Citoquímica Enzimática final

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Citoquímica Enzimática
Gabriel Guimarães de Medeiros 04/83184
Karina Bianca Christ 06/54019 
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Citoquímica
Área da biologia celular e estrutural dedicada aos estudos dos métodos de coloração dos tecidos e constituintes celulares ou subcelulares, beneficiando-se dos princípios químicos de reações de coloração para obtenção de preparados a serem avaliados aos microscópios; 
Estudo dos métodos que permitem a identificação e localização, nas células e tecidos, de compostos ou radicais químicos.
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Por meio de reações que formam, com as substâncias ou radicais químicos, produtos insolúveis que são corados ou elétron-densos, por sua vez evidenciados pelos M.O. ou M.E, respectivamente.
Ex.: Reação de Perls:
Ferrocianeto de potássio + ferro iônico (tecidos) = 
precipitado de ferrocianeto férrico (insolúvel, azul forte)
A coleta do material, a fixação e os fixadores usados e os agentes desidratantes influenciam a reação citoquímica.
 
Procedimento
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Princípios básicos
Os compostos a serem analisados não devem ser difusíveis no processamento que antecede a reação;
O produto de reação deverá apresentar uma cor ou que, pelo menos, seja insolúvel;
O método utilizado deve ser específico para a substância ou grupo químico que se está analisando. 
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Principais substâncias de interesse biológico demonstráveis citoquimicamente:
Íons;
Lipídios;
Ácidos nucléicos;
Proteínas;
Polissacarídeos;
Catecolaminas;
Enzimas.
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Citoquímica Enzimática
Métodos baseados na produção de um precipitado fortemente corado ou elétron-denso no local da atividade enzimática;
É visualizado o produto de reação da atividade enzimática e não a própria enzima;
É importante evitar a inativação da enzima pelo fixador e as condições que levam à falsa localização;
É essencial a utilização de controles para análise correta;
Atividade das enzimas averiguada in situ, sendo utilizadas propriedades funcionais da enzima para localizar o sítio da sua atividade.
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Importância
Ajuda a entender a estrutura e atividade das células;
Tem sido uma efetiva ligação entre morfologia e bioquímica;
Tem ajudado a elucidar caminhos para compreensão, processamento e saída de vários produtos celulares;
Associada com organelas específicas pode ser usada com frações subcelulares para determinar sua pureza;
Facilita a determinação da pureza da cultura de células em crescimento e diferenciar na cultura do tecido;
Um tipo celular pode conter uma enzima marcadora que a diferencia de células contaminadas. 
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Procedimento
Deve-se preservar a integridade molecular da enzima, com fixações brandas e/ou cortes por congelamento, ou ainda tratamento em bloco;
Proporcionar um ambiente de incubação (37°) onde coloca-se o fragmento de tecido ou corte histológico a ser estudado juntamente com o substrato da enzima que se quer investigar;
Após a incubação, a atividade da enzima resulta em um precipitado insolúvel de cor conhecida, observado ao microscópio;
O controle do pH é indispensável para o sucesso das reações. 
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Para microscopia eletrônica:
Substrato exógeno produto insolúvel produto elétron-denso
 
 enzima agente p/ visualização
Requisitos:
Preservação da estrutura do tecido e da atividade enzimática;
Maximizar as condições de reação;
Facilitar a penetração do substrato;
Usar controles apropriados;
Visualização do produto de reação;
Agentes de visualização;
Enzimas marcadoras.
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A citoquímica enzimática é usada para detectar:
Desidrogenases;
Peroxidase;
Fosfatase ácida;
ATPase;
Fosfatase alcalina;
Enzimas respiratórias.
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Desidrogenases
Retiram o hidrogênio de um substrato, transferindo-o para outro composto;
Incuba-se, em substrato adequado, cortes de tecido não fixado com um composto químico solúvel e fracamente corado, ex. tetrazol;
Substrato perde hidrogênio para o tetrazol formando um composto fortemente corado e insolúvel, formazana, que precipita-se no local da atividade enzimática;
Utilizado para observar atividade da succinodesidrogenase, ativa no ciclo de Krebs. 
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Preparação de HE de intestino grosso.
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Preparação citoquímica de intestino grosso. Ação da NADH-tetrazol redutase mitocondrial se apresenta em azul.
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Peroxidases
Reduz certos substratos com transferência de íons hidrogênio para o peróxido de hidrogênio, formando moléculas de água;
Incuba-se cortes de tecido fixados em tetracloreto de 3-3’ diaminobenzidina em presença de água oxigenada, que é reduzida, produzindo composto insolúvel, corado e elétron-denso;
Peróxido de hidrogênio + substrato => água + precipitado insolúvel e elétron-denso.
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Fosfatase ácida
Incuba-se cortes de tecidos fixados em formol em solução contendo glicerofosfato de sódio e nitrato de chumbo em tampão pH 5,0;
Ocorre hidrólise do glicerofosfato, liberando íons fosfato que reagem com nitrato de chumbo => fosfato de chumbo insolúvel que precipita no local da atividade enzimática;
Imersão dos cortes em solução de sulfeto de amônio => precipitado incolor fosfato de chumbo: precipitado negro e elétron-denso, sulfeto de chumbo;
Método utilizado para localizar lisossomas. 
Método de Gomori
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Citoquímica Ultra-estrutural
Utilização de técnicas que proporcionem um aumento no contraste dos constituintes celulares para que possam ser visualizados na microscopia eletrônica;
Contraste preto = elétron-denso, contraste branco = elétron-lúcido; 
O material (antes ou depois de seccionado) é tratado com sais de metais pesados (chumbo, cério e ferro) que interagem com os elétrons, possibilitando a formação da imagem;
Obtém-se um produto de reação elétron-denso e não colorido (como na microscopia de luz);
Geralmente marca-se enzimas como fosfatases, desidrogenases, peroxidases, ATPases e glicose-6-fosfatases. 
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Referências bibliográficas
JUNQUEIRA, L.C.U. & CARNEIRO, J. Histologia básica. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan S.A.,1985.
ROSS, M.H. Histologia: texto e atlas. 2. ed. São Paulo: Panamericana, 1993.
http://conganat.sld.cu/autores/trabajos/T073/index.html acesso às 22:00 10/02/2007