Histo 01 Microscopias

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MÉTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA 
CELULAR 
 
MICROSCOPIAS 
M 
I 
C 
R 
O 
S 
C 
O 
P 
I 
A 
S 
 Início (1600): 
 - Incorporação do microscópio aos estudos anatômicos; 
 - Desenvolvimento de técnicas de preparo para a visualização 
dos materiais biológicos 
1663 
Robert Hooke 
1852 1750 1689 
Marcello 
Malpighi 
Marcello Malpighi 
(1628-1694) 
(1689) 
“ Nossa opinião é que a anatomia de uma estrutura sumamente pequena, 
interna de uma víscera, que foi exaltada nestes tempos, é de uso 
a nenhum médico” 
Médicos: Rejeitaram microscopia – inútil 
 Descrições sobre os capilares eram falsas 
 Anatomia comparada era irrelevante para medicina 
 Anatomia humana → só era útil para descrição 
Introdução da microscopia à medicina 
 
Estudo de capilares 
Fundamento: Sistema de lentes combinadas, que são colocadas de 
forma a ampliarem a imagem do objeto 
Interação da luz 
com o espécime 
Absorção Refração dos 
raios de luz 
ou 
Criar contrastes entre o objeto e o meio em que envolve 
Na formação da imagem aos Microscópios, dois 
fenômenos devem ser considerados: a absorção e a refração 
Interação da luz 
com o espécime 
Microscópio 
 produção de imagens aumentadas de 
objetos não visualizados à olho nú 
 Principal instrumento da Biologia Celular e Histologia 
 1) De luz (ML) / óptico (comum) 
 Modificado (variações) com propósitos especiais 
  Contraste de fase  Invertido 
  Polarização  Fluorescência 
 2) Eletrônico (ME) - imagens mais aumentadas / feixe de elétrons 
  Microscópio eletrônico de transmissão (MET) 
  Microscópio eletrônico de varredura (MEV) 
 Fonte luminosa → luz branca 
(lâmpada com filamento de 
tungstênio) 
 
 Óptica → lentes 
 ampliação 
 condensação 
 Mecânica 
 
Microscópio de luz 
comum / campo claro 
Componentes: 
Os modelos microscópicos variam na forma e no desenho 
Princípios da formação da imagem ao Microscópio 
Fonte 
 de luz condensadora 
objetiva 
ocular 
objeto 
Imagem 
I 
Imagem II 
F F F 
C C C 
O posicionamento estratégico das lentes no microscópio proporcionam 
a formação de uma imagem Invertida 
Fonte de luz → Lente condensadora → Lentes objetivas → Lente ocular 
Trajeto da luz 
Centralização do feixe de luz 
“Iluminação de Köhler” 
Iluminação perfeita 
Menos ocorrência de 
aberrações e irregularidades 
no trajeto luminoso 
 Objetiva (s) = próxima ao objeto 
 Corrige aberrações =  qualidade da imagem 
 
Aumentos: 4x / 10x / 20x / 40x / 100x (imersão) 
Projeta imagem real e invertida 
 Ocular (es) =  imagem projetada pela objetiva 
 Aumentos: 10x, 12x 
Aumento final 
4x = Vermelha 
10x = Amarela 
40x = Azul claro 
100x = Preta / branca 
Objetiva 
Planos de cortes 
 Imagem microscópio = bidimensional 
 Objeto de estudo = tridimensional 
Planos de cortes 
 Leia a etiqueta da lâmina material / corte / coloração 
 Examine a lâmina macroscopicamente pode-se obter muita 
 informação 
 Objetiva de menor aumento (panorâmica) 
 Ajustar área a ser observada, centralizando-a na platina 
 Objetivas de aumentos maiores 
Sequência de passos 
 Microscopia de Luz 
Microscopia convencional 
Microscopia de contraste de fase 
Microscopia de contraste interferencial 
Microscopia de campo escuro 
Microscopia de polarização 
Microscopia de fluorescência 
Microscopia confocal a laser 
 Microscopia eletrônica 
Microscopia eletrônica de 
transmissão 
Microscopia eletrônica de alta 
voltagem 
Microscopia eletrônica de 
varredura 
 Outros tipos de microscópio 
Microscopia de tunelamento quântico 
Microscopia de força atômica 
Tipos de Microscópios 
Princípios da Difração da Luz 
Anéis metálicos colocados no caminho da 
luz (Zerniké, 1950) 
Objetivas de contraste de fase: Ph (Phase) Retardo óptico 
e 
Refração da luz 
Microscopia de Contraste de fase 
Análise do material biológico sem coloração prévia: 
 
 1. Culturas de células 
 2. Exames parasitológicos 
 3. Esfregaços e Raspagens de mucosas (Consultórios) 
 4. Sangue 
 5. Protozoários de ambientes aquáticos 
 6. Algas 
 7. Bactérias 
Diferenças de índices 
de refração 
 
Sem coloração 
Bactérias 
Cultura de células: neurônios 
Aplicações da Microscopia de Contraste de fase 
Prismas ópticos posicionados no caminho da luz 
Microscopia de Contraste Interferencial 
Os prismas modificam a fase da onda luminosa 
Contraste com o meio em que se encontra o 
material a ser analisado 
Microscopia de Contraste Interferencial 
Produz imagem aparentemente tridimensional 
 Observação de materiais biológicos sem coloração: 
 
 1. Parasitologia: Interpretação de estruturas e apêndices dos parasitos 
(taxonomia) 
 2. Análise de massa seca celular – organização e compactação de material 
biológico 
 3. Monitoramento de culturas celulares 
Algas 
Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial 
Cultura Celular: macrófago Ácaro 
Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial 
 Os microscópios de campo 
escuro apresentam um tipo especial 
de condensador - inclina a luz de 
tal modo que ela não atravessa o 
objeto 
 
 A luz se dispersa 
 
 Apenas os feixes desviados pelo 
objeto percorrem o resto do sistema 
(objetivas e oculares) 
 
Microscopia de Campo Escuro 
É empregada para estudos de pequenos 
materiais: 
  Plâncton 
  Bactérias 
  Cristais 
  Estruturas subcelulares 
 (fimbrias e flagelos) 
  Grãos de pólen 
Microscopia de campo escuro 
da bactéria Leptospira spp 
Aplicações da Microscopia de Campo Escuro 
Propriedade física de 
algumas substâncias 
absorverem a luz, em um 
determinado 
comprimento de onda, e 
emitirem luz com 
comprimentos de onda 
maiores e níveis 
energéticos mais baixos 
Microscopia de Fluorescência 
Microscopia de fluorescência 
mostrando uma célula embrionária de 
Caenorhabditis elegans em divisão 
Baseia-se na: 
Fluorescência natural: 
Existem componentes celulares ou moleculares naturalmente 
fluorescentes 
Clorofila 
Lignina de parede vegetal 
Elastina 
Colágeno 
A fluorescência visível neste nudibranqueo é 
dupla: os pigmentos verdes próprios da lesma 
e as algas vermelhas no seu intestino Algas (clorofila) 
Outros componentes: 
Se ligam a substâncias fluorescentes → fluorocromos → emitem 
brilho contra fundo escuro 
Alaranjado de acridina 
(fluorocromo) 
Células do testículo de 
triatomíneos (barbeiro) Divisão celular 
 RNA - vermelho DNA - verde 
Devido a especificidade de cada tipo de filtro e devido ao 
desenvolvimento de vários corantes (fluorocromos) → 
muitas são as utilizações da microscopia de fluorescência 
Fluorocromos: 
Alaranjado de acridina 
Eosina 
DAPI 
Rodamina 
Fluoresceina 
Emitem brilho contra 
fundo escuro 
Aplicações da Microscopia de Fluorescência 
Aplicações da Microscopia de Fluorescência 
 
 Quantificação (Fluorometria): citoquímica normal e patológica 
 
 Imunofluorescência: conjugação de anticorpos a fluorocomos 
que permite identificação de moléculas específicas 
 
 Imunocitoquímica 
 
 Hibridação “in situ” (FISH): marca mRNA, diz atividade 
genética 
 
 Identificação de compostos naturalmente fluorescentes 
Aplicaçõesda Microscopia de Fluorescência 
 1987 - Disponível mundialmente 
 
 O microscópio confocal tem seu 
funcionamento baseado nos princípios da 
microscopia de fluorescência → Utiliza laser 
como fonte de luz 
 
 Permite a visualização: materiais 
espessos; corpos inteiros sem coloração 
prévia (vivos ou pré-fixados) 
 
 Reconstrução do objeto 
tridimensionalmente → Vários planos 
focais ou cortes ópticos (programas 
computacionais) 
Microscopia confocal a laser 
Aplicações da Microscopia confocal a laser 
1. Todas as possibilidades já descritas para a microscopia de 
fluorescência convencional 
 
2. Reconstrução 3-D de organismos microscópicos 
 
3. Aumento de sinais de fluorescência de estruturas subcelulares. Exs: 
microtúbulos, miofilamentos, filamentos intermediários e elementos 
finos da matriz extracelular 
 
Células em apoptose: 
condrócitos 
Células em prófase 
Aplicações da Microscopia confocal a laser 
Protozoário 
Macrófago 
Aplicações da Microscopia confocal a laser 
Grãos de Pólen 
Divisão celular / Fuso mitótico 
Aplicações da Microscopia confocal a laser 
Início: 
 
 Estudos do comportamento ondulatório dos elétrons 
Semelhantes a fótons 
num sistema de vácuo 
Primeiros experimentos: 
 
 Década de 1920 → Busch 
 (elétrons conduzidos por lentes eletromagnéticas) 
 
 1931 → Ruska → Primeiro M.E. → Poder de 
resolução: 0,5 nm → 25 mil vezes a capacidade do 
olho humano 
 
Microscopia eletrônica 
Ernst August 
Friedrich Ruska 
(1906-1988) 
Principais diferenças 
Fonte Luz 
(porção inferior) 
Elétrons 
(porção superior) 
Lentes Vidro Eletromagnéticas 
Lentes de aumento 
(principal) 
Objetivas e oculares Eletromagnéticas 
Suporte para 
amostra 
Lâmina de vidro Grade de metal 
(telinha)Cobre ou níquel 
Limite de 
resolução 
0,2 µ 0,0002 µ 
Formação da 
imagem 
Transparência e coloração Variações de densidade e 
contrastação 
Microscópio eletrônico 
de transmissão (MET) 
Microscópio de luz (ML) 
Microscopia de Luz e Microscopia Eletrônica 
Questões importantes: Ampliação e Resolução 
Microscopia eletrônica 
Microscópio Eletrônico de 
Transmissão (MET) 
Microscópio Eletrônico de 
Varredura (MEV) 
Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e 
de Varredura (MEV) 
Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) 
Microscópio eletrônico 
de transmissão (MET) 
Microscópio eletrônico 
de varredura(MEV) 
 Fixação 
(glutaraldeído / tetróxido) 
 
 Desidratação 
 
 Inclusão (resinas) 
 
 Cortes 
 
 Contrastação com 
metais pesados 
 
Principais etapas da preparação das amostras para MET 
Coloração negativa: 
vírus Tecido muscular 
Hepátócito: 
Complexo de Golgi 
Cílio 
Células epiteliais 
Microscopia Eletrônica de Transmissão 
 Revela feições topográficas da superfície (detalhes) 
 Imagens tridimensionais: 
 - Vermes 
 - Insetos 
 - Células livres (animais/vegetais) 
 - Embriões 
 - Fragmentos geológicos 
 Elétrons secundários / refletidos na superfície da amostra 
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) 
Scanning Electron Microscopy (SEM) 
Guelras de 
um peixe 
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) 
Preparação das amostras 
 Fixação (glutaraldeído / tetróxido de ósmio) 
 
 Desidratação 
 
 Secagem (“ponto crítico”) 
 
 Evaporação com ouro na 
 superfície a ser analisada 
 
 Não necessita de contrastação 
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) 
Title: “An Army of One" 
Category: Photo Microscopy 
Photographer: Freder Medina 
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)