Aula 4 - FISH

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FISH (Hibridação in situ fluorescente)
1. Confecção da sonda
2. Preparo dos cromossomos
3. Desnaturação da sonda e dos cromossomos
4. Hibridação
5. Lavagem para remoção do excesso de sonda
6. Detecção da sonda
- detecção direta
- detecção indireta
7. Diferentes aplicações conforme o tipo de sonda
8. Fiber-FISH: uma variante de FISH
- marcação com fluorocromos
- marcação com compostos repórteres
Hibridação in situ fluorescente 
(FISH: Fluorescence In Situ Hybridization)
Luciana Bolsoni Lourenço
Visão geral da técnica de FISH
1. Marcação do DNA – Construção da sonda
Marcadores
� fluorocromos (marcação direta)
- fluoresceína (FITC –506;529)
- Texas red (595;620)
- Rodamina B (560;584)
- Spectrum orange (559;588)
� compostos repórteres (marcação indireta)
- biotina
- digoxigenina
Métodos de marcaçãoMétodos de marcação
� “Nick translation”
� “Random priming”
� PCR
Marcação de DNA por “nick translation”
5´
5´
5´
5´
5´
5´
3´
3´
3´
3´
3´
3´
DNase I
DNA polimerase I
Sonda de DNA
dNTP + dUTP*
anelamento 
dos primers
desnaturação e
Fragmento Klenow
+
dNTP e dATP*
desnaturação
Marcação do DNA por “random priming”
NICK TRANSLATION RANDOM PRIMING
� todas as cadeias são marcadas
� fragmentos entre 200 e 500 pb
� apenas uma das fitas é marcada
� fragmentos entre 100 e 5000 pb
� maior quantidade de DNA total
Ciclo 1
Ciclo 2
Ciclo 3
Marcação do DNA por PCR
mov
2. Preparo dos cromossomos
- tratamento com RNase A
- desidratação
Etanol
50%
Etanol
75%
Etanol
100%
3. Desnaturação do DNA por alta temperatura
Formamida se liga aos grupos –NH2 livres da adenina
e previne a formação de pontes de hidrogênio
-sonda: 95oC
-cromossomo: 70oC
Preparo dos cromossomos
- tratamento com RNase A
- desnaturação
Confecção da sonda
Desnaturação
4. Hibridação
5. Lavagem para remoção de excesso de sonda
McaL1
Microtus cabrerae M. cabrerae - fêmea
Lavagem em alta estringência Lavagem em baixa estringência
5. Lavagem para remoção de excesso de sonda
6. Detecção da sonda
6. Detecção direta da sonda 
Fluoresceína
Rodamina 
Cumarina 
espaçador
6. Detecção direta da sonda 
506 nm
529 nm
Microscópio de epifluorescência
488-506 nm
529 nm
Composto fluorescente
Composto marcador (ex.: digoxigenina,
ou biotina)
Anticorpo (ou avidina)
6. Detecção indireta da sonda 
Amplificação do sinal
1 ciclo de amplificação 2 ciclos de amplificação 3 ciclos de amplificação
Anti-avidina
biotinilada
avidina
FITC biotina
Sonda com 1.4 kb
Tipos de sondas
� segmentos – cópia única
� segmentos repetitivos
� segmentos cromossômicos
� cromossomos
� genomas
FISH com DNAr 28S
Sondas de DNA ribossomal 18S+28S
Paratelmatobius sp.
FISH detecta NORs 
e permite reconhecer sítios impregnados por Prata não correspondentes a NORs
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia – UFP
Arachis hypogaea cv. Tatuí
DNAr 5S
DNAr 28S
Engystomops petersi
Sonda Centromérica
Sonda centromérica específica
Comparação entre cariótipos
humano (2n=46), chimpanzé (2n=48),
gorila (2n=48) e orangotango (2n=48)
Telômeros - Centrômeros
Sondas 
subteloméricas
Sistema mecânico de microdissecção
Sistema de microdissecção a laser
Isolamento de um segmento cromossômico
Microdeleção Xp22.3
(5´CCGACTGCAGNNNNNNATGTGG3´)
Isolamento de um segmento cromossômico
Microdeleção Xp22.3
Microdeleção Xp22.3
Microdissecção de um cromossomo inteiro
(5´CCGACTGCAGNNNNNNATGTGG3´)
Cromossomo 4 humano
Sonda cromossômica 
(“chromosome painting”)
Sonda cromossômica 
(“chromosome painting”)
Flow sorting
Flow sorting
Flow sorting
Flow sorting
2
134
56
78
X
10
11
12
9
13
14
1516
17
18
19
20
21
22
Y
• 5 fluorocromos
• 25=32
SKY (Spectral Karyotyping)
X
X 44
(
N
a
t
u
r
e
4
0
9
:
 
8
6
0
-
9
2
1
,
 
2
0
0
1
)
Zoo-FISH
Sondas (crs. de camundongo)
Cariótipo humano hibridado
com sondas cromossômicas de camundongo
Sonda genômica (GISH: genomic in situ hybridization)
DNA da sp. A: vermelho
DNA da sp. B: verde
Híbrido (AAB)
CGH (Comparative Genome Hybridization)
Cot 1 DNA
DNA referência (de mulher): vermelho 
DNA em teste: verde (normal)
DAPI
DNA em teste
DNA de referência
Amplificação 1q
DNA de referência (mulher): vermelho
DNA em teste: verde
Deleção 
CGH - Limite de sensibilidade: 2.000-20.000 kb
Fiber-FISH
limite de resolução de cerca de 10kb
Arroz – Cheng et al. 2004
Fiber-FISH