Bioquímica Hidrólise do Amido

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Relatório da 1ª Aula Prática de Bioquímica I
Título da prática: Monitoramento da hidrólise do Amido e identificação de açúcares redutores.
Professor: Ivanilton Nery.
Alunos: João Victor, Jonatas Costa, Matheus Menezes, Renan Rezende, Vitor Yu Zhu, Victor Hugo Gomes.
Data da realização: 06/12/2014.
Data da entrega: 20/12/2012.
Introdução
Os açúcares, glicídios, carboidratos ou hidratos de carbono, são substâncias formadas por átomos de carbono, hidrogênio e oxigênio, sendo polihidroxialdeídos ou polihidroxicetonas, classificados pelo tamanho da cadeia carbônica e pelos grupos funcionais. São biomoléculas de fundamental importância, pois apresentam função energética e também estrutural, fazendo parte da composição do RNA e DNA. 
Os monossacarídeos apresentam apenas um grupo aldeído ou cetona, enquanto os oligossacarídeos são formados pela união de dois à dez monossacarídeos, por ligações glicosídicas, e os polissacarídeos são compostos por uniões de mais de dez monossacarídeos em cadeia, formando estruturas complexas e pouco solúveis em água, sendo um exemplo a celulose, formada por aproximadamente mil glicoses.
Alguns glicídios apresentam caráter redutor, como a glicose e frutose, que possuem uma função aldeídica e cetônica livre, o que confere a capacidade de reduzir cátions como Cu2+ e Ag+, enquanto a sacarose, que é um dissacarídeo formado pela união de glicose e frutose, não possui terminação redutora livre (estão comprometidas na ligação glicosídica). No entanto, a maltose, apesar de ser um dissacarídeo, apresenta um carbono anomérico livre, o que confere o caráter redutor.
Um dos polissacarídeos mais importantes e abundantes na natureza é o amido, que é um carboidrato composto de um grande número de moléculas de glicose, em forma de amilose (ligação α-1,4’-glicosídica) e amilopectina (ligação α-1,6’-glicosídica), unidas através de ligações glicosídicas. Esse polissacarídeo é a forma de armazenamento de energia da maioria de plantas verdes, sendo o carboidrato mais comum na dieta humana, contido em múltiplos tipos de alimentos. O monitoramento da hidrólise de amido baseia-se na quebra das ligações glicosídicas através do aquecimento do amido na presença de HCl. 
Para o monitoramento da hidrólise, é usado o lugol (solução de iodo e iodeto) que complexa com esses polissacarídeos, formando um complexo azul-escuro quando separado em amilose, e vermelho escuro quando separado em amilopectina, sendo os intermediários entre esses em cores graduadas entre o azul e vermelho, até que, após toda a hidrólise ácida ocorrida, haja apenas glicose na solução, caracterizando uma solução transparente amarelada, tendo o desaparecimento da coloração dos complexos.
O principal produto da hidrólise do amido é a glicose, que possui caráter redutor, pois possui função aldeídica livre o qual permite sua oxidação. Para constatar esse caráter redutor, é usado o teste de fehling, que consiste na redução de íons Cu2+ pelo açúcar, em meio alcalino, a óxido cuproso (Cu2O) de coloração vermelho tijolo. 
Objetivos
O objetivo da aula prática é constatar a hidrólise do amido e identificação de açúcares redutores e não redutores.
Materiais e métodos
 Materiais
Tubos de ensaio
Pipetas de 1 mL
Bastão de vidro
Vidro de relógio
Estante para tubos de ensaio
Pipetador
Banho de água à 80ºC
Amido
Ácido Clorídrico 3N
Reagente de fehlling A e fehlling B
Lugol (solução de Iodo e Iodeto)
Água destilada
Solução à 4% de Glicose, Sacarose e Maltose
Métodos 
Procedimento A
Pesou-se aproximadamente 0,5g de amido em um vidro de relógio. Adicionou-se o amido pesado em um tubo de ensaio com 15mL de ácido clorídrico(HCl) 3N. 
Retirou-se duas aliquota de 1mL da suspensão de amido em meio ácido e realizou-se o teste de Fehling e o teste de Lugol utilizando-a. Inicou-se o aquecimento da suspensão e efetuou-se retirada de aliquotas de mesmo volume regularmente para realização de testes de Fehling e Lugol. As aliquotas foram retiradas após os seguintes tempos de aquecimento: 10min. , 20min.,40min. e 60min. .
Testes realizados:
Teste de Fehling
Adicionou-se 0,5 ml de suspensão com 0,5ml de água destilada, 1 ml de Fehling A e 1 ml de Fehling B nesta ordem. Colocou-se o tubo sob aquecimento em banho por 5 minutos. 
Teste de Lugol
Adicionou-se 0,5mL de Lugol ao tubo contendo 0,5ml de alíquota.
Procedimento B
Adicionou-se em 3 tubos de ensaios distintos soluções de maltose, sacarose e glicose. Todas com a concentração de 4%(p/p). Realizou-se o teste de Fehling nas três amostras, adicionando as soluções de fehling A e B, em seguida deixaram-se os tubos a aquecimento por 5 minutos.
Resultados e Discussão
A hidrólise do amido tem como objetivo quebrar as moléculas de amido que é uma mistura de dois polissacarídeos, amilose e amilopectina, polímeros de glicose.
Amilose:
Macromolécula constituida de 250 a 300 resíduos de D-glicopiranose, ligadas por pontes glicosídicas α-1,4, que conferem à molécula uma estrutura helicoidal.
Amilopectina:
Macromolécula, menos hidrossolúvel que a amilose, constituída por cerca de 1400 resíduos de α-glicose ligadas por pontes glicosídicas α-1,4, ocorrendo também ligações α-1,6, que dão a ela uma estrutura ramificada. A amilopectina constitui, aproximadamente, 80% dos polissacarídeos existentes no grão de amido.
Na digestão o amido é decomposto por reações de hidrólise em glicose, no monitoramento da hidrólise do amido, pode ser observado que o teste de Lugol nas primeiras alíquotas apresenta coloração escura e conforme novas alíquotas são tiradas ao decorrer do tempo, o teste vai apresentando cores cada vez mais claras até chegar ao amarelo claro. Já no teste de Fehling, é observada uma coloração azul intensa (azul caneta) nas primeiras alíquotas que vai para um vermelho tijolo no final da hidrólise. As figuras abaixo mostram as cores dos testes nas alíquotas retiradas em seus respectivos tempos.
A alíquota retirada no tempo zero, ao juntar as soluções de fehling A e B, ocorreu transformação de coloração para azul escuro. Esta coloração é proveniente da ação do tartarato presente na solução de fehling B sobre os íons de Cu2+ da solução de fehling A, produzindo um complexo de cor azul caneta. A função do tartarato no meio é justamente a quelação dos íons de cobre, assim, evitando a precipitação de Cu(OH)2 pela reação entre o sulfato de cobre II (CuSO4) e hidróxido de sódio (NaOH), portanto, deixando os íons Cu2+ disponíveis para a redução por qualquer redutor presente. A reação de complexação pode ser representada pela equação abaixo:
Como os íons de cobre II presentes não sofreram mudança de coloração para vermelho, isso significa que no tempo zero, o Amido não sofreu hidrólise, e assim, não tendo nenhum açúcar redutor no meio.
No tempo zero, o tubo de ensaio com a alíquota e a solução de lugol apresentou coloração escura. Isso se deve a complexação do Iodo com o amido presente. A complexação se dá pelo aprisionamento do iodo nas cadeias lineares em forma de hélice da amilose formando um azul intenso ou a interação entre as moléculas de iodo com a amilopectina. Devido à amilopectina não ter conformação de hélice, pela presença de ramificações, sua coloração será menos intensa, pois suas interações com o iodo serão menores. A imagem abaixo pode representar a interação entre o iodo e a amilose:
No tempo de 10 minutos, as colorações anteriores foram mantidas, constatando ainda que o amido ainda não tinha sofrido hidrólise e que os íons cobre II não tinham sofrido redução.
Já no tempo 20 minutos, o a coloração do teste do Lugol continua a mesma, caracterizando ainda a presença de amido no meio. Pode ser observada uma leve tonalidade de vermelho no teste de fehling, caracterizando uma pequena formação de açúcares redutores que reduziram os íons Cu2+ a óxido cuproso. A reação entre o açúcar redutor e os íons cobre II pode ser representada pela equação abaixo:
É possível perceber que é necessária a adição de água na mesmaproporção que o açúcar, por isso foi adicionado 0,5mL de água destilada ao tubo de ensaio juntamente com 0,5ml de alíquota. E também, é necessário que o meio esteja alcalino para que a reação ocorra, assim, sendo indispensável a presença de NaOH.
No tempo 40 minutos, a hidrólise está quase completa, a cor clara no teste do Lugol demonstra que quase todo o amido já foi consumido, e o teste de Fehling com a cor vermelho tijolo significa que o amido já se quebrou em glicose, a qual é um açúcar redutor e reduziu o cobre II.
A hidrólise do amido é catalisada pelos íons H+, podendo ser representada pelo esquema abaixo:
Na alíquota retirada no tempo de 60 minutos, o teste de Lugol apresentou coloração clara e o teste de Fehling exibiu coloração vermelho tijolo intenso, o que caracteriza o término da hidrólise do amido, quebrando-o em moléculas de glicose.
O teste de fehling feito com os açúcares de Glicose, Maltose e Sacarose teve como resultado, formação de produto vermelho tijolo para glicose e maltose. Já na sacarose, não apresentou alteração da cor azul caneta da mistura feita com os fehlings A e B. Caracterizando desta forma a sacarose como um açúcar não redutor e a glicose e maltose como açúcares redutores.
A Sacarose, por não apresentar hidroxilas livres no carbono anomérico, não pode realizar reações de oxidação-redução. Ao contrário da Maltose e glicose, esses açúcares possuem hidroxilas livres para reações nos carbonos anoméricos.
No caso da Glicose, temos que nos seus dois anômeros alfa e beta, os carbonos anoméricos possuem uma hidroxila livre para reagir com oxidantes próximos. Nas imagens abaixo, temos os dois anômeros da glicose, que em vermelho estão os carbonos anoméricos:
A Maltose, dissacarídeo formado a partir de duas unidades glicosídicas de glicose unidas por uma ligação α-1,4, possui em um dos carbonos anoméricos uma hidroxila livre. Abaixo temos a maltose, que em vermelho está demarcado o carbono anomérico com a hidroxila livre:
No caso da Sacarose, vemos nas duas unidades glicosídicas de Glicose e Frutose que formam a Sacarose, a falta de hidroxilas livres nos carbonos hemicetálico (anomérico). Abaixo temos uma imagem da sacarose, demonstrando que nos carbonos anoméricos presentes não possuem hidroxilas reativas.
 
Conclusão
Com base nos procedimentos realizados, nos resultados obtidos e nas discussões feitas é possível concluir que a hidrolise do amido é um processo lento e que consiste arduamente em quebrar as moléculas de amido para que o mesmo passe a possuir açúcares redutores, que podem ser evidenciados quando em presença dos fehlings ou de Lugol, apresentando características diferentes de resultado dependendo do teste.
É possível considerar também a glicose e a maltose açúcares redutores, pois em presença de fehling ( A e B) os mesmo obtiveram a mesma aparência que o próprio amido após a sua hidrolise completa ou até mesmo parcial, diferentemente da sacarose, que não pode ser considerada um açúcar do tipo redutor por não apresentar os mesmo resultados que os outros.
Referências Bibliográficas
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