Relatório de aula prática Eletroforese de DNA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOFÍSCIA
Professores: Luzimar G. Fernandez, Daniele Takahashi, Renato D. de Castro, Paulo R. Ribeiro
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA – UFBA
REDE NORDESTE DE BIOTECNOLOGIA – Renorbio
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOFÍSCIA
Relatório de aula prática
Eletroforese de DNA
Diego da Silva Cunha
Salvador, BA
12 de Junho de 2017
ELETROFORESE DE DNA
Introdução
A eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, sendo que as moléculas de menor massa irão migrar mais rapidamente que as de maior massa. Em alguns casos, o formato das moléculas também influi, pois algumas terão maior facilidade para migrar pelo gel.
A eletroforese normalmente é utilizada para separar moléculas de DNA, RNA e proteínas. Para DNA, inicialmente no processo é necessário que o DNA do organismo em estudo seja quebrado em pedações que possam migrar na eletroforese, isto pode ser feito mecanicamente (por nebulização) ou com uso de enzimas de restrição). Os fragmentos de DNA, por serem normalmente negativos, irão correr para o pólo positivo. O resultado será sempre um conjunto muito grande de fragmentos com tamanhos diferentes, que formarão uma faixa borrada no gel, quando tentamos verificar o resultado da corrida eletroforética.
O tipo de matriz que é usada (agarose ou poliacrilamida) depende do tamanho dos fragmentos de DNA que se pretende separar e visualizar. Devido à diferença no tamanho dos poros dessas matrizes, utiliza-se normalmente o gel de agarose para a separação de fragmentos que variam de 0,2 kb a 50 kb (1 kb = 1000 pares de bases) e o gel de poliacrilamida para separação de fragmentos pequenos, de até 1kb. Alternativamente para a resolução de fragmentos superiores a 1 kb podese utilizar a agarose com baixo ponto de fusão (Low Melting) que é um tipo de agarose derivada de síntese orgânica.
Na separação de proteínas se utiliza de forças eletromagnéticas e eletriendosmóticas presentes no sistema. As frações separadas são visualizadas a partir de corantes sensível a proteínas. Os resultados devem ser sempre expressos de forma percentual e de concentração das diversas frações e em forma gráfica.
Objetivos
Preparar um gel de agarose na concentração de 1%;
Realizar a eletroforese utilizando um padrão de peso molecular para DNA;
Observar a localização das bandas no gel e correlacionar com o seu peso molecular.
Materiais e Métodos 
A atividade foi realizada no Laboratório de Bioquímica, Biotecnologia e Bioprodutos (LBBB), no dia 31 de maio de 2017. Foi pesado 1 g de agarose em um erlenmeyer de 250 mL, e adicionado 100 mL de tampão TBE 1x. Logo em seguida, o erlenmeyer foi levar ao micro-ondas e aquecido até que a agarose fosse dissolvida completamente.
Foi preparado o suporte para polimerização do gel enquanto a temperatura da solução de agarose a 1% estava diminuindo. Após a solução de agarose a 1% chegar a temperatura de aproximadamente 55 °C foi adicionado 3,0 μL de brometo de etídio (10 μg/μL), a concentração de brometo de etídio no gel foi de 0,3 μg/mL. Logo em seguida, foi adicionado à solução de agarose a 1% e brometo de etídio na cuba previamente preparada e aguardar a polimerização do gel. Após a polimerização, foi retirado o pente, posicionar o gel na cuba e adicionar o tampão TBE 1x até que o gel esteja completamente submerso na solução tampão. No primeiro poço, foi pipetado 5 μL do padrão de peso molecular para DNA (bandas entre 50 e 750 pb e uma banda adicional de 2642 pb). Em seguida, foram ligados os cabos da cuba de eletroforese a fonte de eletroforese e realizada a corrida a 90 mA durante 60 min.
Após a corrida o gel foi retirado da cuba e os padrões das bandas foram analisados com auxílio de um fotodocumentador.
Resultados
A corrida de gel foi realizada com sucesso, sendo demonstrado a importância da atividade e a maneira como deve ser realizada em laboratório e os cuidados tomados com relação ao manuseio dos equipamentos, e produtos químicos utilizados como, o Brometo de Etídeo. No final da prática foi possível obter com auxílio de um fotodocumentador a imagem dos produtos gerados da corrida. Verificou que a banda de DNA de E. coli ficou entre 150-200 após a corrida. 
Figura 1. Amplificação de DNA total de bactéria E. coli (RcHSP1) e produto de PCR.
A técnica da Reação em Cadeia da DNA Polimerase (PCR, Polymerase Chain Reaction) foi desenvolvida em 1985. A PCR permite a produção de grandes quantidades de um determinado segmento de DNA a partir de apenas uma molécula de DNA sem haver a necessidade de introduzir esta molécula de DNA em bactérias. 
As duas tecnologias que aprimoraram e simplificaram a técnica de PCR foram a utilização da DNA Polimerase termoestável isolada de Thermus aquaticus (Taq DNA Polimerase) em um tampão que permite a síntese de DNA e que permanece enzimaticamente ativa à temperatura de desnaturação do DNA (meia-vida de 40 minutos à 94 - 95°C). A Taq DNA Polimerase é formada por uma única cadeia polipeptídica com um peso molecular de 95 kD. Esta enzima tem máxima atividade à temperaturas em torno de 75°C e pH 9. Uma unidade enzimática é definida como a quantidade de enzima necessária para catalizar a incorporação de 10nmol de dNTP durante 30min à 74°C. E a outra foi, o desenvolvimento do termo-ciclador programável que permitiu o aquecimento e resfriamento das amostras automaticamente e, deste modo, eliminou o trabalho tedioso de ter de transferir os tubos entre blocos de aquecimento de diferentes temperaturas.
Por fim a prática foi de grande importância para os alunos, pois foi possível demonstrar de forma prática como deve ser realizado os procedimentos de Eletroforese e as aplicações que a mesma pode ser empregada. 
Questões
Quais são as propriedades dos ácidos nucleicos utilizadas para sua detecção e separação?
Os métodos de manipulação dos ácidos nucleicos são baseados em suas propriedades intrínsecas, ou seja, o fato de serem naturalmente carregados negativamente devido à presença do grupo fosfato. O outro fator se trata do seu tamanho. 
Qual a carga dos ácidos nucleicos e qual constituinte é responsável por conferir essa carga?
Os ácidos nucleicos possuem carga negativa em pH neutro e, quando colocados em um campo elétrico entre eletrodos, migrarão em direção ao eletrodo positivo. Os fragmentos de ácido nucleicos menores deslocam-se mais que os maiores em uma separação eletroforética. Isso ocorre, devido essas moléculas apresentarem um grupo fosfato em sua constituição
Qual a função da agarose e do brometo de etídio na separação e detecção do DNA?
A concentração da agarose desempenha papel importante na separação eletroforética, pois determina a porosidade do gel, que por sua vez, influencia diretamente na capacidade de migração das moléculas de DNA. Portanto, o tamanho dos poros desta matriz é inversamente proporcional à concentração de agarose utilizada e diretamente proporcional ao tamanho dos fragmentos de DNA que se deseja separar.
Vale ressaltar que a agarose, apesar de apresentar um custo elevado, pode ser reciclada e reutilizada em eletroforese analítica. Para isso é necessário descontaminá-la dos resíduos de brometo de etídio, equilibrá-la em água, desidratá-la e transformá-la novamente em pó (REINIGER et al., 2004).
A mobilidade dos fragmentos de DNA é influenciada pela presença do brometo de etídeo. O fato desse agente se intercalar entre os pares de bases provoca mudanças na conformação e na flexibilidade da molécula de DNA. Na ausência de brometo as moléculas circulares superenoveladas (forma I) migram mais rápido do que as moléculas lineares (forma III) de mesma massa molecular. Já as moléculascirculares relaxadas (forma II) migram mais lentamente do que as outras duas isoformas topológicas.
Na presença de brometo de etídeo os superenovelamentos negativos (geralmente encontrados no DNA de procarioto) são gradualmente removidos, causando a diminuição na mobilidade do DNA. Porém, altas concentrações de brometo acarretam na formação de superenovelamento positivo e consequente aumento da mobilidade das moléculas. Além disso, a corrida da forma linear é reduzida em cerca de 15% quando comparada a migração da mesma molécula na ausência do agente intercalante. Assim, dependendo do objetivo do experimento o uso de altas concentrações do brometo de etídeo é uma estratégia que permite separar a forma circular superenovelada das formas circular relaxada e linear.
De acordo com o resultado observado no fotodocumentador, como estão dispostas as bandas do padrão de peso molecular?
Os grupos de moléculas de mesmo tamanho que migram na matriz de agarose assumem a forma do poço e constituem as formas chamadas de bandas de DNA. Em outras palavras as bandas ficam dispostas de acordo com o peso molecular, sendo as maiores em cima, e as de menor peso mais a baixo. 
Referências
CAMPBELL, M.K.; FARRELL, S.O. Bioquímica. v. 2. 5. ed. São Paulo: Thomson Learning, 2007.
LEE, P.Y.; COSTUMBRADO, J.; HSU, C.Y.; KIM, Y.H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments, v. 20, p. 3923, 2012.
MARTINEZ, E.R.M.; PAIVA, L.R.S. Eletroforese de ácidos nucleicos: uma abordagem para o ensino de genética. Genética na Escola, v. 03.01, p. 43-48, 2008.
PINHATI, F.R. Eletroforese de DNA: Dos Laboratórios de Biologia Molecular para as Salas de Aula. Química nova escola, Vol. 37, N° 4, p. 316-319, 2015.
REINIGER et al. Reciclagem de agarose em laboratórios de biologia molecular. Ciência Rural, v. 34, n.5, set-out, 2004.