Enzimas em Biotecnologia - Imobilização de Enzimas e sua Estabilização (Cap.06)

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IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS E
SUA ESTABILIZAÇÃO
Heizir Ferreira de Castro, Gisella Maria Zanin,
Flávio Faria de Moraes, Paula Sá-Pereira
SUMÁRIO
As vantagens das enzimas imobilizadas, em relação às solúveis, surgemde suamaior esta-
bilidadee facilidadede separaçãodomeiode reação,oqueacarreta economia significati-
va no custo global do processo, desde que o procedimento de imobilização não sejamui-
todispendioso, haja boa recuperaçãoda atividade enzimática eque ameia-vidaoperacio-
nal da enzima imobilizada seja suficientemente longa. Os métodos de imobilização vari-
amda simples ligaçãopor adsorção física emsuportes diversos até a encapsulaçãoemma-
trizes de sol-gel e granulação. Durante o uso das enzimas imobilizadas, efeitos de transfe-
rência de massa podem ocasionar gradientes adversos de substratos ou de pH, que po-
demreduzir a velocidadede reaçãoeo rendimentoemproduto. Impurezaspresentesno
meio podem ocluir a enzima imobilizada e também reduzir a velocidade de reação e o
rendimento emproduto. Aperdade atividade biocatalítica durante oprocesso de imobi-
lizaçãodeve ser reduzidapara compensaro custo extrada imobilização, o suporteporoso
deve ser apropriadopara facilitar a transferência de reagentes e produtos, e a purificação
exaustivada soluçãode substratodeveocorrerparaobter-seuma longavidaoperacional.
Este capítulo conceitua inicialmente os diversos termos relacionados com a técnica
de imobilização, fornece uma classificação dosmétodos e destaca ainda as vantagens e li-
mitações do uso de enzimas. Na seqüência, apresenta osmétodos de imobilização de en-
zimas, correlacionando-os comos tiposde suportesmais comumenteutilizados.Abordaa
interaçãoenzima-suportecombasenos fatoresque interferemnocomportamentodaen-
zima imobilizada;. discute a aplicação de enzimas imobilizadas em meio orgânico, bem
como, a influência de aditivos como agentes estabilizantes da atividade catalítica da enzi-
ma imobilizada, e, finalmente, enfoca o tema das aplicações das enzimas imobilizadas.
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IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS – UMA PERSPECTIVA HISTÓRICA
A imobilização de enzimas começou a ser estudada no início do século passado, ao se
observar que o carvão ativo, ao qual havia sido adicionada uma preparação biológica
com atividade invertásica, mantinha a capacidade de hidrolisar sacarose mesmo após
ser lavado (NELSONeGRIFFIN, 1916). Após esta observação inicial da imobilizaçãode
enzimas em suportes insolúveis, o assunto só foi novamente retomado após a Segunda
Guerra Mundial. Em 1948, o bioquímico americano James Batcheller Sumner
(1887-1955), ganhador do Prêmio Nobel deQuímica, em 1946, pelo isolamento e cris-
talização da enzima urease e pela identificação da sua natureza protéica, reportou sua
imobilização. Na continuação dos estudos, pesquisadores alemães, em 1954, demons-
traram que polímeros sintéticos, resinas diazotadas de poliaminoestireno, poderiam
ser usados para imobilizar proteínas com atividade biológica. Eles usaram as enzimas
pepsina, diastase, ribonuclease e carboxipeptidase (CHIBATA, 1978).
Outros trabalhos subseqüentes incluírama imobilizaçãoda catalase por ligação iô-
nica emDEAE-celulose, da tripsina, da papaína, da amilase e da ribonuclease emgel de
poliacrilamida, e a demonstração dométodo de ligações cruzadas, utilizando-se carbo-
xipeptidase com glutaraldeído. A microencapsulação da carbono-anidrase foi descrita
em1964 e a preparação de lipossomas contendo glicoamilase em1971, sendo que estas
duas últimas preparações foram usadas com fins terapêuticos. A partir de 1960, houve
um aumento significativo no número de publicações sobre imobilização de enzimas,
tendo emvista as potenciais vantagens econômicas e operacionais que a técnica oferece
para a tecnologia enzimática. Estes esforços resultaram no desenvolvimento, em 1969,
por Chibata e colaboradores da companhia japonesa Tanabe Seiyaku Co., de um pro-
cesso para a produção de L-aminoácidos, a partir demisturas racêmicas, usando L-ami-
noacilase imobilizada em DEAE-Sephadex. Quase simultaneamente foi colocado em
operação, nos EUA, o processo de produção de xaropes de frutose a partir de amido de
milho, utilizando glicose-isomerase imobilizada (CHIBATA, 1978).
Até osmeados da década de 1960, amaior parte dos trabalhos comenzimas imobi-
lizadas era realizadaporpesquisadores de áreas básicas, queperceberamque estes siste-
maspoderiamserutilizados comocatalisadores industriais altamente específicos e efici-
entes. Neste período, passou-se também a buscar suportes comboa resistência química
e mecânica, de modo a prolongar o uso do biocatalisador. Foram estudados métodos
diferentes de imobilização (combinação demétodos), e observou-se que as proprieda-
des catalíticas de umamesma enzima poderiam ser alteradas em função dométodo de
imobilização utilizado e do suporte empregado. E finalmente, tiveram início os estudos
da aplicação de enzimas imobilizadas em biorreatores contínuos (leito fixo e reatores
agitados). Istomarca o inicio da contribuição dos engenheiros químicos para o projeto
de biorreatores (VIETH, 1994).
A importância de processos industriais com enzimas imobilizadas motivou a orga-
nização, em 1971, da primeira Conferência em Engenharia Enzimática, realizada em
Henniker.Nela estabeleceu-se ousodo termoenzima imobilizada, empregadoporKat-
chalski–Katzir, para os biocatalisadores ligados a suportes insolúveis ou confinados a es-
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paços físicos definidos, em contraposição ao uso de enzimas “fixadas” ou “insolubiliza-
das” ou “ligadas emmatrizes”. Em 1985, houve umoutro avanço significativo como de-
senvolvimento emescala industrial de umprocesso emreator demembranapara a pro-
dução de aminoácidos a partir de cetoácidos, com duas enzimas imobilizadas e envol-
vendo a regeneração do co-fator. O processo, que foi desenvolvido por pesquisadores
daWandrey eKula, naAlemanha, foi empregadoemescala industrial naquele país pela
companhia Degussa (HARTMEIER, 1988).
Oadventodas enzimas imobilizadas abriunovos epromissores camposdeatuação.
Comoexemplos, os eletrodos enzimáticos queproporcionamumnúmeromuitomaior
de análises em curtos espaços de tempo, característica esta muito valiosa para amoder-
na industria biotecnológica, e a reutilização da enzima por tempos prolongados de
processo, implicando numa grande redução de custos.
ENZIMAS IMOBILIZADAS
As enzimas têm, intrinsecamente, excelentes propriedades como a atividade, a seletivi-
dade e a especificidade. Estas características permitemodesenhodeprocessos de sínte-
se de produtosmuito complexos emcondições ecossustentadas.Mas apesar do elevado
potencial de aplicação das enzimas, devido à pressão dos consumidores, elas têmde ser
otimizadas, de modo a cumprirem suas funções biológicas com eficácia e eficiência. A
catálise de reações em processos metabólicos complexos pode ser regulada em vários
níveis. E assim, algumas delas passam a ter as características adequadas para serem
integradas em processos industriais.
Enzimas na sua formanativa (enzimas livres) têm sidousadas por séculos na indús-
tria de alimentos e mais recentemente nas indústrias farmacêuticas e químicas. Sua es-
trutura e modo de ação vêm sendo gradativamente elucidados por métodos experi-
mentais bem estabelecidos, como as técnicas clássicas de raios X e avançadas de resso-
nância magnética nuclear (RMN). Modernas metodologias de engenharia genética
possibilitaram a produção de enzimas em grande escala ou amodificação de sua estru-
tura primária, alterando, portanto algumas de suas características físico-químicas e bio-
lógicas (MA et alii, 2003). De igual significância são as recentes técnicas de evolução di-
recionada, que permitem, via modificação do DNA, a preparação de enzimas especial-
mentedirigidasparaumadeterminada finalidade, isto é, enzimasqueatuamemvalores
extremos de pH e temperatura, bem como em presençade meios não convencionais
(solventes orgânicos, fase gasosa, CO2 supercrítico) (POWELL et alii, 2001).
O valor de venda de enzimas para o uso em indústrias de alimentos, detergentes e
especialidades químicas, que perfazia um total de aproximadamente US$ 700milhões
em 1992 (KATCHALSKI-KATZIR e KRAEMER, 2000), aumentou para US$ 2 bilhões
em2004(RAJAN,2004).Deacordocomasprojeções, o crescimentonomercadodeen-
zimas é de aproximadamente 4-5% ao ano, acompanhado pela redução de preço, de-
corrente do grande número de empresas que comercializam enzimas compreçosmais
competitivos (RAJAN, 2004).
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De particular interesse é o aumento do uso de enzimas imobilizadas, fisicamente
confinadas ou localizadas numa certa região do espaço com retenção de sua atividade
catalítica, podendo ser usada repetidamente e continuamente (WINGARD JR., 1972).
Nesta técnica, a enzima fica retida no interior (poros) ou na superfície de ummaterial
que é utilizado como suporte. O complexo enzima–suporte mantém as características
físicas do suporte e, ao mesmo tempo, retém a atividade biológica da enzima na forma
solúvel. O termo “enzima imobilizada” inclui:
1. A modificação das enzimas de forma a torná-las insolúveis em água.
2. A utilização de enzimas na forma solúvel em reatores equipados commembra-
nas de ultrafiltração, que permitemo escoamento dos produtos da reação,mas
retêm a enzima no interior do reator.
3. A restrição damobilidade da enzimapela ligação a outramolécula, que torna o
sistema insolúvel nomeiode reação (ZANINeMORAES, 2004).O sistema imo-
bilizado permite a condução de reações em reatores contínuos, com fácil sepa-
ração de catalisador–produto, e o aumento da produtividade do processo
(massa de substrato/massa de biocatalisador).
Classificação das Enzimas Imobilizadas
Na literatura especializada encontram-se diversas formas de classificação dos biocatali-
sadores imobilizados, todos em concordância com a definição apresentada. Zaborski
(1973, 1976) propôs uma classificação que leva em consideração – o tipo de interação
responsável pela imobilização - , quepode ser conseguidapormeios químicos (com for-
mação de, nomínimo, uma ligação covalente entre os resíduos terminais de uma enzi-
ma e um grupo funcional do suporte, ou entre duas ou mais moléculas de enzima) ou
por meios físicos, que não envolvem ligações químicas, porém somente forças físicas
(adsorção, interações eletrostáticas e outras) como também, a encapsulação oumicro-
encapsulaçãoemmatrizes poliméricas; – anaturezados suportes –quepodemserporo-
sos ou não-porosos, orgânicos ou inorgânicos (VIETH, 1994; ZANIN e MORAES,
2004). Do ponto de vista prático, ométodo de classificação não altera o sistema obtido,
uma vez que as técnicas mais utilizadas para a preparação dos biocatalisadores de
aplicação comercial envolvem uma combinação de métodos básicos.
A classificação dos métodos de imobilização de enzimas, mais aceita na literatura,
foi proposta por Kennedy e Roig (1995), que considera a combinação da natureza da
interação responsável pela imobilização e o tipo de suporte utilizado. Assim:
a) Ligação em suportes – modificação da enzima, por meio de técnicas apropria-
das, para torná-las imóveis nomeio de reação () e cross-linking- ligação cruzada
intermolecular ou reticulação.
b) Enzimas solúveis sem derivatização- enzimas solúveis, utilizadas em reatores
equipados commembranas semipermeáveis de ultrafiltração e fibras ocas que
retêm a enzima no interior do reator.
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c) Enzimas solúveis com derivatização- enzimas cuja mobilidade foi restringida
pela ligação com outra macromolécula, porém permanecendo o complexo
solúvel em água.
Outra forma sugerida na literatura para classificar as enzimas imobilizadas leva em
consideração a necessidade da presença, ou não, de co-fatores para a melhor atuação
da enzima. De ummodo geral, as enzimas que não requerem co-fatores, ou aquelas cu-
jos co-fatores estão ligados comoumgrupoprostético à apoenzima, são fáceis de imobi-
lizar. Por outro lado, o processo de imobilização torna-se complexo, se a coenzimadeve
ser regenerada pela ação de uma segunda enzima, ou nos sistemas multienzimáticos
que requerem a dissociação da coenzima. Portanto, de acordo com a complexidade da
imobilização, pode-se ter os seguintes grupos:
I) Enzima sem co-fator.
II) Enzima com grupo prostético.
III) Enzima com dissociação de coenzima.
IV) Sistema multienzimático com dissociação de coenzima.
De maneira global, pode-se afirmar que os processos de imobilização desenvolvi-
dos e descritos na literatura, até aproximadamente 1980, são todos pertencentes aos
grupos (I) e (II), isto é, de primeira geração. A partir desse período, a ênfasemaior tem
sido para os sistemas de segunda geração, ou seja, sistemas multienzimáticos com
coenzimas e regeneração de co-fatores (HARTMEIER, 1988).
Métodos de imobilização de enzimas
Oobjetivodeste tópico é apresentar, em linhas gerais, uma introdução às principais téc-
nicas disponíveis para a preparação de enzimas imobilizadas. Para mais detalhes, reco-
menda-se a consulta de literatura especializada.
Existem basicamente duas formas de reter uma enzima no interior dos biorreato-
res: a imobilização de enzima no interior de um suporte (encapsulação e retenção por
meio demembranas); e, a imobilização na superfície de um suporte (ligação covalente
e não-covalente). Estes métodos são bem revisados e discutidos na literatura
(MESSING, 1975; MOSBACH, 1976; TREVAN, 1980; ROSEVEAR et alii, 1987;
HARTMEIER, 1988;GEMEINER, 1992; ZANINeMORAES, 2004). Para os váriosméto-
dos disponíveis no que respeita à estabilização de enzimas imobilizadas, duas vertentes
têm de ser consideradas, a estabilidade no armazenamento e a estabilidade operacio-
nal. A estabilidade no armazenamento, ou tempo de meia-vida, refere-se à capacidade
de uma enzimamanter a sua capacidade catalítica durante o período entre a produção
eo seuuso.A estabilidadeoperacional descreve amanutençãoda atividade catalítica da
enzima durante a reação. A estabilidade operacional pode ser ainda avaliada na ausên-
cia ou presença do substrato (LEMOS et alii, 2001; SÁ-PEREIRA et alii, 2003, 2004;
CHANIOTAKIS, 2004).
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Suportes para a imobilização de enzimas
As propriedades das preparações de enzimas imobilizadas são influenciadas pelas pro-
priedades da enzima e do material do suporte (TISCHER e KASCHE, 1999). A intera-
ção entre esses dois componentes proporciona um derivado imobilizado com proprie-
dades químicas, bioquímicas, mecânicas e cinéticas específicas (figura 6.1).
Dentre os vários parâmetros que devem ser considerados os mais importantes são
apresentados na tabela 6.1, os quais incluem pH, temperatura, força iônica, pressão,
agitação, liberação de co-fatores e do substrato coma remoçãodos produtos. Estes fato-
res influem no desempenho do suporte, na conformação da enzima, na velocidade de
transferência demassa e de reação intrínseca, e, portanto, afetamo comportamento da
enzima imobilizada.
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Figura 6.1 Interação entre suporte e enzima.
Desempenho
Consumo de enzima (U/kg de produto)
Produtividade (kg produto/U)
Métodos
de imobilização
Efeitos de
trasferência
de massa
Estabilidade
operacional
Tipo de reação
e Cinética
Propriedades
Mecânicas
Propriedades
Bioquímicas
Propriedades
Bioquímicas
Enzima Suporte
Tabela 6.1 Fatores que influenciam o desempenho de um sistema de enzima imobilizada
Enzima Propriedades Bioquímicas: Massa molecular, grupos funcionais da
superfície protéica, pureza (funções de inativação ou proteção das
impurezas)
Parâmetros Cinéticos: Atividade específica,perfil de pH e temperatura,
parâmetros cinéticos para a ativação e inibição, estabilidade térmica, pH,
solventes, contaminantes e impurezas
Suporte Características Químicas: Composição e base química, grupos
funcionais, estabilidade química, contribuições da superfície do suporte,
tais como: os micro-efeitos (pH, carga da superfície, natureza hidrofóbica e
hidrofílica, efeito redutor e a presença de íons metálicos)
Características Mecânicas: Diâmetro do poro, comportamento de
compressão, tamanho da partícula; área superficial; volume acessível da
matriz, resistência à compactação em operações em altas vazões para
reatores de leito fixo; abrasão para reatores agitados e velocidade de
sedimentação para leitos fluidizados.
Características Morfológicas: Suportes não-porosos (baixa área
superficial), porosos (grande área superficial), estrutura de gel
Enzima Imobilizada Método de Imobilização: Fixação de proteína, eficiência da enzima ativa,
parâmetros cinéticos intrínsecos
Efeitos de transferência de massa: Partição (diferente concentração do
soluto dentro e fora das partículas do catalisador), difusão interna (poros) e
externa
Estabilidade: operacional (expressa em tempo de meia-vida sob
condições operacionais), estabilidade de estocagem
Desempenho: Produtividade (produto formado por unidade de atividade
ou massa de enzima), consumo de enzima (e.g. unidades por kg de
produto)
Fonte: Tischer e Kasche (1999).
De todos os fatores anteriormente citados, comexceçãoda enzima, amaior contri-
buição para o bomdesempenho da enzima imobilizada é dada pelo suporte. Se, de um
lado um suporte criteriosamente selecionado pode aumentar o tempo demeia-vida da
enzima imobilizada, de outro uma escolha errada pode afetar adversamente não só o
tempo de meia-vida, mas o desempenho global do sistema. Na seleção de um suporte
para uma determinada aplicação, devem ser analisadas suas propriedades físicas e quí-
micas, bem como as relativas à possibilidade de regeneração do material.
� Característicasmorfológicas:parapossibilitar a imobilizaçãodequantidades signifi-
cativasdeenzima,o suportedevepossuirumaárea superficial superior a10m2.g-1, o
queequivalea se teraltaporosidadeeporosdepequenodiâmetro.Naturalmente,o
diâmetro dos poros deve permitir o fácil acesso da enzima e do substrato.
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� Características químicas: os suportes devem possuir grupos químicos que po-
demser ativadosoumodificadosdemodoapermitir a ligaçãodaenzimaemcon-
dições que não a desnaturem.
�Natureza hidrofílica: nos critérios de seleção do suporte de imobilização, deve
ser levada emconta a sua afinidadepela água, porque a águadomeio se particio-
na entre a matriz de imobilização, a enzima e o meio de reação, afetando o seu
microambiente. Sãodesejáveis suportes comcaracterísticashidrofílicas demodo
a se obter uma boa difusividade do substrato, alémde permitir a estabilização da
enzima. Suportes hidrofóbicos diminuem a estabilidade e a atividade da enzima
imobilizada por ummecanismo semelhante à desnaturação das enzimas em sol-
ventes orgânicos.
� Insolubilidade: esta característica é essencial, não somente para prevenir a libe-
ração da enzima do suporte, mas principalmente para evitar a contaminação do
produto, pelo suporte dissolvido e pela enzima. Em alguns casos, principalmen-
te quando o produto desejado é um alimento ou um fármaco, há a necessidade
de estabilização da superfície do suporte, demodo a se evitar a liberação de íons
tóxicos ou a formação de particulados finos. Estas situações são encontradas
quando seutilizampósdemetaismagnéticos ou sílicadeporosidade controlada.
Os pós liberam íons tóxicos e, portanto, devem ser recobertos com albumina. A
sílica de porosidade controlada, por sua vez, se dissolve lentamente com o uso
prolongado e o recobrimento da superfície com zircônia é recomendável de
modo a estabilizar a superfície antes da derivatização (MESSING, 1978).
� Estabilização química,mecânica e térmica: já existemvárias estratégias de estabili-
zação enzimática, tais como a interação seletiva não covalente compolieletrólitos,
baseadas em cargas de superfície (entrapment): uso de sais, polieletrólitos ou es-
paços confinados, cujas características físicas e químicas podemser controladas di-
retamentenareaçãodecatálise.Este controlebaseia-seemmúltiplas interações iô-
nicas ou armadilhas físicas e na imobilização covalente de enzimas a outras proteí-
nas ou superfícies sólidas, através de formação de ligações covalentes (intra e in-
ter-enzimáticas), polimerização enzimática, ligação covalente com outras proteí-
nas, imobilização em superfícies sólidas, estabilização da nanoconcavidade enzi-
mática usando a mutagênese dirigida com alterações em locais específicos, au-
mento da lipofilia do centro activo e/ou remoção de grupos reativos.
O suporte deve ser quimicamente resistente nas condições de ativação, durante o
processode imobilização enas condições emque seprocessa a reação.A resistênciame-
cânicadevepermitir ousode filtração, centrifugaçãoeagitação, pois oprocessode imo-
bilização e o uso repetido e contínuo, algumas vezes, requerem o emprego dessas ope-
rações. A estabilidade térmica é outra característica importante. Suportes com grande
coeficiente de expansão podem sofrer distorção ou destruir o sítio ativo da enzima sob
expansão ou contração, quando submetido a variações de temperatura. Estas situações
podem ocorrer quando se utiliza a imobilização em várias temperaturas, ou quando a
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enzima imobilizada é levada da situação de estocagem (normalmente em baixas
temperaturas) diretamente às condições operacionais, ou vice versa.
� Estabilidade ao escoamento: partículas esféricas, rígidas e de tamanho unifor-
me, normalmente, sãomais apropriadas para autilização emreatores contínuos,
por produzirem pequenas variações de pressão e possuírem boas características
de escoamento do fluido intersticial. Uma estrutura rígida de poros (matriz rígi-
da) protege a enzima de situações de escoamento turbulento.
� Resistência ao ataque microbiológico: o suporte deve ser resistente à degrada-
çãopormicrorganismos, demodoaevitar a liberaçãodaenzimapara a solução.
� Regenerabilidade: as leis ambientais sobre a poluição e o esgotamento das reservas
naturais tornaram a regeneração e o reciclo necessidades prementes nos processos
em larga escala.Por isto, tanto a possibilidade de regeneração como a reutilização da
matrizdevemserconsideradasnaavaliaçãoeconômicadosistemacomenzimaimobi-
lizada.Quantoàcomposiçãoquímicaossuportes sãoclassificadosemorgânicos(natu-
raise sintéticos)e inorgânicos(mineraise fabricados).Comoexemplodesuportesor-
gânicosnaturaispodemsercitadosospolissacarídeos (celulose, ágar, quitina, quitosa-
na, amido, entre outros) e as proteínas (colágeno, albumina, gelatina, glúten, seda,
entreoutras).Dentreos sintéticos encontram-seopoliestireno,ospoliacrilatos, ospo-
livinílicos, onailon, entreoutros.Os suportes inorgânicosmineraismaisutilizados são:
areia, bentonita, horneblenda e pedra-pomes. Dentre os fabricados pode-se citar: vi-
dro, cerâmicae sílicadeporosidadecontrolada, aluminossilicatos,óxidode ferro,óxi-
dodeníquel, aços inoxidáveis, entreoutros.Os suportesmais amplamenteestudados
e utilizados são os derivados de polissacarídeos, especialmente os extraídos de algas,
como: agarose, alginato eK-carragenina.A celulose e seusderivados têmboaspropri-
edadesparaa imobilizaçãodeenzimas.Outrosuportequeapresentaboascaracterísti-
cas para a imobilizaçãode enzimas é o carvão ativo, quepode ser obtidopela desidra-
tação e carbonização, seguida de ativação, demateriais comocasca de coco,madeira,
carvão, coque, ossos animais e lignina (MESSING, 1978).
Um suporte que temmerecido a atenção dos pesquisadores é a sílica xerogel obti-
da pela técnica sol-gel,que envolve a hidrólise e condensação de Si(OR)2 em presença
deumtrialcoxissilano (PIERRE, 2004;KANDIMALLAet alii, 2006).Na funcionalização
obtém-se ummaterial do tipo xSiO2.SiO3/2 – (CH2)n-L, onde épossível controlar a den-
sidade do ligante (L) ancorado à superfície da sílica. Essa técnica tem sido utilizada,
principalmente, para a imobilização da enzima lipase por apresentar boa retenção de
atividade (REETZ et alii, 1996; SOARES et alii, 2004, 2005, 2006).
Os suportes inorgânicos sãomais apropriados para uso industrial por apresentarem
elevada resistênciamecânica, boa estabilidade térmica, resistência a solventes orgânicos e
ao ataque por microrganismos. Eles são de fácil regeneração por pirólise e apresentam
boa rigidezdamatriz, sendoestáveis emumaampla faixadepressões, temperaturas epH.
Entretanto, amaioriadas enzimas imobilizadas comercializadas éobtida commatrizesor-
gânicas devido, provavelmente, à variedade de grupos funcionais reativos que podem ser
introduzidos nesses suportes.
CAPÍTULO 6 � IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS E SUA ESTABILIZAÇÃO 131
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Os processos de imobilização demais de uma enzima em ummesmo suporte têm
sedestacadoporque constituemsistemas interessantes para o estudoe compreensãoda
forma como ocorrem as reações nos seres vivos, onde as enzimas agem de forma se-
qüencial. Embora os suportes e as técnicas de imobilização sejam as mesmas emprega-
das nos processos com uma única enzima, são parâmetros importantes nos processos
multienzimáticos: a razãomolar entre as enzimas e entre estas e o suporte, a resistência
difusional no reator e a conversão em produto final (VIETH, 1994).
Na seleção do suporte para a imobilização da enzima, os fatores demaior peso são
as suas propriedades físicas, químicas emecânicas. Idealmenteumsuporte deve ser qui-
micamente inerte, ter grande área superficial (>10m2/g), ter resistênciamecânica ele-
vada e baixo custo de produção. Infelizmente, a combinação destas qualidades nem
sempre é possível e um compromisso deve ser encontrado. Do exposto, pode-se inferir
que não se conhece um suporte ideal e universal para a imobilização de enzimas, e este
talveznunca seja encontrado, devidoàdiversidadedos sistemas enzimáticos. Isto signifi-
ca que é necessário avaliar criteriosamente todos os aspectos envolvidos e, então,
decidir qual é o suporte mais apropriado para a aplicação desejada.
Na otimização de um tipo de suporte para uma aplicação específica é importante
conhecer a natureza catalítica da enzima, e e o tipo de reator que será utilizado.
Imobilização no Interior de um Suporte
Estemétodo está fundamentado na diferença de tamanho entre asmoléculas do catali-
sador e do soluto, e aqui duas aproximações têm sido adotadas: a formação de uma es-
trutura porosa na presença da enzima, envolvendo-a emuma estrutura tridimensional,
ou a retenção do biocatalisador por umamembrana porosa. Em ambos os casos a enzi-
ma temsuamobilidademantida, pois não sãoenvolvidas ligações físicas ouquímicas en-
tre a enzima e o suporte. Conseqüentemente, somente substratos de baixo peso mole-
cularpodemser empregados comeste tipodeenzima imobilizada. Estemétodo inclui a
encapsulação em gel e em fibras e a microencapsulação, como mostrado na figura 6.2
(ROSEVEAR et alii, 1987).
O método de encapsulação em gel envolve a retenção da enzima no interior de
uma matriz polimérica insolúvel no meio de reação. A maior parte dos métodos base-
ia-se namistura do biocatalisador comum fluido precursor do gel e subseqüente gelifi-
cação por polimerização ou precipitação, ficando a enzima distribuída no interior da
matriz. As matrizes preferidas são normalmente as do tipo hidrogel, que podem ser
obtidas nas mais variadas formas.
A preparação de enzimas imobilizadas no interior de fibras pode ser realizada pela
dissoluçãodeumpolímero, comoo acetato de celulose, emumsolvente orgânico imiscí-
vel emágua seguida da emulfisicação da solução formada coma solução aquosa que con-
tém a enzima. Em seguida estruda-se a emulsão em um líquido coagulante (tolueno ou
éter de petróleo) que precipita o polímero na forma de filamentos. No interior do polí-
mero são retidas as microgotas contendo a enzima (FERNANDES e CABRAL, 2006).
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO132
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As principais vantagens da encapsulação de enzimas incluem a grande área super-
ficial para contato entre o substrato e a enzimano interior de umvolume relativamente
pequeno, e a possibilidade de imobilização simultânea de diferentes enzimas em uma
única etapa. Como principais desvantagens, têm-se:
a) A restrição de que os biocatalisadores somente podem ser utilizados com subs-
tratos de baixo peso molecular.
b) A possível inativação da enzima durante o procedimento de imobilização.
c) A alta concentração de enzima necessária para garantir a encapsulação.
d) Os possíveis efeitos de inibição por produtos ou substrato no interior da matriz
porosa. O laboratório de investigação japonês Toyota Center R&D Labs desen-
volveu uma nova estratégia de estabilização de enzimas, com aplicação na indús-
tria de automóveis, por imobilização em suportes com mesoporos, o FSM-16
(Folded SheetMesoporousMaterial), que apresenta resultados surpreendentes.
CAPÍTULO 6 � IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS E SUA ESTABILIZAÇÃO 133
1ª prova
Figura 6.2 Classificação dos métodos de imobilização.
em gel em fibras microencapsulação
Encapsulamento
adsorção ligação iônica quelação ligação covalente
ligação simples reticulação
Ligação
Enzimas insolúveis
sem derivação com derivação
Enzimas solúveis
Aatividade enzimática e a termoestabilidade emsolventes orgânicos foi significa-
tivamente aumentadaporque oporodoFSM-16 corresponde ao tamanhomole-
cular da enzima (LI e TAKAHASHI, 2000; TAKAHASHI e MIYZAKI, 2000).
Imobilização sobre um Suporte
A enzima pode ser permanentemente fixada na superfície de um suporte por meio de
interações como a adsorção física, a ligação iônica, as ligações covalentes e a ligação a
ummetal (quelação), comomostrado na figura 6.2. Ométodo de imobilização por ad-
sorção físicaéa técnicamais antigadeproduçãodeenzimas imobilizadas, assimcomo, a
mais simples. Consiste em se colocar emcontato a soluçãoda enzima emágua como su-
porte (superfície adsorvente), emdeterminadas condições de pH, temperatura e agita-
ção. Após a imobilização o suporte é lavadopara remoçãodasmoléculas de enzimaque
não foram adsorvidas (MESSING, 1978).
Oprincípio envolvidonesse tipodemétodoéaatraçãodaenzimapela superfíciedo
suporte pormeio das forças de Van derWaals, que são fracas, o que permite a desadsor-
çãodaenzimadurante autilização. Paraminimizar esteproblemaé recomendável lavar a
enzima imobilizada com solução de substrato nasmesmas condições de pHe temperatu-
ra empregadosnomeiode reação.Oprocessode adsorçãonãoéespecífico e algumas ve-
zes pode provocar a inativação parcial ou total da enzima. Neste caso, somente suportes
com alta afinidade pela enzima podem causar a menor desnaturação da enzima.
Os suportesmais utilizados são: alumina, carvão ativo, argila, colágeno, vidro, terra
diatomácea e hidroxiapatita (MESSING, 1978).
Ométodo de imobilização por ligação iônica baseia-se na atração da enzima pelo
suporte sólidoque contém íons residuais. Aprincipal diferença entre a adsorção física e
a ligação iônica é a energia da ligação envolvida entre a enzima e o suporte, as intera-
ções íon–íon sãomais fortes do que as forças de Van derWaals, porémmais fraca que a
ligação covalente (FERNANDES e CABRAL, 2006). A preparação do derivado imobili-
zado é feita da mesma forma que no processo de adsorção física, isto é, coloca-se em
contato a solução enzimática com o suporte. Também, neste caso, pode ocorrer a libe-
raçãodaenzimapelo suporte, oque contaminaoproduto final e reduz a atividadeespe-
cífica dobiocatalisador.Dadoo caráter iônicoda ligação e as condições amenas de imo-bilização, ocorre poucamudança conformacional na enzima, o que conduz à obtenção
de derivados imobilizados com altas atividades enzimáticas.
Enzimas imobilizadas ativas podem ser obtidas utilizando-se a técnica da ativação
da superfíciedo suporte commetais de transição (ligação commetais ouquelação), for-
mando ao final, umquelato entre a enzima e a superfície ativa do suporte.Os principais
sais de metais utilizados para o processo de ativação são: TiCl3, TiCl4, Ti2(SO4)3, FeCl3,
FeCl2, FeSO4, ZnCl4, SnCl2, SnCl4 e VCl3 (Zanin eMoraes, 2004). Esta técnica tem sido
utilizada para ativar tantomateriais orgânicos (papel de filtro, quitina, quitosana, ácido
algínico), e inorgânicos (Celite, vidro, sílica de porosidade controlada, horneblenda, lã
de vidro e alumina, entre outros). Embora a preparação de enzimas imobilizadas por
estemétodo seja bastante simples, estandoenvolvidas somenteduas etapas (ativaçãodo
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO134
1ª prova
suporte e imobilização da enzima), a estabilidade operacional obtida, quando se traba-
lha com substratos de altamassamolecular, é baixa, devido aosmetais envolvidos. Tam-
bém foram observados casos em que houve dessorção da enzima, que resulta da fraca
interação entre a enzima e o metal (suporte ativado). Por este motivo alguns autores
consideram este método como de quelação (ligação covalente parcial) e outros, como
de adsorção.Osmétodos de adsorção, ligação iônica e ligaçãometálica são de fácil apli-
cação, entretanto eles não sãomuito utilizados em processos em grande escala, devido
às forças de ligação fracas, o que possibilita a perda da enzima do suporte.Ométodo da
ligação covalente baseia-se na formação de uma ligação forte entre a enzima e o supor-
te. Este método de imobilização é o mais difundido e o mais estudado. A seleção das
condições de imobilização é mais difícil do que nos outros métodos. O método é,
freqüentemente, mais complexo e utiliza condições menos brandas do que os demais.
Como a ligação formada é forte, a enzima imobilizada obtida por estemétodo é estável,
isto é, não se solta do suporte em presença do substrato ou de soluções de alta
concentração iônica.
A ativação do grupo ligante é freqüentemente realizada no suporte a fim de redu-
zir o risco de diminuição da atividade catalítica da enzima. As reações de ativação do su-
porte podem ser por: diazotização, formação de ligação amida, alquilação e arilação,
formação de base de Schiff, reação de Ugi, reações de amidinação, troca do dissulfe-
to-tiol, interações enzima-mercúrio e ligação induzida por radiação (KENNEDY e
WHITE, 1985; HARTMEIER, 1988; FERNANDES e CABRAL, 2006).
Osmateriais inorgânicosmais comumenteutilizadosna imobilizaçãode enzimas são:
cerâmica, vidro, sílica emetais.Muitosmétodos de ligação covalente de enzimas em supor-
tes inorgânicos envolvem a utilização de derivados de silano contendo umgrupo orgânico
funcional (método de silanização). Às vezes, os suportes silanizados podem reagir direta-
mente com as enzimas, mas na maior parte dos casos, estes grupos funcionais devem ser
modificados para produzir intermediários reativos. O reagente mais utilizado é o glutaral-
deído, devido à simplicidadedométodoeobtençãodepreparações enzimáticas ativas e es-
táveis (WEETALL,1975,1976;ZANINeMORAES,2004;FERNANDESeCABRAL,2006).
Para conseguir preparações com alta atividade, algumas vezes, são utilizadas técni-
cas que procuramevitara inativação dos resíduos de aminoácidos do centro ativo da en-
zima.Dentre estas se pode citar: a ligação covalente da enzimana presença de um inibi-
dor competitivo ou do substrato, a ligação reversível de um complexo enzima-inibidor,
amodificaçãoquímica deumaenzima solúvel, induzindo a ligação como suporte pelos
novos grupos introduzidos, e a ligação multipontual da enzima ao suporte.
Os suportes orgânicos não necessitam da etapa de silanização, uma vez que dis-
põem de grupos funcionais capazes de promover a ligação enzima-suporte. Porém, as
enzimas imobilizadas sãomais ativas e estáveis quando se introduzumespaçadorentre a
enzima e o suporte. Como espaçador pode-se empregar a hexametilenodiamina
(HEMDA), que tem a função de aumentar a mobilidade da enzima.
Amiloglicosidase, lipase e ciclodextrina-glicosil-transferase, dentre outras enzi-
mas, têm sido imobilizadas em quitina e quitosana, obtendo-se boa recuperação de ati-
CAPÍTULO 6 � IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS E SUA ESTABILIZAÇÃO 135
1ª prova
vidade em relação à enzima solúvel (BON et alii, 1984; ZANIN et alii, 1998; PEREIRA et
alii, 2001; SOBRAL et alii, 2003a,b; GOMES et alii, 2004).
Uma enzima insolúvel pode ser obtida pela formação de ligações cruzadas inter-
moleculares (reticulação ou cross-linking) entre moléculas da enzima sem a presença
de um suporte sólido. Sempre quepossível, deve-se escolher umreagente quepromova
a ligação entre grupos não envolvidos na catálise e que esteja emconcentração suficien-
te para a completa imobilização com retenção da atividade. O glutaraldeído tem sido o
reagente bifuncional mais amplamente utilizado (FERNANDES e CABRAL, 2006).
Emalgumas situações, quando sedesejaobter enzimas imobilizadas commaior ati-
vidade, ou aumentar a resistência mecânica dos suportes, é recomendável a utilização
de uma combinação demétodos para a imobilização de enzimas. Por exemplo, pode-se
melhorar a estabilidade da enzima imobilizada por adsorção promovendo-se uma
ligação cruzada entre as moléculas da enzima com o glutaraldeído.
Imobilização Multipontual
A imobilizaçãomultipontual de uma enzima consiste na formação de várias ligações cova-
lentesentreumamoléculadeenzimaeváriosgruposativosdosuporte.Para seobterderiva-
doestávelpela técnicade imobilizaçãomultipontual, deve-se selecionarumsuportemorfo-
logicamente apropriado. Suportes porosos, cuja estrutura interna temgrande área superfi-
cial, comopor exemplo, sílica, alumina e géis de agarose, promovem congruência geomé-
trica entre a enzima e o suporte, aumentando a rigidez de uma pequena parte da área su-
perficial da enzima (10 a 20%), que é transladada para toda a estrutura terciária, devido às
fortes interações entre todas as partes da molécula de proteína (GUISÁN et alii, 1991).
A ligaçãodaenzimaao suportedá-se entre grupos aminodaenzimaegrupos aldeí-
do alifáticos pequenos do suporte. Géis glioxil-agarose (Ag-O-CH2-CHO) possibilitam
multiinteração enzima-suporte intensa, semdistorção da estrutura da enzima, devido à
ausência de impedimentos estéricos para a reação química amina-aldeído, estabilidade
dos grupos aldeídos e reversibilidade de cada ligação unipontual amina-aldeído.
Comouso do sistema insolubilização-estabilização de enzimas proposto porGuisán
(1988) e controle das variáveis que definem a intensidade das multiinterações enzima
(amino) suporte (aldeído), a saber, a densidade superficial dos grupos aldeídonogel ati-
vado, o tempode contato enzima insolubilizada-suporte ativado, a temperatura e o pH, é
possívelprepararderivadosmais ativosemais estáveis com,porexemplo,penicilinaG-aci-
lase (BLANCOeGUISÁN, 1989), quimotripsina (GUISÁN et alii, 1991), esterase termo-
fílica (FERNADEZ-LAFUENTE et alii, 1995), carboxipeptidase A (PEDROCHE et alii,
2002), alcalase (TARDIOLI et alii, 2003b) e lipase (PALOMO et alii, 2005).
A tabela 6.2mostra a atividade recuperada e o fator de estabilidade de diversas en-
zimas imobilizadas em gel glioxil-agarose (MATEO et alii, 2005). A atividade recupera-
da variou de 60 a 100%e a estabilização, de acordo como tempodemeia vida do bioca-
talisador, emmuitos casos foi 1.000 a 10.000 vezes mais alta do que a conseguida para a
enzima imobilizada unipontualmente.
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO136
1ª prova
Tabela 6.2 Atividade recuperada e fator de estabilidade para diversas enzimas imobilizadas
multipontualmente em glioxil-agarose
Enzima Atividade Recuperada (%) Fator de EstabilidadeTripsina 75 10.000a
Quimotripsina 70 60.000a
Penicilina G acilase (E. coli) 70 8.000a
Lipase (C. rugosa) 50 150a
Lipase (B. thermocatenulatus) 75 500a
Esterase (B. stearothermophilus) 70 1000a
Termolisina (B. thermoproteolyticus) 100 100a
Glutamato racemase 70 1000a
Alcalase 54 500
Uroquinase 80 10
a: comparada com enzimas imobilizadas unipontualmente.
Fonte: Mateo et alii (2005).
Imobilização pela tecnologia de granulação
Umnovométodo, já patenteado, de imobilização baseia-se na interação entre a enzima
eum ligador líquidoque são vaporizadospor atomização sobreumsuportede sílica, cu-
jas partículas têm diâmetros inferiores a 100 �m – omesmo que um grão de areia. Du-
rante a granulação, as partículas de sílica aglomeram-se e transformam-se empartículas
porosas de maiores dimensões, com a enzima distribuída uniformemente sobre toda a
área da superfície da sílica. O diâmetro médio das partículas é de cerca de 600 �m e a
área da superfície é de cerca de 50m2 por grama. Isto cria uma grande área de contato
entre o substrato e a enzima. Muito embora os granulados de sílica sejam porosos, eles
são mecanicamente estáveis (NOVOZYMES, 2002).
Imobilização de Enzimas em Meio Orgânico e na Presença de
Aditivos
As moléculas de água, que estão ao redor da enzima emmeio aquoso, têm papel im-
portante na estabilidade protéica devido, principalmente, às interações hidrofóbicas,
alémdas forças de van derWaals, pontes salinas e pontes de hidrogênio. Desta forma,
pequenas variações nomeio reacional, tais como: temperatura, pH, força iônica entre
outras, podem induzir modificações estruturais na enzima desativando-a (YAMANE
et alii, 1990). Esta desnaturação decorre da exposição da parte hidrofóbica da enzima
à água, o que promove um aumento do nível de hidratação da enzima. Assim, não é
surpresa que amanipulaçãodanatureza domeio edaquantidadede água ao redor da
enzima tenha umprofundo efeito sobre a estabilidade. A remoção da água da superfí-
cie da enzima conduz à reorganização das moléculas de água, devido ao aumento do
CAPÍTULO 6 � IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS E SUA ESTABILIZAÇÃO 137
1ª prova
númerode ligações hidrogênio intramoleculares, o que contribui para a estabilização
e o aumento da rigidez da enzima. Este efeito pode ser alcançado pelo uso de aditivos
hidrofílicos, como os polióis e polissacarídeos, comomostra na figura 6.3 a e b. Esses
aditivos agem como reguladores da estrutura da enzima em meio aquoso (YAMANE
et alii, 1990).
As principais desvantagens, associadas ao uso de solventes orgânicos como meios
de bioconversão, são o aumento das limitações difusionais à transferência de massa de
substratos e produtos, uma vez que se introduz mais uma fase (orgânica) além da fase
aquosa (e deuma fase sólida se a enzima estiver imobilizada), e a toxicidadedo solvente
orgânico para a enzima.
Por outro lado, quando a água é substituída porumsolvente orgânico, alterações
na conformação nativa da enzima podem ocorrer, tanto na estrutura terciária como
nas mais proeminentes estruturas secundárias (�-hélice e a conformação �), acarre-
tando, destamaneira, a suadesestabilização. Comoobjetivo de assegurar uma confor-
mação enzimática cataliticamente ativa emmeioorgânico, amolécula de enzimadeve
ter uma camada de hidratação definida (FABER, 1997), que reduz o contato do sol-
vente coma superfície da proteína e contribui para o aumento de sua flexibilidade in-
terna.
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO138
1ª prova
Figura 6.3a Desnaturação da enzima em solução aquosa. (b) Efeito de polióis na estabilização das
enzimas.
Água
Enzima
Polióis
Enzima Enzima
Água
a)
b)
Outramaneira deproteger a configuraçãonativa da enzima é a insolubilização em
suportes sólidos (MATTIASON e ADLERCREUTZ, 1991). Uma grande variedade de
materiais naturais e sintéticos, orgânicos ou inorgânicos, comdiferentes tamanhos, for-
mas e densidades, foram estudados para a imobilização de enzimas para uso em solven-
tes orgânicos (BALCÃO et alii, 1996; VILLENEUVE et alii, 2000). No caso particular da
enzima lipase, estudos comparativos mostram diferenças acentuadas no desempenho
da mesma fonte de lipase imobilizada em diferentes suportes (tabela 6.3) e evidencia-
ramque, apesar das várias experiências reportadas na literatura, a imobilização de lipa-
ses ainda é um desafio complexo, uma vez que a extensão da imobilização depende da
estrutura da enzima, dométodo de imobilização e do tipo de suporte (RESLOW et alii,
1988; BALCÃO et alii, 1996; VILLENEUVE et alii, 2000). Emmuitos casos, suportes que
proporcionam uma elevada atividade e estabilidade da enzima mostram sérias limita-
ções de resistência mecânica e à pressão, que os tornam inviáveis para a utilização em
alguns tipos de biorreatores (ISON et alii, 1994).
Tabela 6.3 Propriedades catalíticas da lipase microbiana de Candida rugosa imobilizada em
diferentes suportes
Característica STY-DVB Quitosana Quitina SPC Celulignina Sílica xerogel
Método de
imobilização
Adsorção Ligação covalente Encapsulação
Rendimento de
imobilização (%)
42 17 26 18 64 32
Atividade da
enzima (U/mg)
110 51 60 51 193 129
pH ótimo 7,5 6,0 7,5 7,5 8,0 7,5
Temperatura
ótima (�C)
50 45 45 50 40 55
Inativação
térmica a 50�C
(h-1)
Nd 0,63 1,07 0,26 0,79 0,19
Estabilidade
operacional
Hidrólise
(t1/2 a 37�C, h)
nd 5,0 3,3 21 3,5 65
Esterificação
(t1/2 a 37�C, h)
620 83 426 32 302 135
Referência Oliveira et
alii, 2000
Pereira et
alii, 2001
Gomes et
alii, 2004
Soares et
alii, 1999
Gomes et
alii, 2005,
2006
Soares et alii,
2004, 2005,
2006
STY-DVB: copolímero de estireno-divinilbenzeno; SPC: sílica de porosidade controlada; nd: não determinado.
Sílica xerogel obtida pela técnica sol-gel empregando tetraetil ortosilicato (TEOS) como precursor.
CAPÍTULO 6 � IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS E SUA ESTABILIZAÇÃO 139
1ª prova
O aumento da estabilidade é observado em algumas preparações de lipases quan-
do imobilizadas, possivelmente devido à capacidade do suporte em reter a quantidade
correta de água paramanter ativa a enzima sem aumentar a flexibilidade que proporci-
ona a desnaturação. Gray et alii (1990) estudaram a imobilização da lipase de Candida
rugosa emvários suportes e encontraramatividades, emmuitos casos,muito superiores
as observadas na enzima livre. A atividade da lipase imobilizada especialmente em su-
portes hidrofóbicos, como o polietileno, foi superior à da enzima livre. Isto foi explica-
do pelo efeito de orientação promovido pela estrutura do suporte, que provavelmente
forneceu à enzima uma melhor exposição ao substrato (BALCÃO et alii, 1996).
Dentre os métodos de imobilização, a adsorção física é talvez o procedimento de
imobilização mais simples e de menor custo. A especificidade do substrato permanece
inalterada, existindo ainda a possibilidade de regeneração do suporte. A adsorção da li-
pasepode ser efetuada emmeio aquosooupor imersãodo suporte emácidos graxos ou
óleo antes de sua exposição à solução da enzima livre. Geralmente adotam-se procedi-
mentos experimentais semelhantes na adsorção física da lipase em suportes hidrofóbi-
cos ouhidrofílicos. Pequenas variações incluema suspensão do suporte na formade pó
emumamistura água/álcool desgaseificada, lavagemcomágua e tampãoemumacolu-
na empacotada e finalmente percolação da solução de lipase através de uma coluna
(BALCÃO et alii, 1996).
No procedimento de ligação cruzada, as moléculas de lipase são quimicamente liga-
das umas às outras, pormeio de vários reagentes bifuncionais. Umprocedimento comum
consiste de uma etapa preliminar que envolve a imobilização da enzima emuma resina de
troca iônica (DowexouAmberlite), para obter alta “carga” da enzima, seguidaporumaou
mais etapas, nas quais formam-se as ligações covalentes. Essas etapas incluem o contato da
resina pré-tratada com glutaraldeído,dissolvido em um tampão adequado, para formar
umabasedeSchiff (produtoda reação comosgrupos amino), seguidodo tratamento com
uma soluçãode sulfito dehidrogêniopara reduzir o excesso de glutaraldeído edabase, ou
alternativamente, seguidopela lavagemcomumasoluçãode fosfato tamponada.A imobili-
zação de lipase em Amberlite foi obtida pela formação de ligações cruzadas dessas resinas
adsorvidas pela enzima com (HEMDA) e glutaraldeído (VILLENEUVE et alii, 2000).
Embora seja extensa a literatura referente à imobilização de lipases, são poucos os
dados relativos à estabilidade operacional desses derivados. Isto pode estar associado à
baixa estabilidade operacional das lipases imobilizadas, que atinge, em alguns traba-
lhos, cerca de 50 a 70% de redução em menos de cinco bateladas consecutivas
(BALCÃO et alii, 1996).
Para superar essas limitações, diversas tentativas têm sido descritas na literatura.
Controle das condições em que se efetua a imobilização, por exemplo, na presença de
aditivos, solventes orgânicos ou substrato, podem geralmente conduzir a preparações
mais estáveis (VILLENEUVE et alii, 2000).
Segundo Rocha et alii (1998), existem diversas formas de aumentar a atividade li-
política do sistema imobilizado, inclusive ousode aditivo. Amaiorparte dos estudos en-
volve a imobilização simultâneado aditivo emprocessode adsorção simples (ouporpo-
cesso parcialmentemodificadopor precipitação da enzima, por evaporação da água ou
por liofilização). Alguns efeitos são atribuídos a esta nova técnica:
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO140
1ª prova
a) Proteção da inativação da enzimadurante a etapa de imobilização (WEHTJE et
alii, 1993; TRIANTAFYLLOU et alii, 1995).
b) Retençãodacamadadeáguaao redordobiocatalisador (TRIANTAFYLLOUet
alii, 1995).
c) Efeitos dispersantes das moléculas da enzima e facilitadores de transporte de
massa, quando aditivos são usados como matrizes de imobilização. Às vezes, o
papel destes aditivos (proteínas, sacarídeos, polióis e sais) pode ser desempe-
nhadopelas impurezas inativas incluídasna soluçãoenzimáticabruta.Oaditivo
pode estar presente ou ausente nomeio durante a reação.O contato do aditivo
com o suporte e com a enzima pode apresentar comportamento antagônico,
isto é, a interação do sistema (aditivo+suporte+enzima) pode ser suficiente, ou
tambémpode apresentar efeito negativo na reação de síntese ou resistência na
transferência de massa. A influência do aditivo na atividade enzimática ainda
não é totalmente compreendida (ROCHA et alii, 1998).
A seleção do aditivo adequadoé funçãodo tipode enzimaedométodode imobiliza-
ção utilizado.No caso específico das lipases, que exigemuma interface água-solvente, para
sua total atividade catalítica, o uso de aditivosmacromolecularesmostra efeitos estabilizan-
tes significativosnaatividadedaenzima,pormeiodorevestimentoda interface, impedindo
desta forma, alterações da estrutura protéica. Segundo Bosley (1991), caseína, gelatina, al-
bumina de ovo e albumina bovina são aditivos eficientes para a imobilização de lipases em
vários suportes. Resultados semelhantes foramdescritos porReetzet alii (1996). É também
recomendadoousodeoutros tipos de aditivosmacromoleculares, comopor exemplo, po-
lietilenoglicol (PEG)epolivinilálcool (PVA). Emambos os artigos, o usode aditivos de bai-
xa massa molecular (sorbitol, glicerol e triglicerídeos) foi descartado.
Outro parâmetro que interfere na eficiência de umdeterminado aditivo é sua for-
ma de adição no procedimento de imobilização, isto é, emque etapa esta adição émais
indicada e qual a quantidade de aditivo necessária para promover um grau satisfatório
de estabilização.
Com relação ao primeiro fator, o estudo detalhado realizado por Wehje et alii
(1993) sugere que a adição de aditivos deve ser efetuada antes da adição da enzima ou
simultaneamente com a enzima. A adição de aditivos após a imobilização da enzima no
suportenãomostrounenhumefeitobenéfico.Quanto àquantidadede aditivo, os auto-
res também recomendam uma avaliação experimental em função do tipo de aditivo
usado, tendo em vista, que o efeito do aditivo depende do seu tamanhomolecular. Esse
fato é exemplificadona tabela 6.4 que reúnedados de atividadehidrolítica e de recupe-
ração da lipase deCandida rugosa, após imobilização em sílica de porosidade controla-
da, na ausência e presença de diversos agentes estabilizantes.
CAPÍTULO 6 � IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS E SUA ESTABILIZAÇÃO 141
1ª prova
Tabela 6.4 Rendimento de imobilização da lipase de Candida rugosa em sílica de porosidade
controlada na presença de diferentes aditivos
Aditivo Atividade lipolítica
U/mg
Recuperação de enzima (%)
Controle 58 19
Lecitina 50 17
Albumina 78 26
Ciclodextrina 36 12
Polietilenoglicol (MM 10000) 42 14
Polietilenoglicol (MM 1500) 104 35
Fonte: Soares et alii, 2001.
Ressaltamos que há extensa literatura disponível para o aprofundamento do estu-
dodousodeenzimas emmeiosorgânicos, assimcomo sobre a imobilizaçãonapresença
ou ausência de aditivos (REETZ et alii, 1996; GONÇALVES et alii, 1999; PEREIRA et
alii, 2001; SOARES et alii, 2001, 2003).
VANTAGENS E LIMITAÇÕES DA IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS
A imobilizaçãodaenzima temumefeitobenéficona suaestabilidade, emfunçãodas inte-
rações físicas e químicas entre o suporte e as moléculas da enzima. A imobilização, tam-
bémauxilia adispersãohomogêneadaenzimanomeio, essencial, paraa conduçãode re-
ações enzimáticas (DE CASTRO e ANDERSON, 1995; VILLENEUVE et alii, 2000).
Doponto de vista comercial, as principais vantagens da utilização de enzimas imobi-
lizadas, em relação às enzimas solúveis são, praticamente, as relativas à catálise heterogê-
nea. São vantagens:
a) Aproveitar a atividade catalíticaporummaiorperíodode tempo,umavezque a
enzima não deve ser desnaturada ao final do processo em batelada.
b) Operarde formacontínuapossibilita omelhor controledas variáveis doproces-
so, pois o biocatalisador é retido no interior do biorreator e o substrato passa
pelo leito catalítico em escoamento contínuo, ou, então, transfere-se o biocata-
lisador para novas bateladas que contêm uma solução de substrato novo
(processo em bateladas repetidas).
c) Facilitar a separação do catalisador e do produto da reação, já que a enzima
imobilizada, não é solúvel nomeiode reação, é retida no interior do biorreator,
e o substrato não convertido e o produto são retirados sem contaminação do
biocatalisador.
d) Reduzir o volume de reação, porque a enzima imobilizada e retida no biorrea-
tor permite alta concentração enzimática em menor volume de reator, isto é,
alta atividade por unidade de volume,muito superior a que se seria obtida com
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO142
1ª prova
a enzima livre. Isto conduz a uma alta produtividade volumétrica (kg) por volu-
me de reator (m3) e por hora. Além disto, como o substrato e produto são ex-
postos a condições de reaçãomais brandas porummenor tempode reação, im-
pede-se a ocorrência de reações indesejáveis e a contaminação do meio de
reação.
e) Alterar, emalguns casos, as propriedades catalíticas da enzima em relação a sua
forma solúvel, como por exemplo, conferir-lhe maior estabilidade ao pH e à
temperatura, reduzir os efeitos de inibição pelo substrato e produto que são
removidos continuamente do biorreator.
f) Facilitar a interrupçãodareação,quandoseatingeumdeterminadograudecon-
versão,pela remoçãodobiocatalisador, se aoperaçãoestá sendorealizadaemba-
telada, ou pelo ajuste do tempo de residência, se é utilizado um reator contínuo
(MESSING, 1975; ROSEVEAR et alii, 1987; HARTMEIER, 1988; TISCHER e
WEDEKIND, 1999).
O sucesso da tecnologia de imobilizaçãomostra que, de modo geral, as vantagens
superamas limitações. Porém, alguns fatores devemser apontados, não comodesvanta-
gens do processo, mas sim como pontos a serem evitados. Dentre estes fatores podem
ser citados(ROSEVEAR et alii, 1987):
Perda da atividade durante o processo de imobilização
A estabilidade termodinâmica e cinética das enzimas e as diferenças nas sequências de
aminoácidos e respectivas estruturas tridimensionais, entre as enzimas intrinsecamente
termoestáveis e as termolábeis, justificam a sua performance e o seu elevadíssimo inte-
resse industrial. Vários são os exemplos de tentativas bem sucedidas de aumentar a esta-
bilidadedasproteínasmodificadaspormetodologiasdedesignespecífico (namolécula
deDNAouna própria enzima) oupor evolução dirigida. A relação que existe entre ter-
moestabilidade elevadadas enzimas isoladas dehipertermófilos e a sua baixa actividade
específica continua a ser umentrave ao aparecimentomais frequente denovas enzimas
nomercado, das quais se exige o binômio elevada termoestabilidade -alta atividade ca-
talítica. Nem todas as enzimas de hipertermófilos têmnível de termoestabilidade sufici-
ente paramanter suas estruturas e funções fisiológicas quando sujeitas a altas tempera-
turas. Assim, são necessários fatores extrínsecos como chaperoninas moleculares e
solutos compatíveis, os osmólitos (STERNER e LIEBL, 2001).
A imobilização da enzima envolve o manuseio do biocatalisador (enzima–supor-
te), oqueadicionacustos aoprocessoe invariavelmente resulta em inativaçãoparcial da
enzima. Para melhor aproveitamento da técnica, recomenda-se utilizar elevadas con-
centrações de enzima em relação ao suporte. Como os métodos de imobilização, de
modo geral, envolvem interações fracas (forças de VAN DERWAALS), ou fortes (liga-
ção covalente), entre a frágil estruturadaenzimaeo suporte, ocorre invariavelmente al-
teração da estrutura tridimensional da proteína, resultando emmenor atividade. Além
disso, tambémpodemocorrer alteraçõesdeorientaçãoe acessodo substrato ao sítio ati-
CAPÍTULO 6 � IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS E SUA ESTABILIZAÇÃO 143
1ª prova
vo, reduzindo a atividadeda enzima, ou ainda levando à redução aparente da especifici-
dade ao substrato. Isto poderia ser vantajoso porque diminui os efeitos de inibição pelo
substrato. Porém, como amaior parte dos processos enzimáticos envolve a transforma-
ção demacromoléculas, a redução da especificidade é uma desvantagem. Para se supe-
rar esse problema, busca-se a proteção do sítio ativo da enzima durante o processo de
imobilização, o que pode ser conseguido empregando-se altas concentrações de
substrato ou um inibidor de sítio ativo. Nestes casos, as substâncias protetoras devem
poder ser facilmente removidas ao final do processo de imobilização.
Efeitos difusionais (transferência de massa)
Aenzima, com suamobilidade restringida pelo fato de estar ligada a um suporte, perde
parte da acessibilidade ao substrato, o que leva à aparente redução da atividade, neste
caso provocada por restrições difusionais, ou seja, limitações do acesso do substrato ao
sítio ativo devido à presença da matriz sólida. Pode, também, ocorrer acúmulo de pro-
dutonaproximidadedo sítio ativo, o quepode afetar a cinética da reação, pela redução
da velocidade de reação, ou alterar o pHnomicroambiente da enzima. Estes efeitos de-
vem ser evitados ou diminuídos pela escolha criteriosa do suporte, ou pelas condições
de operação do biorreator. De um modo geral, pequenas partículas de suporte redu-
zema resistência àdifusão intrapartícula, enquanto altas vazõesde fluido (vazões) redu-
zem os efeitos difusionais interpartículas. Estes dois fatores, são, normalmente, incom-
patíveis (partículas pequenas promovem uma alta queda de pressão ao longo do leito,
reduzindo a vazão de fluido), portanto, a aplicação específica determinará o grau de
compromisso desejável entre estes fatores.
Características físicas do biocatalisador e do fluido
Normalmente as enzimas imobilizadas devem ser utilizadas quando o substrato é solú-
vel.Quando as enzimas estão retidas no interior dematrizes porosas, os poros devem fa-
cilitar o livre acesso do substrato e reter aomesmo tempo amolécula de enzima no seu
interior.
Estabilidade do biocatalisador
O custo da imobilização deve ser compensado pela longa vida do biocatalisador. O su-
porte deve manter suas propriedades físicas (resistência mecânica e ao ataque por rea-
gentes químicos) durante o tempo demeia-vida estimado. Normalmente, os substratos
utilizados nas reações enzimáticas contêm substâncias em suspensão, lipídios, que po-
dem se adsorver ao suporte e bloquear os poros, diminuindo a acessibilidade do subs-
trato à enzima e promovendo uma redução aparente do tempodemeia-vida da enzima
imobilizada. Neste caso, as soluções de substrato devem ser purificadas antes da
alimentação do biorreator.
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO144
1ª prova
APLICAÇÕES DAS ENZIMAS IMOBILIZADAS
As enzimas imobilizadas têmuma série de características especiais que tornamsuas apli-
cações mais promissoras em relação às enzimas solúveis. Existem, na literatura, muitos
trabalhos e livros que apresentam e discutem o uso das enzimas imobilizadas nos cam-
pos industrial, analítico, médico, química fina, entre outros (tabela 6.1) (CHIBATA,
1978; CHEETHAM, 1985; ROSEVEAR et alii, 1987; TANAKA et alii, 1993; VELIK e
MCLEAN, 1994; CABRAL et alii, 1994; FERNANDES e CABRAL, 2006).
Dentre as aplicações de enzimas imobilizadas em larga escala, e que são considera-
dasumsucesso, pode-se citar: aproduçãodexaropesdeglicose e frutose apartir de ami-
do demilho; a produção do ácido 6-amino penicilínico (CABRAL et alii, 1994), penici-
lina semi-sentitética, com a enzima penicilina-G ou L-acilase, cuja produção mundial é
da ordemde 5 x 103 ton/ano; a produção de acrilamida empregando células imobiliza-
das; a produção de aspartame com a termolisina imobilizada; e a hidrólise da lactose
presente no soro de queijo.
A tabela 6.5 apresenta as principais aplicações comerciais das enzimas imobiliza-
das. O uso uso em escala industrial de enzimas imobilizadas incluem atualmente a pro-
duçãodemilhões de toneladas de xaropes de frutose (HFCS) embiorreatores que ope-
rampor 1 000 a 2 000horas seguidas comumrendimento de 2 000 a 4 000 kg/kgde en-
zima. Milhares de toneladas desta enzima imobilizada são produzidas por quase uma
dezena de empresas espalhadas pelo mundo. Segue-se a essa enzima, considerando a
importância industrial, a penicilina-acilase usada para a produção do ácido 6-aminope-
nicilânico (6APA), precursor de mais de 15 penicilinas semi-sintéticas disponíveis no
mercado. Nesta tecnologia os biorreatores operam 2 000 a 4 000 horas seguidas com
rendimentos de 1 000 a 2 000 kg/kg de enzima. Aproximadamente 3 500 toneladas de
6APA são produzidas anualmente, sendo utilizadas 30 toneladas de preparação
enzimática.
De importância industrial equivalente são as enzimas imobilizadas usadas para a
produção de vários L-aminoácidos (como a L-alanina, a L-isoleucina, a L-metionina, a
L-fenilalanina, o L-triptofano e a L-valina usados para aumentar o valor nutricional dos
alimentos) e para a hidrólise de lactose. Os sistemas de enzimas imobilizadas têm tam-
bém espaço definido em metodologias analíticas, porque são usados na confecção de
biossensores (BONePEREIRA, 1999).Os biossensores enzimáticos tornam-se cada vez
mais úteis emaplicações analíticas, devido à possibilidade de se combinar a seletividade
e sensibilidade da enzima com a simplicidade dos transdutores eletroquímicos
(FERRAZ et alii, 2006). Hoje em dia o mercado dos biossensores é dominado pelos bi-
ossensores de glicose, eletrodos enzimáticos produzidos emmassa para umdiagnóstico
rápido dos níveis de glicose sanguínea para diabéticos (NEWMAN e SETFORD, 2006).
As etapas fundamentais nodesenvolvimentodeumbiossensor são a imobilizaçãoeesta-
bilização das enzimas ou outras proteínas sobre a superfície da matriz (KLIBANOV,
1979).Materiais que possampermitir a imobilização de espéciesmediadoras emolécu-
las biológicas são de grande potencial para o desenvolvimento de sensorese biossenso-
res. Como citado, dentre osmateriais inorgânicos, a sílica-gel temumgrande potencial
CAPÍTULO 6 � IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS E SUA ESTABILIZAÇÃO 145
1ª prova
de aplicação em eletroquímica, entretanto essa é uma área de pesquisa relativamente
recente e que tende a crescer, como descreve Walcarius (1998) em sua recente revisão
sobre o uso demateriais à base de sílica nos estudos sobre eletrodosmodificados e dire-
cionados para aplicações eletroanalíticas (GUPTA e CHAUDHURY, 2007).
Tabela 6.5 Exemplos de aplicações comerciais de enzimas imobilizadas
Enzima Substrato Produto
Glicose isomerase (5.3.1.5 ) Glicose Xarope de frutose
�-galactosidase (5.3.1.5) Lactose Glicose e galactose (leite livre de
lactose)
Lipase ( 3.1.1.3) Triglicerídeos Análogos de manteiga de cacau
Nitrila hidratase (4.2.1.84) Acrilonitrila Acrilamida
Amilocilase (3.5.1.14) D,L Aminoácidos L-amino ácidos (alanina,
isoleucina, metionina,
fenilalanina, triptofano e valina
Rafinase (3.2.1.22) Rafinose Soluções de galactose e
sacarose
Invertase (3.2.1.26) Sacarose Glicose/frutose mistura (açúcar
invertido)
Aspartame amônia liase (4.3.1.1) Amônia e ácido fumárico L-acido aspártico (usado na
síntese do aspartame)
Termolisina (3.4.24.27) Peptídeos Aspartame
Glicoamilase (3.2.1.3) Amido D- glicose
Papaína (3.4.22.2) Proteínas Remoção do “chill haze” em
cervejas
Penicilina amidase (3.5.1.11) Penicilina G e V Ácido 6-aminopenicilânico
(precursor das penicilinas
semi-sintéticas)
�-tirosinase Pirocatenol Ácido L-DOPA
As aplicações mais recentes de biocatalisadores imobilizados incluem a produção
de substâncias de alto valor agregado por bioconversão regioespecífica ou estereoespe-
cífica. São exemplos, o tratamento seletivo de poluentes específicos, para resolver pro-
blemas ambientais, a análise contínua com alta sensibilidade e especificidade de com-
postos de interesse, a conversão de energia em sistemas biológicos e, finalmente, em
medicina, a confecção de órgãos artificiais e a formulação de fármacos à base de
enzimas (BON e PEREIRA JR., 1999).
ENZIMAS EM BIOTECNOLOGIA: PRODUÇÃO, APLICAÇÕES E MERCADO146
1ª prova
PERSPECTIVAS
Embora seja grande o número de trabalhos publicados no campo da imobilização de
enzimas os processos que as utilizam emescala industrial são poucos e isto se deve prin-
cipalmente aos seguintes fatores: o suporte e os reagentes para a imobilização são caros;
a ainda baixa eficiência dos métodos de imobilização; a relativamente baixa estabilida-
de operacional da enzima imobilizada; o fato de os equipamentos requeridos para a
operação contínua serem, via de regra, mais sofisticados e pouco versáteis; a pequena
demandadosprodutos, que, normalmente, não incentiva aproduçãoem larga escala; e
a baixa eficiência das enzimas imobilizadas para produtos de alto peso molecular.
Para viabilizar a aplicação industrial, é necessário otimizar os seguintes parâme-
tros: custo de imobilização, retenção da atividade enzimática, estabilidade da enzima à
temperatura e ao pH, a estabilidade operacional e projeto do biorreator; além da
obtenção de suportes mais resistentes e baratos.
A tecnologia de imobilização reune os conhecimentos da química, da bioquímica,
da biologiamolecular e celular aos da engenharia, buscando sempre se ampliar as apli-
cações das enzimas na conversão dematérias-primas, normalmente de baixo custo, em
produtos de maior valor agregado. Dessa forma, a imobilização de enzimas é realizada
não só com o propósito de atender aplicações puramente científicas, onde são utiliza-
das comomodelospara estudar a relaçãoentre a atividade catalítica e a estruturaprotéi-
ca, mas principalmente visando o uso comercial em processos contínuos.
As estratégias de posicionamento da indústria de enzimas imobilizadas dependem
diretamente do avanço de investigação em áreas relacionadas com a estabilização enzi-
mática, entre elas aa investigação do uso de proteínas de proteção, como as chaperoni-
nas (MOSKOVITZeSREBNIK, 2005).Outras estratégias têm sido abordadas comêxito
como a aplicação de modelos de inativação, a modificação química e a estabilização
comaditivos e solutos compatíveis (O’FAGAIN, 2003; SÁ-PEREIRA et alii, 2004). A área
que mais se destaca é a engenharia de proteínas que tem contribuído decisivamente
para o desenvolvimento de novos processos de estabilização enzimática.
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