Testes Sorológicos e Validação

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TRANSCRIÇÃO DE IMUNOLOGIA BÁSICA 
AULA 11 E 12 – (30/04) Parâmetros de Validação de testes sorológicos e 
Principio de Testes Sorológicos não marcados 
 
 
PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO DE TESTES SOROLÓGICOS 
 
Compreendendo a relação entre Antígeno e Anticorpo 
Quando se quer pesquisar um antígeno, é necessário um anticorpo. Então nós utilizamos, por 
exemplo, um coelho, um camundongo, cabra, carneiro, dentre outros, para induzir a produção do anticorpo 
de interesse. Isso pode ser realizado pela técnica do hibridoma ou pelos anticorpos policlonais. 
 Por exemplo: Digamos que a gente queira identificar um antígeno pela técnica policlonal. 
Primeiramente precisamos entender que os antígenos podem ser obtidos de diferentes formas: 
 Obtenção da cápsula de uma determinada bactéria através da extração da cápsula e em seguida ela 
será injetada no animal; 
 Obtenção de um antígeno extraído da membrana externa de uma determinada bactéria, em que 
serão realizados os protocolos de extração; 
 Obtenção de uma proteína que se encontra dentro de uma mistura de proteínas, então é realizada a 
separação por tamanho, por afinidade e assim por diante. 
 Além disso, é possível utilizar a técnica chamada de proteína recombinante ou de peptídeo sintético: 
Se quer a proteína do serne viral de um vírus e se conhece o gene que codifica essa proteína importante do 
serne viral, por exemplo, do HIV. A exemplo: se quer o gene P24 e se conheça a sequência gênica do P24, 
então se pode construir essa sequencia gênica e inserir em um plasmídeo bacteriano (DNA circular extra-
cromossômico) obtendo assim um DNA recombinante que produzirá a proteína do serne viral. O que se 
obtém é chamado de proteína recombinante. 
 Vale destacar que uma bactéria pode ter dez ou mais plasmídeos. 
 Resumindo: quando se fala em técnica recombinante, é porque se conhece o gene, se insere ele em 
um plasmídeo (por exemplo), e será a própria bactéria quem produzirá a proteína de interesse. Isso se 
chama proteína recombinante. 
 Já os peptídeos sintéticos ocorrem quando se conhece a sequência da estrutura primária da 
proteína, sendo possível construir e sintetizar essa sequência. 
 Digamos que se injeta um antígeno junto a um adjuvante (será explicado posteriormente na aula de 
vacinas) no animal por via intra-dérmica, por exemplo, e é aguardado umas quatro semanas para recolher o 
soro desse animal. Nesse soro estarão presentes anticorpos contra o antígeno que se quer. Com soro se 
pode precipitar e pegar apenas a fração de gamaglobulina, podendo também fazer a chamada cromatografia 
de afinidade (constitui em colocar resina conjugada com o antígeno em uma coluna onde o soro será 
passado). 
 Posteriormente se incuba e são feitas lavagens para sair tudo aquilo que não ligou. O ligado que será 
formado entre o antígeno e o anticorpo não é uma reação covalente, é uma reação que facilmente pode 
eluir se baixando o pH, que normalmente fica em torno de 2,8. 
 Então se consegue obter somente o anticorpo por cromatografia de afinidade, que depois é 
neutralizado, obtendo um anticorpo purificado por afinidade. 
 Isso tudo até então falado é apenas para melhor compreender a relação do antígeno com o 
anticorpo, ou seja, em como a partir desse antígeno é possível obter anticorpos. Por exemplo: na hepatite 
viral, se o indivíduo está com o HBSAG que faz parte do protocolo de diagnóstico, se precisará de anticorpo 
ou vice versa: pode ser que se tenha o anticorpo e precise do antígeno para dosar. 
 Esses são métodos utilizados para obter um antígeno ou um anticorpo. 
 
Testes sorológicos 
Diante de um analito (aquilo que será analisado) é preciso saber alguns pontos como: se tem ou não 
determinada doença (qualitativo), se é preciso apenas ter uma ideia de quanto tem (semi-quantitativo), ou 
se é preciso saber exatamente quanto tem (quantitativo). 
 É necessário saber se um derminado teste é adequado ou não para o que eu preciso: Será que eu 
preciso de um teste quantitativo? Será que eu preciso de um teste semi-quantitativo? Ou será que eu 
preciso de um teste apenas qualitativo? 
Qualitativo 
Exemplos: 
 Hepatite 
 Quando se faz, por exemplo, um HBSAG, é determinado se o indivíduo tem ou não tem a doença, a 
partir de um ponto de corte. 
 Dengue 
Existe um teste em que se no resultado der uma determinada cor, ele é considerado positivo ou 
para IgM ou para IgG. 
 HIV 
Normalmente é usado o anti-HIV no diagnóstico. No resultado do exame aparece: Reagente ou Não 
Reagente. Isso é um teste qualitativo. O exame não apresenta títulos, ou seja, não diz se está 1/10, 
1/20 ou mesmo define que quantidades (Ex: 3,5 ng/mL). 
 
Semi-quatitativo 
Exemplos: 
 Teste expresso em cruzes 
Teste alergênico e Baciloscopia de escarro, são exemplos disso. Na baciloscopia de escarro é 
necessário cruzes, não basta só dizer se está positivo ou negativo. Quando a baciloscopia de escarro 
está positiva, o indivíduo é considerado bacilífero e potencialmente infectante. 
No caso, por exemplo, da baciloscopia de escarro, a expressão de resultados em cruzes é importante 
para acompanhar o tratamento, pois no final do segundo mês de tratamento é esperado negativar. Se não 
negativou é porque está tendo resistência dos bacilos ao tratamento. Então nesse caso, não é preciso saber 
que o número de bacilos diminuiu de 12.500 para 11.500, se traduz esses valores em cruzes e é feito o 
acompanhamento da terapêutica. 
 ATENÇÃO! O fato de a baciloscopia de escarro dá positiva já indica que o paciente está com 
tuberculose, mas eu posso melhorar isso utilizando em cruzes: se é observado n campos com n número de 
bactérias, isso é dado em torno de cruzes. Então além da baciloscopia de escarro dizer se está positivo ou 
negativo, ele diz mais ou menos quanto ele tem de bactérias. Portanto a baciloscopia de escarro me dá uma 
informação muito importante que é o acompanhamento terapêutico. 
 Sífilis 
Existe um teste que falaremos mais adiante que é o VDRL. Ele pode dá Não Reagente, resultado 
negativo e Reagente, resultado positivo. O resultado Reagente é dado em títulos: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16. 
O título é expresso pela última diluição em que ainda houve reação, ou seja, aglutinação. 
Exemplo: Eu tenho um paciente A que tem 1/2 de título e um paciente B que tem 1/64. Isso significa 
que o paciente A teve a última diluição em que houve resposta (aglutinação) com 1/2 de título. Já o paciente 
B passou por 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 e reagiu até 1/64 de título, então até este ponto houve a última 
diluição em que ocorreu resposta (aglutinação). Portanto o paciente B possui mais anticorpos. 
 Títulos mais altos de sífilis são encontrados na fase mais disseminada da doença, que é a fase 
secundária da sífilis, em que o indivíduo apresenta lesões na mucosa e na pele e é onde os títulos de 
anticorpos estão mais elevados. 
 Quando o paciente realiza o tratamento e o medicamento utilizado é a penicilina, por exemplo, em 
torno de três meses após o tratamento, espera-se que tenha caído em quatro vezes o título inicial. Se eu não 
faço a titulação antes de o indivíduo começar o tratamento, eu não vou saber se ele se curou ou não da 
doença. Daí a importância e utilidade do título. 
 Então se caso o indivíduo tenha começado com 1/64 e passou ao fim para 1/4, ele diminui 4 títulos 
(1/64 para 1/32 -> 1 título ; de 1/32 para 1/16 -> 1 titulo; de 1/16 para 1/8 -> 1 título; de 1/8 para 1/4 -> 1 
tílulo  Total de 4 títulos). Portanto não se está liberando o resultado em 5,5 ng/mL, por exemplo, pois só 
pelo título é dada a informação. Além disso, em títulos mais baixos (ex: 1/2) pode ser que o paciente tenhasífilis ou pode ser que seja outra patologia. 
 Glicose na urina 
O resultado sai em graduação de cor. Eu posso dizer que é uma semi-quantificação, porque ele me 
dá uma ideia. Mas por essa graduação de cor eu não posso dizer que o paciente é diabético, é 
necessário fazer uma dosecemia quantificada. Não se adianta dizer que o paciente está com ++ de 
glicose, é preciso quantificar por meio de um teste quatitativo. 
 
 
Quantitativo 
 Dosagem de IgA, IgG 
O paciente tem sete anos e vem apresentando infecções de repetição por Staphylococccus, 
Haemophilus, por exemplo. O médico suspeita que o paciente tenha deficiência de IgG. Caso o 
laboratório de análises lance o resultado desse paciente como ++ ou então diz que ele tem 1/10 de 
IgG, esse exame está errado. O resultado tem que vim expresso em mg/dL. 
Sendo uma técnica quantitativa, o termo “Eu acho que” não pode ser utilizado. É necessário que se 
tenha uma medida objetiva. 
 Por exemplo, para se realizar o teste de glicemia é necessário um aparelho que meça. Assim a 
realização de uma leitura objetiva pode ser florimétrica, por absorbância, além de ser necessário um 
calibrador, pois se precisa de uma referência. Além disso, é necessária também uma curva padrão. 
 A curva padrão recebe diversos nomes como, soro referência, soro padrão, calibrador. Para a 
construção desse soro padrão se aplica diferentes diluições de concentrações conhecidas, e assim tendo o 
conhecimento dessa concentração, será feita a curva por meio da relação entre a concentração e a 
absorbância. A partir dessa curva com as concentrações conhecidas, se faz a interpolação da amostra 
desconhecida, tendo finalmente o resultado em concentração. 
 Na bioquímica, se utiliza em torno de sete calibradores (pontos/concentrações) mais o branco, 
dando um total de oito calibradores e como é realizado em duplicata, dá 16. Assim, dependendo da 
curva/teste que é utilizado só para referência, se faz no mínimo oito pontos. 
 
Relação entre os testes qualitativo, semi-quantitativo e quantitativo 
Um teste que é qualitativo ou semi-quantitativo não pode ser quantitativo. Mas, um teste 
quantitativo pode ser qualitativo ou semi-quantitativo. 
 Os testes qualitativos e semi-quantitativos podem andar juntos. Isso porque, tendo um resultado por 
graduação da cor, pode-se expressar o resultado em termos de cruzes. Ou seja, mesmo que o teste seja 
qualitativo, se ele tiver uma graduação de cor se pode transformá-lo em semi-quantitativo. 
 
Sensibilidade Analítica 
Sensibilidade analítica é a menor concentração que um teste é capaz de detectar. 
 
 Exemplo 1 
A quantidade normal de IgG (em níveis totais) em um adulto é de 1000 mg/dL (10 mg/mL). Um teste 
cuja sensibilidade analítica seja, aproximadamente, 10 µg/mL é suficiente para dosar IgG. Digamos que o 
individuo produza 3 ng/mL de IgG anti-HIV, nesse caso já não se poderá usar o mesmo teste anterior na 
determinação de IgG anti-HIV. Caso seja utilizado esse teste de sensibilidade de 10 µg/mL, para dosar 3 
ng/mL poderá dá um resultado falso-negativo. Então, caso não se use um teste com sensibilidade analítica 
adequada, pode ser gerado um falso-negativo. 
 Comparando um teste em que a sensibilidade analítica é de 10 µg/mL com o que é de 3 ng/mL, o 
que tem maior sensibilidade é o segundo. 
 Sabendo que média de IgG no soro é de 10 mg/mL, não seria necessário usar um teste tão sensível (3 
ng/mL, por exemplo) para detectar essa quantidade. Caso isso aconteça, seria necessário fazer tantas 
diluições que chegaria a uma mínima quantidade, que seria detectada. Isso seria um risco. Por exemplo, em 
uma determinação de IgA no colostro, se utilizou um teste de alta sensibilidade, e foi necessário se fazer 
uma diluição 1: 40000 e ainda assim, o teste dava positivo. Assim, no caso de ser necessária uma 
determinação na casa de ng/ml, o comum é se utilizar testes sorológicos marcados. 
 
 
 Exemplo 2 
Hoje, há um problema em termos de diagnóstico laboratorial da Tuberculose Pulmonar. O teste de 
baciloscopia de escarro era o teste preconizado, uma vez que é barato, fácil de realizar, dentre outras 
vantagens. Entretanto só detecta a partir de 5000 a 10000 bacilos/mL, ou seja, é essa a sensibilidade 
analítica desse teste. Então se o individuo estiver expelindo 1500 bacilos/mL, e for feito esse teste, o 
resultado dará um falso-negativo >o individuo possívelmente está com tuberculose, mas não está sendo 
possível diagnosticar por conta de uma sensibilidade analítica baixa. Nesse caso, o melhor teste a ser 
utilizado seria cultura. A cultura consegue detectar 10 bacilos/mL (sensibilidade analítica), mas o problema é 
que é mais um teste mais demorado. 
 
Especificidade Analítica 
 Significa determinar só aquilo que é de interesse. Na prática, um problema com a especificidade 
analítica é mais difícil de resolver do que a sensibilidade analítica. 
 Exemplo 1 
 Digamos que se tenham antígenos de T. cruzi e combina-se com o soro do paciente para saber se o 
paciente tem Chagas. A presença de anticorpos anti- T.cruzi, indica resultado positivo, mas não diretamente 
se pode afirmar que o paciente tem Chagas. Isso porque o antígeno T. cruzi guarda similaridade com 
antígeno de Leishmania. Assim sendo o anticorpo anti- T.cruzi detectado pode estar reagindo com o 
antígeno de Leishmania e não de T. cruzi, de modo que o paciente possa ter Leshimaniose e não Chagas. 
Nesse caso, para dá o diagnostico final, se associa um segundo teste de principio diferente desse primeiro. 
 
 Exemplo 2 
O VDRL detecta anticorpos contra fosfolípedes. O VDRL contém cardiolipina que é um fosfolipede 
extraído do coração de boi. Um paciente com sífilis produz anticorpos não-treponêmicos (porque não é 
considerado específico do treponema). Assim, quando o treponema invade o tecido do hospedeiro, ocorre a 
liberação de material lipidico que fica aderido a espiroqueta (o próprio invasor) e induz a produção de 
anticorpos contra esse material. Quando se faz uso do VDRL, se está pesquisando anticorpos não-
treponêmicos contra esse material lipídico. 
 Entretanto, existem outras condições em que também podem aparecer os anticorpos contra 
material lipídico, como por exemplo no Lúpus eritomatoso sistémico e na Hanseníase Virshowiana. Ou seja, 
são doenças, que não têm nada haver com sífilis, e que o paciente pode produzir anticorpos contra 
fosfolípedes. E nesses casos pode ocorre um resultado falso-positivo: o VDRL é para sífilis, mas pode dá 
falso-positivo para outras patologias. Nesse caso, para dá o diagnostico final, se faz um teste confirmatório, 
em que se pesquisa anticorpos treponêmicos que é especifico para síilis. 
 
 Exemplo 3 
Os testes de triagem para HIV (retro-virus) (testes com ELISA) poderiam dar um resultado falso-
positivo nos indivíduos que haviam tomado vacina contra H1N1 (vírus influenza). Assim, o ELISA (Ensaio 
Imunoenzimático, teste sorológico usado para detectar HIV) não tem especificidade analítica, uma vez que 
essa problemática ocorreu. Ou seja, não se pode dizer se o paciente tem HIV só usando o ELISA, sendo 
necessário um teste confirmatório. No caso, não se usa apenas o teste confirmatório porque o ELISA é um 
teste sensível que permite detectar a partir do 16º dia, e o confirmatório só a partir do 30º dia. 
 Exemplo 4 
Quando o individuo, principalmente crianças, é infectado pela bactéria Streptococcus pyogenes beta 
hemolítico do gurpo A , ele vai ter orofaringite com a produção de anticorpos contra essa bactéria. Esse 
anticorpo reage na verdade com a chamada proteína M dessa bactéria. Alguns sorotipos dessa proteína têm 
similaridade com antígenos da válvula cardíacae assim, uma vez produzido o anticorpo, haverá o 
comprometimento da válvula cardíaca. 
 Isso é um evento auto-imune porque o antígeno acaba sendo do próprio individuo. Mas isso não é 
uma doença auto-imune, por que não tem a característica de ser crônica, inflamatória e não-infecciosa 
(requisitos para ser uma doença auto-imune). 
 O tratamento é feito com antibiótico-terapia e antibiótico-profilaxia, de modo a reduzir a 
colonização da bactéria em questão. 
 A febre reumática é exatamente a sequela de uma orofaringite provocada por Streptococcus 
pyogenes beta hemolítico do gurpo A. 
 Vale destacar que isso não é exemplo de problema de teste e sim de similaridade estrutural que vai 
acometer o individuo. Essa similaridade entre antígenos não relacionados entre si pode ser chamada de 
similaridade estrutural ou mimetismo molecular. Essa similaridade estrutural, que ocasiona a reatividade 
cruzada, é provocada pelo anticorpo. 
 
 
Exatidão e Precisão 
 
Esse é um problema da prática laboratorial uma vez que não é apenas dosar com um teste sensível, 
mas é preciso que esse teste também seja teste 
reprodutível e exato. 
 Digamos que temos um soro referência 
com valor de 250 µg/ml. Se toda vez que se 
repete o ensaio o valor dá próximo de 250, 
chamamos isso de exatidão. Este é o chamado 
valor nominal. Então, em todo cálculo de 
análise em que os valores encontrados são 
próximos do valor nominal, isso é exatidão ou 
acurácia. Agora, se os valores encontrados nos 
ensaios são próximos entre si, mas distantes do 
valor nominal, isso é referente a precisão. 
 
Fazendo uso de uma analogia: 
-Acuárcia é falar a verdade. Quanto mais eu me afasto da verdade, mais corro o risco de errar (erro 
sistemático). Exemplo: uma pipeta descalibrada leva a esse tipo de erro. É um erro permanente. 
-Precisão é contar a mesma história muitas vezes, mesmo que esta não seja verdadeira. Contando a mesma 
história repetidas vezes eu posso esquecer de uma palavra, isso é exemplo de um erro aleatório. Exemplo: 
uma solução que não se percebeu que estava vencida. 
Precisão (repetitividade) 
 A precisão tem haver com a repetitividade do ensaio. Ela pode ser de 2 tipo: 
 
 Variação Intra-ensaio 
Testa-se a reprodutibilidade dentro de um 
mesmo ensaio, testando a mesma amostra 
repetidas vezes (replicatas). 
 Variação Inter-ensaio 
Testa-se a reprodutibilidade do ensaio em 
dias diferentes e entre laboratórios 
também. 
 
 Essa fórmula dá uma porcentagem de reprodutibilidade. Na maioria dos ensaios o aceitável é 10%, 
mas dependendo do sistema, que seja de difícil controle de variação, essa porcentagem aceitável pode 
aumentar para 15 ou 20%. 
 
A fórmula de cálculo da exatidão é baseada 
no grau de concordância entre o valor calculado e o 
valor nominal. 
 
 
Cut-off ou Limiar de Reatividade 
Cut-off é um valor no qual a direita é positiva e a esquerda é negativo. Ou seja, é o limite onde o 
diagnóstico é positivo ou negativo. Em um teste de ELISA, que é quanlitativo, se não houver um cut-off, por 
exemplo, poderiamos considerar todas as amostras, que deram leitura de absorbância, positivas. Por isso a 
importância do cut-off em dá um valor base. O cut-off é realizado em todos os kits de diagnóstico. 
 Há um teste em uma população em que há doentes e não doentes. Nos não-doente há leituras mais 
baixas e nos doentes há leituras mais altas. O ponto de maior separação entre doentes e não-doentes é o 
cut-off. 
 Se você observar o gráfico, irá perceber que 
há uma área do gráfico dos doentes que está atrás 
do cut-off, ou seja o indivíduo é doente mas o teste 
deu negativo. Esses são os chamados falsos 
negativos. 
 Há uma outra área do gráfico dos não-
doentes que está a frente do do cut-off, ou seja o 
indivíduo é não doente mas o teste deu positivo. 
Esses são dos falsos positivos. 
 Logo, o cut-off não divide os doentes dos 
não doentes, pois os doentes são os verdadeiros 
positivos + os falsos negativos e os não doentes são 
os verdadeiros negativos + os falsos positivos. 
 Existe ainda uma zona de segurança para os valores próximos ao cut-off (10% para mais e 10% para 
menos). Os valores dentro dessa zona são considerados indeterminados. A conduta necessária é reproduzir 
em triplicata e verificar se a média continua dentro dessa zona de segurança, caso permaneça, se diz que é 
indeterminado. 
 
 
 
PRINCÍPIOS DE MÉTODOS SOROLÓGICOS NÃO MARCADOS 
 
 Dentro dos testes sorológicos não marcados, temos as técnicas de precipitação e as técnicas de 
aglutinação. 
 
Testes de precipitação 
Os testes de precipitação podem ser: 
 
 
 
 
 
 
Uma das condições para a realização do teste de precipitação é que ambas as partes (antígenos e 
anticorpos) estejam solúveis. Nos testes de precipitação há o risco do fenômeno de pró-zona e pós-zona. E a 
sensibilidade analítica é de 0,3 a 25 mg/dL. 
Para que se visualize a precipitação são necessárias condições. Além das partes serem solúveis, o 
antígeno tem que ter, pelo menos, dois epitopos; e o anticorpo tem que se ligar a duas moléculas de 
antígeno. Um outro ponto é que os antígenos e os articorpos tem que estar em quantidades equivalentes. 
Nesses tipos de testes há uma precipitação visual onde se é possível ver o precipitado. 
 A Zona de equivalência é ponto em que há a maior 
quantidade de precipitação (máximo de precipitação). 
Fora dessa zona de equivalência, há duas zonas onde não 
há a condição necessária para a precipitação. 
 Quando há um excesso de anticorpo, irá haver 
anticorpos não ligados ou ligados há apenas uma molécula 
(lembre-se que é preciso ligar-se a pelo menos 2 
moléculas). Nessa condição temos a PRÓ-ZONA. 
 A outra situação ocorre quando há um excesso de antígenos, de modo que há moléculas livre que 
não se ligam aos anticorpos. Nessa condição temos a PÓS-ZONA. 
 OBS: Nessas duas zonas não há precipitação. Ocorre precipitação apenas na zona de equivalência. 
No gráfico está constante a 
quantidade de anticorpo. Na pró-zona, 
vemos que pela pouca quantidade de 
antígeno, o anticorpo está em excesso. Na 
pós-zona, a quantidade de anticorpo 
permanecendo a mesma e a quantidade de 
antígeno estando aumentada, o antígeno 
está em excesso. 
 
A doença melhor para exemplificar essas condições é a sífilis. Na fase secundária da sífilis, uma fase 
disseminada, o indivíduo produz muito anticorpo. Então, se utilizarmos uma técnica de precipitação ou 
aglutinação, pode haver uma não visualização do precipitado por haver um excesso de anticorpo, um risco 
que pode ocorrer é o fenômeno pré-zona. 
 Como resolver este problema? Podemos diluir para diminuir a concentração de anticorpo na 
amostra, assim ele entra na zona de equivalência. 
 
Outros exemplos: 
 Caso se queira dosar Proteina C reativa: ela se comporta como um antígeno, então se ela é um 
antígeno e estiver em excesso, o fenômeno de pós-zona pode acontecer. 
 Caso de queira dosar IgG: Se a IgG estiver em excesso, pode ocorre o fenômeno de pós-zona, porque 
nesse caso se faz uso de um anti-IgG, logo a IgG ela está se comportando no teste como antígeno. 
Ou seja, quando se utiliza um teste de precipitação ou aglutinação para dosar um soro de um 
indivíduo, pode ser que ele esteja com a hipergamaglobulinemia (aumento de IgG), e aí há o risco de não 
haver visualização por causa do excesso de antígenos, ocorrendo portanto um efeito de pós-zona. 
 
Imunodifusão radial dupla 
Essa técnica foi descrita em 1947. É uma técnica 
extremamente simples, onde se usa uma lâmina de vidro 
e sobre essalâmina de vidro se coloca uma camada de 
agarose, em que se aplica o antígeno e o anticorpo nos 
orifícios feitos sobre a agarose. 
 A agarose é um polímero que vai permitir a 
passagem de moléculas de diferentes tamanhos de peso 
molecular. Normalmente se faz uma agarose a 1%. 
 Quando se coloca o antígeno e o anticorpo, eles estão solúveis e, deixando-se passar 16 horas ou 
mais, ocorrerá a difusão radialmente de ambos, havendo uma precipitação na zona de equivalência onde se 
encontraram. Depois disso, se lava o sistema e ele pode ser analisado com ou sem corante de proteínas.
 Essa é uma prática, atualmente, pouco utilizada mas que pode ser utilizar, por exemplo, na pesquisa 
de fungos, para saber se um indivíduo tem uma pneumonia causada por Cryptococcus neoformans. No caso, 
se coloca antígenos de Cryptococcus neoformans de um lado, se coloca o controle positivo e também a 
amostra do paciente. Se formar a linha de precipitação entre o antígeno e a amostra de soro significa que o 
paciente tem esse anticorpo e, portanto fecha o diagnóstico. 
É possível saber também qual é o título desses anticorpos, então 
se aplica o antígeno no centro e ao redor se coloca a amostra de soro em 
diferentes diluições: 1/1(não diluído), 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32. Isso 
chama-se diluição seriada na razão 2. 
 Digamos que ele formou uma linha até 1/8, então o título dessa 
amostra é 1/8. 
Diante disso se observa que esse teste é qualitativo e semi-quantitativo. 
 No centro pode-se colocar o antígeno ou anticorpo, dependendo sempre do que se quer detectar. 
Isso também pode ter uma outra aplicação. Digamos que se queira anti-IgA, então se aplica em um 
animal IgA, e depois de um mês se faz a coleta. Posteriormente se faz o teste: coloca IgA no centro e se vê o 
título da amostra coletada. Se na imunização foi gerado pouco anticorpo, então o animal é novamente 
desafiado (ou seja, aplica de novo o IgA), espera-se mais um mês para coletar e faz um novo teste. Na 
prática, isso é utilizado para ver, por exemplo, o aumento do título de anticorpo num animal que é 
imunizado com a proteína desejada. 
Outra possibilidade é aplicada os pacientes que têm alguma doença auto-imune, por exemplo, o 
paciente que tem suspeita de lúpus. Normalmente, o paciente que tem suspeita de lúpus tem uma série de 
anticorpos contra antígenos nucleares, um deles é o anti-Sm (o que se costuma pesquisar) e o outro é o anti-
RMP. 
 Então se pega o extrato de timo de camundongo (furo superior) que é rico nesses antígenos, coloca 
um controle (um soro que se sabe que tem reação, logo há o anti-Sm) (furo inferior à esquerda) e coloca 
também o soro de um paciente (furo inferior à direita) que tem suspeita de lúpus: um paciente A, um 
paciente B e um paciente C. Então se aparecer o anticorpo anti-Sm, por exemplo, já fecha o diagnóstico de 
lúpus. 
Com o controle, que tem anticorpo anti-Sm, se forma a linha de precipitação 
entre o extrato do timo e o soro controle. Caso o soro do individuo A tenha reagido e 
formado uma linha de precipitação na mesma altura que aquela formada com o 
controle resultando em uma continuidade perfeita/curva perfeita, se tem a certeza 
que o individuo tem anti-Sm, e logo tem Lúpus. Isso se chama perfil de identidade 
total. 
Em uma outra situação, com o indivíduo B, se formou uma linha entre o 
extrato de timo e o soro de B significando que há um anticorpo. Entretanto, como 
não foi na mesma altura e formato da linha entre o controle e o extrato (não houve 
continuidade perfeita), não houve portanto identidade, se tratando de um perfil 
sem identidade. Logo o indivíduo o B tem um anticorpo mas, com certeza, não é o 
anti-Sm. 
Já na analise do paciente C se pode afirmar que ele tem anti-Sm, porque 
apresenta a curvatura perfeita, mas ele tem também um anticorpo que não é o 
anti-Sm, ou seja é um perfil de identidade parcial. 
Uma outra situação: seu chefe mandou você purificar o IgA, injetar em um coelho e obter o soro. No 
teste, você coloca um soro humano normal e coloca também um soro referência que contêm anti-IgA 
(controle). Se o resultado for um perfil de identidade total, então quer dizer que certamente o soro 
apresenta anti-IgA e está mono-específico, ou seja, só reage com IgA . 
 Entretanto, pode ocorre de ter sido feita a purificação de IgA, fez-se a imunização do coelho e se 
obtive um soro anti-IgA, mas quando ele foi colocado para reagir no teste, foram obtidas três linhas de 
reatividade. Uma bate com IgA, mas a presença das outras duas linhas expressa que há outros dois 
anticorpos, significando que a IgA não está 100% pura podendo ter rastros de outras proteínas. 
 Isso é algo muito utilizado em laboratório. Quem faz imunização de animais utiliza essa técnica para 
verificar a pureza de anticorpos e avaliar a monoespecifidade. 
 
Resumo dos perfis de identidade: 
Refere-se a precipitação ocorrida entre antígeno e anticorpo. 
 Identidade total: presença da linha de continuidade. Pode-se detectar presença de um anticorpo 
específico. 
 Identidade parcial: presença de uma identidade total e um perfil sem identidade, demonstrando que 
apareceu outro anticorpo que não é o de referência, além do pesquisado. 
 Ausência de identidade: linha sem continuidade. Pode-se dizer que o paciente é negativo para o 
anticorpo pesquisado e possui outro anticorpo desconhecido. 
 
Imunodifusão radial simples de Mancini 
Essa técnica foi descrita na década de 50. Trata-se de uma técnica quantitativa. Atualmente se utiliza 
em laboratórios muito pequenos ou então quando se quer dosar, por exemplo, imunoglobulinas de fluidos, 
de líquor ou quando se quer dosar quantidades pequenas de IgA (low IgA). 
 A agarose é dissolvida, colocada a 56°C e depois adiciona o anticorpo enquanto a 
agarose ainda está a 56°C. Em seguida isso é colocado em placas. Essas placas são 
normalmente maiores que placas de microscópio. Ou seja, o anticorpo está incorporado ao 
gel. 
 Então quando se fizer os orifícios e aplicar a amostra, (normalmente, primeiro se 
coloca uma amostra conhecida, de concentrações conhecidas em várias diluições) vai ocorre 
a difusão. Uma vez que haja a precipitação (na zona de equivalência), ela ocorre formando 
halos. 
 Depois que ocorre a reação, que normalmente demora 24 h (ou no caso da IgM 
demora bem mais, em torno de 72 h), se pode lavar e corar com um corante de proteína.
 Os halos podem ser medidos permitindo uma quantificação, e uma vez que 
previamente foi aplicado um soro com concentração conhecida em diferentes diluições, se 
pode montar a curva padrão e determinar a concentração da amostra de interesse. 
 Essa é uma técnica quantitativa que dispensa o uso de equipamentos. 
 
Técnica da Low IgA 
 Exemplo 
Uma criança de 7 anos de idade está apresentando pneumonias e sinusites de repetição. A hipótese 
que o pediatra pensa é deficiência de IgA. Pelo conceito, é considerado deficiência de IgA níveis abaixo de 5 
mg/dL. 
 A deficiência de IgA é uma imunodeficiência primária que leva o paciente a ter infecção de repetição 
por ausência de anticorpo. Na população brasileira ocorre em torno de 1 pra 1000, sendo frequente e, logo, 
não é rara (mas na realidade, muitas vezes, o médico nem suspeita que possa ser uma deficiência de IgA).
 Voltando ao exemplo em que o quadro de deficiência foi pensado, se utiliza, primeiramente um 
método com sensibilidade analítica de 20 mg/dL. Caso a amostra dê resultado negativo, não é possível dizer 
se o paciente está com deficiência de IgA ou não, uma vez que o nível que prediz é abaixo de 5 mg/dL, e o 
teste não consegue detectar devido sua sensibilidade.Nesse caso o problema é que o soro é quem está com uma quantidade muito baixa de IgA. Caso se 
opte por concentrar o soro, geralmente ocorrem erros. Só se concentra o soro quando não se tem uma 
outra possibilidade. Uma vez que não se irá “mexer” na concentração do soro, a opção é “mexer” na 
sensibilidade analítica, ou seja, será preciso mudar a técnica. 
 Nesse caso se usa o mesmo princípio de técnica de imunodifusão radial simples, só que se diminui a 
quantidade de anticorpo que tem na agarose, diminuindo assim a quantidade de anticorpo que vai entrar na 
zona de equivalência. 
 Fazendo essa diminuição, a nova sensibilidade analítica da técnica passa a ser de 1 mg/dL. Isso é 
chamado de low IgA. A low IgA vai detectar em torno de 1 a 20 mg/dL. 
 Fazendo então a repetição do teste, agora com a low IgA, se dessa vez o resultado der negativo, se 
fecha o diagnóstico. 
 Vale destacar que nesse exemplo, em que está se dosando os níveis totais de IgA, a IgA está se 
comportando como antígeno. Então no método se está impregando anti-IgA, ou seja, a agarose vai está 
impregnada com anti-IgA, e nela se coloca, além da amostra do soro do paciente, os calibradores. 
 A low IgA e low IgG é, então, usada para dosar menores concentrações dessas imunoglobulinas, 
sendo utilizadas só em situações específicas. A Low IgG normalmente se usa em liquor e a Low IgA é usada 
na situação do exemplo dado. 
 Se houver uma outra situação em que o soro esteja em excesso, esse é um problema mais fácil de 
resolver: basta fazer a diluição do soro. 
 
 
 
 
 
 
 
Eletroforese de zona 
Esse teste é qualitativo e semi-quantitativo, servindo para o diagnóstico de paraproteinemias, 
hipergamaglobulinemia (hipergamaglobulinemia monoclonal), hipergamaglobulinemia policlonal e 
hipogamaglobulinemias. 
 Na eletroforese de zona se utiliza agarose ou acetato de celulose (este é mais utilizado). 
 Essa técnica se baseia no princípio de 
que as proteínas têm propriedades anfotéricas, 
de modo que ao aplicar uma corrente elétrica, 
elas tendem a migrar para o seu ponto 
isoelétrico, formando 5 picos principais: 
albumina, alfa1 globulina, alfa2 globulina, beta-
globulina e gama-globulina. Esses picos, que 
dão uma ideia de quantidade, são formados 
quando se submete as bandas da eletroforese 
ao tensitômetro. 
 Dentro da sorologia, os picos de 
interesse são os que correm na beta e gama 
globulinas. A IgD, IgM e IgA correm no espectro 
da beta-globulina e a IgG, essencialmente no espectro da gama-globulina. 
 
Em um perfil eletroforético de soro normal, se pode 
observar todos os picos, já em um perfil em que há ausência 
de um pico, se pode suspeitar de hipogamaglobulinemia. 
 No caso do perfil que expresse 
hipogamaglobulinemia, não pode se dizer se é beta ou 
gama, logo esse teste não serve para diagnóstico, ele dá 
apenas uma ideia, um rastreio. Então para se ter uma 
confirmação de diagnóstico se pode complementar com a 
técnica de imunodifusão radial simples. 
 
 
No caso de uma hipergamaglobulinemia policlonal 
(expressa no perfil como um pico mais elevado que o normal) 
ela não é especifica para elucidar nenhum diagnóstico de 
porque pode ocorrem em várias situações: doença infecciosa, 
lúpus, dentre outras. 
 
Na análise de um perfil eletroforético, quando 
se observa um pico pontiagudo, se suspeita de um 
pico monoclonal. Já quando se tem um pico abaulado, 
se pode pensar em hipergamaglobulinemia policlonal.
 O monoclonal é resultante de mieloma e o 
policlonal tem várias circunstâncias que podem 
provocar o aumento das imunoglobulinas. 
 No caso, não se diferencia o pico monoclonal 
gama do beta apenas olhando o perfil eletroforético. 
 
 
Quando se tem uma hipogamaglobulinemia ou uma hipergamaglobulinemia se faz uso de técnicas 
quantitativas, e no caso, como opção temos: 
 Imunodifusão radial simples 
 Imunoturbidimetria 
 Imunonefelometria 
 
 
Imunoturbidimetria e imunonefelometria 
A imunoturbidimetria e a imunonefelometria são 
duas técnicas que usam o princípio de que, quando a luz 
atravessa uma solução, ela pode ser absorvida, refletida ou 
dispersa, assim, na presença de imunocomplexos, o mesmo 
ocorre: a luz pode ser absorvida, refletiva ou dispersa. 
 A imunoturbidimetria já é um avanço frente a 
imunodifusão radial simples. Isso porque ela pode ser tanto 
semi-automatizada como automatizada. Então, adquirindo-
se pequenos imunoturbidímetros se faz uma rotina de 
analises mais rápidas do que uma imunodifusão radial 
simples. Alem disso, a imunoturbidimetria tem uma 
linearidade maior e uma reprodutibilidade melhor do que a imunodifusão radial simples. 
 O principio da técnica de imunoturbidimetria é que a dosagem é feita através da medida da 
redução na transmissão da luz causada pela presença de complexos imunes. Lembrando que sempre se 
precisa fazer uso de calibradores. Normalmente se escolhem calibradores de alta, média e baixa 
concentração. 
 Como aplicação, essa técnica é utilizada para dosar as imunoglobulinas principais (IgA, IgG, IgM, 
subclasses de IgG), C3, C4, proteína C reativa, fator reumatoide, anti-estreptolisina O (ASLO). 
 Lembrando que esso é uma técnica quantitativa. 
OBS: Veremos adiante que o fator reumatoide, a proteína C reativa e ASLO eles podem ser tanto semi-
quantificados quanto quantificados. Mas quando, por exemplo, o médico solicita um fator reumatoide 
quantitativo e um ASLO quantitativo, é porque ele quer que a análise seja feita pela técnica de 
imunoturbidimetria ou de imunonefelometria. Quando ele não tem menção/especificação nenhuma no 
exame, pode ser usada a técnica de aglutinação. 
A imunonefelometria mede a dispersão da luz provocada 
pela presença dos complexos imunes. Ela tem uma linearidade 
maior, sendo normalmente automatizada. O nefelômetro semi-
automatizado é muito caro. 
 Essa técnica serve para dosar as imunoglobulinas, C3, C4, 
proteína C reativa, fator reumatoide, subclasses de IgG e ASLO. 
Lembrando que essa também é uma técnica quantitativa, e se faz 
uso de calibradores. 
 No caso a dispensão da luz, dependendo do aparelho, há um 
detector posicionado em ângulos diferente, por exemplo, a 70°. O 
detector transforma a dipersão em um sinal, que fazendo uso de um 
calibrador, se transforma em uma curva. 
 
RECAPTULANDO: 
As técnicas quantitativas são: imunodifusão radial simples, imunoturbidimetria e imunonefelometria. A 
eletroforese é semi-quantitativa e qualitativa. 
 
 
 
No caso de uma triagem de uma paraproteinemia, podem se utilizar duas técnicas: 
 Imunoeletroforese 
 Imunofixação 
 
 
 
Imunoeletroforese 
 
A imuneletroforese é uma técnica qualitativa e semi-quantitativa que associa duas técnicas: 
eletroforese de zona e imunodifusão passiva. 
 Aplica-se uma amostra de soro e a submete à eletroforese. Logo a seguir, na canaleta existente do 
aparato, se coloca o anticorpo que se deseja investigar. 
No exemplo ao lado, a amostras de soro 
foram aplicada (em cada “furinho” redondo) e 
foram submetidas à eletroforese. Em “N” foi 
aplicado o soro normal/de referência e em “P” 
foi aplicado o soro do paciente. 
 Logo depois, se aplicou o anti-IgA, o anti-
IgG, o anti-IgM, o anti-Kappa e o anti-Lambda 
(um tipo em cada cantonela). 
 O que vai acontecer é uma imunodifusão 
passiva: as substâncias aplicadas se difundem 
para cima e para baixo, e na zona de 
equivalência, do anticorpo com o soro, se 
formam os arcos de precipitação. 
 Depois, então, se compara então os 
arcos de precipitaçãodo soro normal com o soro do paciente. 
 Na análise da primeira figura do exemplo em questão, vemos que em relação ao soro normal, o 
paciente está com: 
 IgG em níveis maiores 
 IgA em níveis menores 
 IgM em níveis menores 
 Kappa tem 
 Lambda não tem 
Isso nos leva a supor que o paciente tem mieloma de IgG kappa. 
 
Na análise da segunda figura, vemos que em relação ao soro normal, o paciente está com: 
 IgG em níveis menores 
 IgA em níveis maiores 
 IgM em níveis menores 
 Kappa tem 
 Lambda não tem 
Isso nos leva a supor que o paciente tem mieloma de IgA kappa. 
 
 
Imunofixação 
 
Essa técnica é mais sensível que a imunoeletroforese. Ela 
associa a eletroforese com a imunoprecipitação in situ. 
 Faz-se a eletroforese com o soro do indivíduo em 
agarose. Separadamente, em um aparato contendo acetato de 
celulose em “fitas”, se coloca o anticorpo de interesse (por 
exemplo: o anti-Lambda, o anti-Kappa, o anti-IgM, anti-IgG, anti-
IgA). 
 Terminada a corrida de eletroforese, o aparato contendo 
os anticorpos é posto em contato com o local onde foi feita a corrida do soro. 
Quando se coloca as fitas de acetato 
contendo o anticorpo em cima da agarose com o 
soro, ocorrerá a precipitação in situ, caso ocorra a 
ligação dos antígenos do soro com os anticorpos de 
interesse. Depois se associa um corante de prata.
 No exemplo ao lado, vemos que na análise do 
perfil de eletroforese deu um pico monoclonal. 
Fazendo uso da imunofixação, constatamos que é 
referente a IgG, de modo que em comparação com o 
“normal” a precipitação foi mais intensa, 
apresentando também o kappa. Se supõe então que o 
paciente tem mielopa IgG kappa. 
O SPE é o anti-tudo (padrão soro). 
 
No caso da análise de gamopatia monoclonal, é 
feita a eletroforese na urina. Isso porque, mieloma de IgA 
e IgG se pode encontrar a cadeia leve na urina. Então, faz-
se a técnica de imunofixação. 
 Quando se trabalha com eletroforese de urina é 
necessário concentrar (se concentra pelo menos umas 20 
vezes). 
 Se faz então uma imunofixação, usando anti-tudo, 
anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-Kappa e anti-Lambda. No 
caso do exemplo ao lado, se concluiu que o paciente tem 
na urina a proteína chamada de proteína de Bence Jones 
(indivíduo quem descreveu). 
 Assim sendo, a imunofixação e a imunoeletroforese são s método ideais para fechar o diagnóstico de 
mieloma. E quando se deseja dosar/quantificar se usa a imunodifusão radial simples, a imunoturbidimetria e 
a imunonefelometria. 
 
Teste de aglutinação 
Na aglutinação, uma das condições é que uma das partes analisadas seja particulada. Diferente do 
que ocorre na precipitação, em que todos estão solúveis. 
 Existe o risco de fenômeno pró-zona e pós-zona. Os testes de aglutinação são mais sensíveis que as 
técnicas de precipitação. Possui sensibilidade analítica de 0,01 a 0,3 µg/mL. 
 Dentro dos testes de aglutinação temos: 
 Aglutinação direta 
 Passiva indireta 
 Passiva reversa 
 Floculação 
Na aglutinação direta não se usa artificio 
nenhum, o que vai ser detectado já existe na natureza. 
 Exemplos: Quando se faz uma tipagem ABO, o 
antígeno já está na célula, sendo portanto uma 
aglutinação direta; quando se deseja fazer a 
sorotipagem do flagelo de uma bactéria, ela já está o 
seu antígeno. 
 Na aglutinação passiva se faz um artifício. Por 
exemplo: se adsorve o antígeno ou o anticorpo a uma 
partícula ou célula. As células mais utilizadas são hemácias de aves e em termos de partículas, o mais usado 
é o látex. A passiva pode ainda ser divida em indireta e reversa. Na indireta se pesquisa anticorpo e na 
reversa se pesquisa por antígenos. 
 
Aglutinação direta 
 
 
 
 
 
 
 
Aglutinação passiva indireta 
Quando se fala em hemaglutinação passiva 
indireta, por exemplo, já se sabe que está 
pesquisando anticorpo e que está usando a hemácia 
como suporte/material sólido. E, nesse caso, como 
você está pesquisando anticorpo, o antígeno é quem 
fica ligado a partícula. Então, anticorpo pode ser 
anticorpo contra T. cruzi e anticorpos contra 
Treponema pallidum. 
 Fator reumatoide (não confundir com febre reumatoide) é um autoanticorpo contra IgG. Ele é usado 
no diagnóstico de artrite reumatoide, que é uma doença autoimune que acomete principalmente as 
articulações. Se pode usar o látex pra detectar o fator reumatoide. 
 Estreptolisina O é uma exotoxina altamente imunogênica liberada pelo Streptococcus pyrogenes 
beta-hemolíticos do grupo A. O paciente tem a orofaringite e depois ele tem acometimento que pode ser 
cardíaco, dentre outros. Uma vez feita a cultura, e não se encontram mais bactérias, se faz o ASLO. 
 O ASLO é um anticorpo contra estreptolisina O. Assim, juntamente com as manifestações clínicas, 
mais o ASLO, se fecha o diagnóstico de febre reumática. 
A aglutinação passiva indireta pode ser feita com o látex em cartões, ou se usando placas. 
 
 
 
 
No caso da placa (placa de microtitulação), quando se há aglutinação, essa aglutinação fica em 
suspensão, semelhante a um véu, e fica todo rosado. Isso porque as hemácias estão em suspensão, e os 
anticorpos estão aglutinando nas hemácias. Porém, quando as hemácias não encontram o anticorpo, elas 
formam uma espécie de ponto no fundo da placa. 
 Vale destacar que podemos usar isso tanto do para análise do positivo ou negativo (qualitativo), 
como se pode titular essas amostras (semi-quantitativo). 
 
Aglutinação passiva reversa 
 Pode ser usada para proteína C reativa ou 
então polissacáride capsular bacteriano. 
 Lembrar que na passiva reversa, no material 
particulado está ligado o anticorpo e se está 
detectando o antígeno. 
 
Floculação 
O VDRL contém uma suspensão de cardiolipina, lecitina e colesterol e serve para pesquisar 
anticorpos que floculam com a cardiolipina. Ou seja, ele é, na verdade, utilizado para pesquisar anticorpo 
anti-fosfolípide. Isso é chamada de pesquisa de 
anticorpos não-treponêmicos. 
 No RPR, na verdade, há uma modificação 
em que se utiliza partículas de carbono associados 
a cardiolipina para que se consiga visualizar a 
reação, uma vez que no VDRL é necessário o 
microscópio. 
 
Cuidados: 
A técnica de floculação está sujeita ao fenômeno de pró-zona. Isso porque, se o indivíduo tiver