Relatório de aula prática atividade da catalase

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOFÍSCIA
Professores: Luzimar G. Fernandez, Daniele Takahashi, Renato D. de Castro, Paulo R. Ribeiro
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA – UFBA
REDE NORDESTE DE BIOTECNOLOGIA – Renorbio
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOFÍSCIA
Relatórios de aulas práticas
Atividade da catalase
Diego da Silva Cunha
Salvador, BA
12 de Junho de 2017
ATIVIDADE DA CATALASE
Introdução
As enzimas são proteínas com atividade catalítica, e atuam em praticamente todas as reações que caracterizam o metabolismo celular, modificam velocidades de rações sem alterar o equilíbrio final, controlam reações reversíveis e irreversíveis e se fazem notar não só pela sua atividade, como pela sua especificidade por seus substratos. 
Normalmente, os substratos de uma determinada reação necessitam de um certo nível de energia (energia de ativação) para reagir. Em determinado momento, algumas moléculas estão casualmente em um estado de ativação mais alto do que outras e cruzarão o pico da energia de ativação. Esse processo é facilitado por enzimas que diminuem a energia de ativação. A ação enzimática está sujeita a inúmeros fatores sendo os mais importantes a temperatura, o pH, os ativadores (em geral eletrólitos), a concentração do substrato, a concentração da enzima e inibidores. 
A sua atividade catalítica depende da sua conformação protéica nativa. Essa atividade se perde caso uma enzima seja desnaturada, ou seja, dissociada em subunidades. Se a enzima não for totalmente desnaturada, esta poderá ser renaturada e sua atividade recuperada. A renaturação ocorre graças a tendência da molécula da enzima reassumir sua conformação habitual. Contudo, condições desnaturantes incluem temperaturas elevadas, que por aumentar a vibração dos átomos constituintes promovem o rompimento de ligações que mantém a estrutura tridimensional da enzima. Os extremos de pH também causam o desnovelamento das estruturas moleculares da enzima. A teoria de reações catalisadas por enzimas foi proposta por Michaelis e Menten.
Nas enzimas há um ou mais centros ativos. Por outro lado, a formação do complexo enzima-substrato costuma gerar outros centros ativos sensíveis ao ataque de várias substâncias, que se ligam a esses centros ativos e são denominados de inibidores enzimáticos, pois impedem a enzima de realizar seu papel funcional, bloqueando a sequência de ações. 
A catalase (CAT) foi uma das primeiras enzimas estudadas, em 1923, Warburg sugeriu que a catalase continha ferro, através de um estudo de observação de um complexo enzima (substrato). Posteriormente descobriu-se que a catalase decompõe o peróxido de hidrogênio, um produto tóxico ao organismo, em água e oxigênio molecular. Ela é uma enzima tetramérica que contém um grupamento heme em cada subunidade e está presente em todos os organismos aeróbicos, sendo encontrada em organelas subcelulares chamadas peroxisomas principalmente, no sangue (eritrócitos), no fígado e nos rins, como também em células vegetais, estando presentes nos peroxissomos, glioxissomos e organelas relacionadas onde enzimas geradoras de peróxido estão localizadas. Mas também podem estar presentes em mitocôndrias e no citoplasma. Aparentemente esta enzima tem função protetora, já que elimina o peroxido de hidrogênio que é tóxico para o organismo.
A CAT apresenta um peso molecular de 240.000 KDa em célula animal e em plantas existem pelo menos três isoformas de catalase distintas, que diferem em termos de localização e regulação. A catalase decompõe o H2O2 em água e gás oxigênio, evitando que as células sofram danos oxidativo, sendo importante na remoção de peróxido de hidrogênio, que é gerado pelas oxidases envolvidas na β-oxidação de ácidos graxos, fotorrespiração e catabolismo de purinas. É altamente especifica, mas, pode atuar também sobre substratos diferentes de H2O2. Sendo o péroxido de hidrogênio uma substancia muito reativa e letal para a célula, é rapidamente removido pela catalase, que o decompõe em água e oxigênio. Esta enzima é responsável pela rápida decomposição (com efervescência) do peróxido de hidrogênio aplicado a ferimentos. A catalase é capaz de decompor 1.200.000 moléculas de H2O2 por minuto.
Objetivos
Determinação da atividade da Catalase no extrato de proteínas totais através da avaliação da decomposição do peróxido de hidrogênio a 240 nm.
Materiais e Métodos 
A prática foi realizada no Laboratório de Bioquímica, Biotecnologia e Bioprodutos (LBBB), no dia 31 de maio de 2017. 
Foi configurado o espectrofotômetro para leitura da adsorbância no comprimento de onda de 240 nm, durante a leitura de 180 segundos (3min), intervalos de 10 em 10 segundos. Para o branco foi pipetado 920 uL do tampão fosfatado de potássio-EDTA, na cubeta de plástico UV/quartzo. Foi pipetado 70 uL da amostra e acrescido na cubeta contendo 10 uL de água Miliq. 
As cubetas contendo as amostras foram inseridas no aparelho de leitura, para o preparo da amostra, foi colocado na cubeta 920 uL do tampão fosfato de potássio-EDTA, 70 uL da amostra e 10 uL de peróxido de hidrogênio (3%). A cubeta foi colocada novamente no aparelho para realizar a leitura de absorbância a 240 nm, esperar os 180 segundos de leitura da absorbância, observando o decaimento da concentração do peróxido de hidrogênio. 
 
Resultados
Os dados foram inseridos em planilha do software Excel, e plotado o gráfico 1, representando a Atividade da Catalase. Foi verificado que a Tratamento 0 (semente de mamona fresca) apresentou o menor valor de atividade da Catalase, seguido por T2 (semente de mamona sem controles) e T3 (semente de mamona com controles: 14% de umidade e 16 °C). Foi possível verificar que as sementes do tratamento 0 sofreram mais com o acumulo de H2O2, sugerindo uma maior degradação das células. 
Segundo Vaidyanathan et al., (2003) e Eyidogan e Oz, (2007) o decréscimo na atividade da CAT promove acúmulo de H2O2, aumentando a peroxidação de lipídios e danos às membranas de plantas sob estresse. Desta forma, o aumento na atividade da CAT é importante para eliminar o acúmulo de H2O2 e assim reduzir a peroxidação de lipídios, o que foi possível observar no Tratamento 3.
Gráfico 1. Atividade da Catalase. 
Questões
Qual a função da enzima catalase e qual a sua importância para os organismos (animais e plantas)?
A catalase é uma enzima intracelular capaz de decompor o peróxido de hidrogênio (H2O2). Ela está presente nos organismos sendo de grande importância, pois sem a mesma as células iriam sofrer danos oxidativos. 
Construir gráficos segundo a equação de Michaelis-Menter e L. Burk para a catalase (utilizando os dados experimentais).
Em resultados.
Como determinar o KM e o Vmáx para a catalase?
A atividade de uma enzima é geralmente descrita através de (Vmax) e também da constante de Michaelis-Menten (KM), que representa a concentração do substrato detectado a uma velocidade de reação igual a metade de (1/2*Vmax). Isto pode verificar-se ao substituir Km = [S] na equação de Michaelis-Menten. Se o passo para determinação da velocidade for lento, quando comparado com a dissociação do substrato (k2 << k-1), então a constante de Michaelis Km é aproximadamente à constante de dissociação do complexo ES, embora tal situação seja relativamente rara.
Cada enzima possui um (KM) característico (kcat) para um dado substrato, e este parâmetro é muitas vezes usado para demonstrar a força de ligação de um substrato à enzima.
Quais são os fatores que interferem na atividade enzimática? Explique cada um deles.
Os fatores que influenciam na atividade enzimática são: a temperatura, o pH e o tempo.
A Temperatura é um dos principais fatores, seguindo o comportamento das reações químicas, a velocidade da atividade enzimática aumenta quando se aumenta a temperatura. Porém, a velocidade da reação aumentaaté um máximo, após determinada temperatura a velocidade declina rapidamente, mesmo aumentando a temperatura. Isso ocorre porque a estrutura tridimensional das enzimas se rompe, impossibilitando-a de formar o complexo enzima-substrato. Pode-se dizer que a velocidade de reação aumenta ou diminui por um fator de 2 a cada variação de 10 °C na faixa de 10° a 70 °C.
 O pH assim como no caso da temperatura, existe um valor para atividade ótima o qual, após ele ocorre um rápido decréscimo.
O Tempo, as atividades enzimáticas são influenciadas diretamente pela ação do tempo. Quanto mais tempo a enzima estiver em contato com o substrato, mais produtos serão produzidos, enquanto houver substrato.
Referências
EYIDOGAN, F.; OZ, M.T. Effect of salinity on antioxidant responses of chickpea seedlings. Acta Physiology Plant, v.29, p. 448-493, 2007. http://dx.doi.org/10.1007/s11738-007- 0059-9.
VAIDYANATHAN, H.; SIVAKUMAR, P.; CHAKRABARSTY, R.; THOMAS, G. Scavenging of reactive oxygen species in NaCl - stressed rice (Oryza sativa L.) - differential response in salt-tolerant and sensitive varieties. Plant Science, v.165, n. 10, p.1411-1418, 2003. http://www.sciencedirect.com/science/article/ pii/S0168945203003704.