.; OLIVEIRA, C. 2009. 
Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica: uma visão 
integrada. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 212p. 
X JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2010 – UFRPE: Recife, 18 a 22 de outubro. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Preparação e análise do cromatograma contendo amostras de aminoácidos. A: Estrutura dos aminoácidos utilizados; B: 
Solvente ascendendo por capilaridade no papel filtro; C: Resultado da reação com a Ninhidrina, após colocar na estufa; D: Estudante 
coletando a amostra de um aminoácido; E: Estudante colocando o cromatograma na estufa.