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Métodos de estudo de proteínas Níveis de organização – enovelamento Funções desempenhadas por proteínas Doenças causadas por proteínas PeptídeosPeptídeos XXXX ProteínasProteínas Proteínas são polímeros de aminoácidos • Cada unidade é chamada de resíduo • 2 residuos - dipeptideo • 3 residuos - tripeptideo • 12-20 residuos - oligopeptideo • muitos - polipeptideo Peptídeos são polímeros curtos de aminoácidos P e p t í d e o s x • Uma cadeia polipeptídica - proteína monomérica • Mais que uma – proteína multimérica • Homomultímero – um tipo de cadeia • Heteromultímero – 2 ou mais diferentes cadeias • Hemoglobina, por exemplo, é um heterotetrâmero: • duas cadeias alfa e duas cadeias beta Proteínas são longos polímeros de aminoácidos e podem Proteínas são longos polímeros de aminoácidos e podem ser formadas por um ou mais polipeptídeosser formadas por um ou mais polipeptídeos x P r o t e í n a s A arquitetura das proteínas • Os níveis de estrutura protéica - Primária – sequência de aminoácidos - Secundária – estruturas locais – pontes de H - Terciária – conformação tridimensional - Quaternária – organização das subunidades • Forma - globular ou fibrosa • Hélices e folhas são frequentemente empacotadas juntas • As ligações entre elementos da estrutura secundária são usualmente curtos e diretos • Proteinas enovelam (fold) para produzir estruturas mais estáveis (fazendo pontes de H e minimizando o contato com o solvente) •Alguns princípios importantes: ESTRUTURA ESTRUTURA PRIMÁRIAPRIMÁRIA Diagrama de Ramachandran Toda proteína tem uma sequência de aminoácidos e uma conformação tridimensional Estrutura primária Sequência da catrocollastatin-C, uma proteína de 23.6 kDa do veneno de Crotalus atrox � Homologia � Resíduo invariante � Substituições conservativas � Posições Hipervariáveis O número de aminoácidos diferentes entre duas sequências de citocromos c é proporcional à diferença ou distância filogenética entre as espécies das quais estes citocromos foram obtidos; A Filogenia do Citocromo c A Filogenia dos Fatores de Elongação Esta observação em escala maior pode ser usada para construir árvores filogenéticas baseada na homologia entre proteínas; Esta abordagem é a base para os estudos de Evolução MolecularEvolução Molecular. ESTRUTURA ESTRUTURA SECUNDÁRIASECUNDÁRIA Desnaturação Renaturação Dobramento Misfolding PROTEÍNA NATIVA - CONFORMAÇÃO TERMODINAMICAMENTE FAVORÁVEL Estrutura secundária Estruturas secundárias regulares Alfa HéliceAlfa Hélice Folha Beta Estruturas estabilizadas por pontes de hidrogênio Alfa hélice Outras hélices Folha Beta Voltas ou alças (voltas beta ou curvaturas beta ou alças Ω) Saliência Beta ALFA-HÉLICE • Primeiro proposto por Linus Pauling e Robert Corey em 1951 •Identificada na queratina por Max Perutz •Um componente comum de proteínas •Estabilizadas por pontes H •3,6 resíduos por volta em uma alfa hélice padrâo Estrutura do Cabelo – Proteína Fibrosa - Queratinas duras e moles - Sequência alternada: Gly-Ala/Ser-Gly-Ala/Ser.... - fibroína -folha beta Principal componente do tecido conjuntivo (tendões, cartilagens, ossos, dentes) Unidade básica é o tropocolageno: Unidade básica é o tropocolageno: ♣ Três cadeias polipeptidicas (1000 residuos cada) ♣ MM = 285,000 ♣ 300 nm de comprimento, 1.4 nm diâmetro ♣ Composição única de aminoácidos Estrutura secundária ALFA-HÉLICE FOLHAS BETA OU CONFORMAÇÃO BETA CONFORMAÇÃO BETA •Também postuladas por Pauling and Corey, 1951 • Cadeias podem ser paralelas ou antiparalelas • 3.47 Angstroms para antiparalelas • 3.25 Angstroms para paralelas • Cada cadeia de uma folha beta pode ser desenhada como uma alfa hélice com 2 residuos por volta (volta beta, tight turn) • Direciona a cadeia polipeptidica para a direção inversa A volta Beta • Direciona a cadeia polipeptidica para a direção inversa • O oxigênio de um resíduo da carbonila é ligado por pontes de hidrogênio a um hidrogênio do grupo amida de um resíduo distante 3 resíduos do primeiro • Prolina e glicina são prevalentes em beta turns Proteínas Globulares Mioglobina ESTRUTURA ESTRUTURA TERCIÁRIATERCIÁRIA Estrutura Terciária Proteínas globulares: • A maioria dos resíduos polares estão voltados para fora da proteína e interage com o solvente • A maioria dos resíduos hidrofóbicos estão voltados para o interior da proteína e interagem uns com os outros • Os resíduos são firmemente empacotados • Entretanto, espaços vazios existem • Os espaços vazios formam pequenas cavidades • Estruturas não são estáticas • Vários elementos e domínios de proteínas movimentam-se em diferentes graus • Alguns segmentos de proteínas são muito flexíveis e desordenados• Alguns segmentos de proteínas são muito flexíveis e desordenados Motivo helix-loop-helix (alpha-loop- alpha) Motivo beta-volta-beta Hélices, Folhas e Voltas podem ser combinadas de diversas formas Estruturas supersecundárias ou Motivos Motivo helix-volta-helix 4 helices arranjadas em uma topologia do tipo sobe e desce alpha) Motivo beta-alpha-beta Motivos grandes a partir de menoresMotivos grandes a partir de menores DOMÍNIOS • Polipeptídeos grandes normalmente se dobram em um ou mais agregados globulares denominados domínios que domínios que conferem a essas proteínas a aparência bi ou multilobular. • Muitas proteínas são construídas como uma composição de dois ou mais destes “módulos” ou domínios • Cada um desses domínios pode ser encontrado e reconhecido em outras proteínas • As vezes módulos são usados de forma repetitiva na mesma proteína ESTRUTURA ESTRUTURA QUATERNÁRIAQUATERNÁRIA Quais são as vantagens estruturais e funcionais da associação quaternária de proteínas? • Estabilidade: redução da razão superfície- volumevolume • Economia e eficiência genética • Manter os sítios catalíticos juntos • Cooperatividade Estrutura Quaternária Perder a estrutura implica em perda de função Como a sequência de aminoácidos determina a estrutura terciária de uma proteína? Diferentes Proteínas têm Características diferentes Estruturas distintas, funções distintas Possibilidade de enovelamento DETERMINANTES DO DETERMINANTES DO ENOVELAMENTOENOVELAMENTOENOVELAMENTOENOVELAMENTO Cpn10Proteínas hsp previnem que as proteínas recém sintetizadas enovelem incorretamente e/ ou agregem Chaperonas e Chaperoninas sintetizadas enovelem incorretamente e/ ou agregem • Por que as chaperonas são necessárias se a informação para o folding está contida na sequência? – Para proteger as proteínas nascentes de uma matriz concentrada de proteínas na célula e talvez para acelerar alguns passos mais lentos do enovelamento • Chaperonas foram primeiro identificadas como "heat-shock proteins" (hsp60 e hsp70) Tipos: �Família hsp70 – 70 kDa ATPases citóplasmáticas; liga em regiões hidrofóbicas das cadeias polipeptídicas �Chaperonina da família hsp60; GroEL – mitocôndria e cloroplastos; previne a agregação de proteínas parcialmente enoveladas • Insulina – Uma cadeia com 21 residuos, cadeia B com 30 residuos - total massa molecular. de 5,733 • Glutamine sintetase - 12 subunidades de 468 residuos cada - total massa mol. de 600,000 • Conectina - alpha - MW 2.8 milhões! • beta conectina - MW 2.1 milhões, com um comprimento de 1000 nm. Proteínas grandes e pequenas Proteínas são os agentes da função biológica • Enzimas - Ribonuclease • Proteínas regulatórias – Insulina• Proteínas de estoque – Vitelogenina • Proteínas de defesa – Imunoglubulinas • Proteínas de transporte – Hemoglobina • Proteínas estruturais – Colágeno • Proteínas contráteis – Actina, Miosina • Proteínas “exóticas”- anticongelantes em peixes e anfíbios Proteínas são os agentes da função biológica FUNÇÕES DAS FUNÇÕES DAS PROTEÍNASPROTEÍNAS Funções desempenhadas por proteínas Transporte: Hemoglobina Estoque Mioglobina Hemoglobina Contração Muscular: Mecanismos de defesa: Mecanismos de defesa: ANTICORPOS AnomaliasAnomaliasAnomaliasAnomalias g I. Ossos frágeis, perda de audição, com ou sem dentes anormais g II. Perinatal letal com fraturas extensivas, esqueleto não mineralizado g III. Deformidade progressiva com dentiogenese imperfeita e nanismo g IV. Deformidade suave com dentição anormal Causada por anormalidades do colágeno do tipo I. Mais de 200 mutações identificadas. Ossos do braço de um paciente com OI Radiografia do ossos da tíbia de um paciente com OI Hemoglobinopatias: anemia falciforme Hemoglobina difere da hemoglobina normal por um único aminoácido: glutamato na posição 6 é substituído por valina na superfície da cadeia beta. Isto cria um novo ponto hidrofóbico. CJD encefalopatia espongiforme fragmentos de prion APP Alzheimer fragm. de beta protein 1-40/43 HRA hemodialysis-related amyloidosis microglobina beta-2 * PSA primary systmatic amyloidosis cadeia leve de frag. Immunoglob. SAA 1 secondary systmatic amyloidosis fragm. serum amyloid A 78 resid. FAP I familial amyloid polyneuropathy I transthyretin fragm 50+ alleles FAP III familial amyloid polyneuropathy III apolipoproteinA-1 fragments CAA cerebral amyloid angiopathy cistatinaA menos 10 residuos FHSA Finnish hereditary systemic amyloidosis gelsolin 71 aa fragment IAPP type II diabetes islet amyloid polypeptide fragm ILA injection-localized amyloidosis insulin CAL medullary thyroid carcinoma calcitonin fragments ANF atrial amyloidosis atrial natriuretic factor NNSA non-neuropathic systemic amylodosis lysozyme and fragments HRA hereditary renal amyloidosis fibrinogen fragments The 15 congophiliccongophilic diseasesdiseases are reviewed by J.W. Kelly in Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 11-17. 1996) •• O que são?O que são? Inclusões proteicas, altamente insolúveis. •• O que já foi encontrado?O que já foi encontrado? As doenças amilóides são um conjunto de patologias cuja origem parece estar relacionada com a presença de placas amilóides no tecido neural. •• O que já foi encontrado?O que já foi encontrado? Peptídeos pequenos chamados amilóides (beta-amilóide A4 em Alzenheimer) Forma alterada de Proteínas de neurofilamentos (MAP – microtubules associated proteins – especialmente TAU) Ubiquitina Prion – PrPSc (PrPC – PrPSc) Inherited Prion Diseases Creutzfeldt-Jakob Disease (CJD) Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease (GSS) Fatal Familial Insomnia (FFI) Infectious Prion Diseases Kuru Scrapie Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) Ou "Mad Cow Disease" Creutzfeldt-Jakob Disease (CJD) Variant Creutzfeldt-Jakob Disease (vCJD) Estruturas de parte de PrPSc de hamster e camundongo superpostas PrPC - A proteína normal � é chamada PrPC �é uma glicoproteína normalmente encontrada na superfície celular inserida na membrana plasmática � tem sua estrutura secundária dominada por alfa hélices (provavelmente 3 delas) � é facilmente solúvel � é facilmente digerida por proteases � é codificada por um gene designado em humanos de PRNP localizado no nosso cromossomo 20. PrPSc – A proteína anormal � É chamada PrPSc (Sc de scrapie) � tem a mesma seqüência de aminoácidos da proteína normal, ou seja, sua estrutura primária é idêntica. � sua estrutura secundária é dominada pela conformação beta � é insolúvel � é altamente resistente a digestão por proteases � quando PrPSc entra em contato com PrPC, ela converte PrPC em PrPSc� quando PrPSc entra em contato com PrPC, ela converte PrPC em PrPSc (mesmo in vitro). � Estas moléculas ligam umas às outras formando agregados � Ainda não é claro se estes agregados são por si só a causa dos danos celulares ou simplesmente são um efeito colateral do processo que leva à doença. • Embora somente uma pequena porção do prion seja responsável pela sua especificidade, outras partes da molécula são necessárias para fazer a transição de alfa-hélice para a conformação beta. Todos os prions contém um domínio com repetições Gln-Asn que parecem ser essenciais para o processo de conversão. FIM!FIM!
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