Aula 3 - Giemsa e bandamentos

Prévia do material em texto

Colorações e 
Bandamentos Cromossômicos
Metáfase mitótica humana corada com Giemsa
Quais características cromossômicas você reconhece?
� número
� tamanho
� morfologia
Classificação quanto à posição do centrômero
p
q
cromossomo
cromátide
centrômero
Índice centromérico p
p + q 
Razão de braços q
p 
Tamanho relativo p + q 
TT
x 100
x 100
Razão Classificação
de braços cromossômica
1,00 – 1,67 Metacêntrico
1,68 – 3,00 Submetacêntrico
3,01 – 7,00 Subtelocêntrico
7,01 - ∝∝∝∝ Telocêntrico
Green & Sessions, 1991
Metáfase mitótica Cariograma
Ideograma Tabela com medidas
Cariótipo do peixe Dormitator maculatus
Ordenação dos cromossomos em peixes depende da classificação dos cromossomos
Cromossomos podem ser alinhados pelo centrômero
Cariótipo humano
Bandamentos permitem caracterização mais detalhada do cariótipo
- detecção de NOR- detecção de heterocromatina
D
A
P
I
C
M
A
3
FISH
Bandamento C Método Ag-NOR
Fluorocromos
DAPI
Ricos em ATrDNA
Bandamento C
• detecta segmentos de heterocromatina (constitutiva)
HCl (0,2 N ou 0,02N por 15 minutos a 1 hora)
Ba(OH)2 (5% por 15 segundos a alguns minutos)
2xSSC (60oC por 15 minutos a 1 hora)
Giemsa
Ácido 
Acético 
HCl
(depurinação)
Ba(OH)2
(β-eliminação)
2xSSC 
(remoção dos fragmentos)
Giemsa
Ácido 
Acético 
Bandamento C
β-eliminaçãodepurinação
Coloração com Fluorocromos Base-Específicos
• DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)
- agente intercalante
- interação com sulco menor (minor-groove)
- tem grande afinidade por AT
DAPI
Formamida + DAPI Bandamento C + DAPI
Coloração com Fluorocromos Base-Específicos
• Cromomicina A3 (CMA3) e Mitramicina (MM)
- têm maior afinidade por CG
- interação com sulco menor do DNA (minor-groove)
CMA3 Bandamento C + CMA3
Coloração com Fluorocromos Base-Específicos
CMA3 Bandamento C + CMA3
DAPI Bandamento C + DAPI
A
T
C
G
NOR B a
n
d
a
 
C
Bandamento G
Digestão de proteínas com tripsina (por alguns segundos)
Coloração com Giemsa
Bandas escuras: mais AT; menos genes; replicação mais tardia
Bandas claras: mais CG; mais genes; replicação mais precoce
Aquecimento em solução-tampão por alguns minutos
Giemsa
Bandamento R
• Bandamento reverso 
Bandas claras: mais AT; menos genes; replicação mais tardia
Bandas escuras: mais CG; mais genes; replicação mais precoce
Bandamento por incorporação de BrdU
PO4PO4
• BrdU (bromo-desoxiuridina) – análogo de timidina
timidina BrdU
intérfase
G1 S G2
Origem 
de replicação
Centrômero 
Bandamento por incorporação de BrdU
• BrdU (bromo-desoxiuridina) – análogo de timidina
Durante a replicação do DNA,
o BrdU é incorporado no lugar da timidina
Sítios onde BrdU é incorporado, 
coram menos com Giemsa (+Hoechst)
Bandamento por incorporação de BrdU
Durante a replicação do DNA,
o BrdU é incorporado no lugar da timidina
Sítios onde BrdU é incorporado, 
coram menos com Giemsa
P. distincta - Kasahara et al. 1998
Método Ag-NOR
• detecta NORs (regiões organizadoras de nucléolo)
2 gotas de gelatina 2%
4 gotas de AgNO3 50%
Ag0 : precipita (↓) sobre proteínas nucleolares
Núcleos interfásicos
com nucléolos marcados
Cromossomos com NORs marcadas
Método Ag-NOR
Ag-NOR às vezes evidencia regiões de heterocromatina além das NORs