Relatório de aula prática - Espectro de absorção e curva padrão

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Espectro de absorção e curva padrão 
Universidade Federal da Fronteira Sul - Campus Erechim 
Engenharia Ambiental – Bacharelado 
GCB110 – Bioquímica 
 
Introdução 
A absorção de luz pela matéria é a forma 
mais comum de determinar a concentração 
de compostos presentes em solução. Essa 
técnica pode determinar a concentração 
da proteína Albumina, por exemplo, em 
uma determinada amostra. A albumina é 
uma proteína considerada de alto valor 
biológico que se encontra na clara do ovo, 
leite e no sangue (plasma) como principal 
proteína. 
Grande parte dos métodos utilizados em 
bioquímica clínica abrange a determinação 
espectrofométrica de compostos corados 
obtidos pela reação entre o composto a ser 
analisado e o reagente, a qual origina um 
produto colorido. Os métodos baseados 
nesse princípio são os colorimétricos, os 
quais são, no geral, específicos e muito 
sensíveis. A vantagem de utilizá-los é que 
esses compostos coloridos absorvem luz 
visível. 
A espectrofotometria – medida de 
absorção ou transmissão de luz – é uma das 
mais valiosas técnicas analíticas as quais são 
amplamente utilizadas em laboratórios de 
área básica ou até em análises clínicas. Por 
meio da espectrofotometria, componentes 
desconhecidos de uma solução podem ser 
identificados por seus espectros 
característicos ao ultravioleta ou 
infravermelho. Quado um feixe de luz 
atravessa uma solução com moléculas 
absorventes, parte dessa luz será absorvida 
pela solução e o restante será transmitido. 
Essa quantia absorvida dependerá de dois 
fatores: a concentração das moléculas 
absorventes e a espessura da solução. 
 
Fig. 1: Absorção de luz.
Quando uma solução de um certo 
composto é submetida a leituras de 
absorbância ao longo de uma faixa de 
comprimentos de onda eletromagnética, 
obtêm-se informações sobre a capacidade do 
compostro em absorver luz. A representação 
gráfica dos valores de comprimento de onda 
versus absorbância é denominada espectro 
de absorção. 
O Espectrofotômetro é um 
aparelho cuja sua função é a de medir e 
comparar a quantidade de luz que é 
absorvida por uma determinada solução, ou 
seja, ele é usado para medir, identificar ou 
determinar a concentração de substâncias, 
que absorvem energia radiante, em 
um solvente. 
 
Fig. 2: Esquema óptico dos principais componentes do espectrofotômetro. As letras representam: 
(a) fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma ou rede de difração, (d) fenda seletora de X, (e) 
compartimento de amostras com cubeta contendo solução, (f) célula fotelétrica, (g) amplificador. 
 
Através dos valores de absorbância e de 
concentração definidos, pode-se traçar um 
gráfico cujo perfil é conhecido como “curva-
padrão”. Nesse gráfico, a reta, indica 
a proporcionalidade entre o aumento da 
concentração e da absorbância. 
Metodologia 
Com o objetivo de determinar o ponto 
máximo de absorção de uma solução 
colorida (espectro de absorção) e estabelecer 
uma curva-padrão, utilizou-se os seguintes 
materiais e reagentes: 
 50 mL de etanol 95% 
 100 mL de ácido orto-fosfórico 85% 
 100 mg (0,1 g) de Comassie – 
Brilhante blue 
 Albumina série bovina (1 mg/mL) 
 Carqueja 
O experimento foi realizado em duplicata, 
utilizando 7 tubos de ensaio com as 
seguintes misturas: 
Tabela 1: Tubos de ensaio. 
Tubos Albumina (𝜇L) Água (𝜇L) Comassie (𝜇L) 
10 10 40 2,5 
25 25 25 2,5 
50 50 - 2,5 
Branco - 50 2,5 
 
Esses tubos foram repousados para reagir 
por aproximadamente 5 minutos e, após isso, 
foi feita a leitura no espectrofotômetro a 595 
nm. Os valores das leituras foram anotados 
e tabelados, e com a média deles foi 
construído o gráfico e sua curva-padrão, no 
qual os valores das absorbâncias encontram-
se no eixo das ordenadas e os valores de 
comprimento de onda, das abscissas. 
Em uma segunda etapa do experimento, 
realizamos o mesmo procedimento porém 
com a utilização da Carqueja, de origem 
vegetal. 
Resultados 
Com a leitura no espectrofotômetro, 
foram obtidos os seguintes valores: 
Tabela 2: Absorbância da Albumina. 
TUBOS 
(𝜇L) 
ABSORBÂNCIA 
(nm) 
10 0,036 
25 0,105 
50 0,357 
 
 
E construído o seguinte gráfico com sua 
curva-padrão: 
Gráfico 1: Relação entre concentração e absorbância de Albumina. 
 
 
O fator de correção é dado, então, por: 
𝐹𝑐 = 
(
0,036
0,01 +
0,105
0,025 +
0,357
0,05 )
3
= 4,98 
 
Com a amostra de Carqueja de 
concentração 50 𝜇L, foi encontrado o valor 
de absorbância igual a 0,540 nm. Com isso, 
calculou-se a concentração de proteína 
encontrada na Carqueja a seguir:
𝐴𝐵𝑆𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑥 𝐹𝑐
0,05
= 
0,540 × 4,98
0,05
= 53,784
 
 
 
 
 
Referências 
[1] MENDES, M. F. A. Espectrofotometria. Disponível em: 
<http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/index.html>. Acesso em: 10 nov. 2015. 
y = 0,0082x - 0,0673
R² = 0,9698
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 10 20 30 40 50 60
A
b
so
rb
ân
ci
a 
(5
9
5
 n
m
)
Concentração da Albumina (µL)