Relatório de aula prática sobre extração de proteínas totais

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOFÍSCIA
Professores: Luzimar G. Fernandez, Daniele Takahashi, Renato D. de Castro, Paulo R. Ribeiro
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA – UFBA
REDE NORDESTE DE BIOTECNOLOGIA – Renorbio
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOFÍSCIA
Relatórios de aulas práticas
Extração e quantificação de proteínas totais
Diego da Silva Cunha
Salvador, BA
12 de Junho de 2017
EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS
Introdução
As proteínas existentes em todas as formas de vida são construídas a partir de 20 aminoácidos. A natureza das proteínas é determinada pelo tipo de aminoácidos que as constituem e pela ordem em que estes aminoácidos se ligam. Cada um dos aminoácidos tem diferentes destinos metabólicos, vias metabólicas, desempenham diferentes atividades, e atual em diversos órgãos.
Quando os aminoácidos de origem alimentar são absorvidos, o corpo toma uma série de decisões complexas no que diz respeito ao destino desses aminoácidos. 
A maioria das proteínas encontradas nos seres vivos são formadas por α-L-aminoácidos. Os α-D-aminoácidos aparecem somente em certos antibióticos peptídicos e em peptídeos componentes da parede de algumas bactérias. Um α-aminoácido é constituído de um grupamento amina, uma carboxila, átomo de H e um radical orgânico (grupamento R), que diferencia os aminoácidos, a depender de sua estrutura, tamanho e carga elétrica. Além disso, os diferentes grupamentos "R" encontrados nos aminoácidos influenciam na estrutura, na funcionalidade e nas propriedades das proteínas individuais.
 Apesar de muitas proteínas conterem outras substâncias, além dos aminoácidos, a estrutura tridimensional e muitas das propriedades biológicas das proteínas são determinadas, em grande parte, pelos tipos de aminoácidos presentes em sua molécula, a ordem em que eles estão unidos entre si, na formação da cadeia polipeptídica e, ainda, pela inter-relação espacial de um aminoácido com o outro. Os vinte α-L-aminoácidos chamados de “aminoácidos padrões” existentes quase nunca ocorrem em quantidades iguais em proteínas. Alguns aminoácidos podem ocorrer apenas uma única vez por molécula ou não estão presentes em dado tipo de proteína, outros podem ocorrer em grande número. 
As proteínas que apresentam uma ou mais cadeias polipeptídicas formando estruturas compactas, geralmente são solúveis, denominam-se proteínas globulares. As proteínas fibrosas possuem forma alongada, geralmente são insolúveis em meio aquoso e desempenham um papel basicamente estrutural nos sistemas biológicos. Ao contrário das globulares que são formadas pela repetição de módulos, o que possibilita a construção de grandes estruturas, com organização que origina fibras. 
Ao descrever a estrutura de uma proteína, particularmente uma proteína globular é conveniente considerar a sua complexidade através de suas estruturas, podendo apresentar. Uma estrutura primária, que é a sequência de aminoácidos ao longo da cadeia polipeptídica, específica para cada proteína. A estrutura secundária, que é a formação de estruturas regulares pela cadeia polipeptídica, podendo ser a-hélice ou folha pregueada. Ou uma estrutura terciária, que é descrita com o dobramento final da cadeia polipeptídica por interação de regiões com estrutura regular. E por fim, a estrutura quaternária descrita como a associação de duas ou mais cadeias polipeptídicas de estrutura terciária.
As proteínas exercem na célula uma grande variedade de funções e desempenham papéis extremamente importantes, na maioria dos processos biológicos, e podem ser divididas em dois grupos: Dinâmicas, responsáveis pelo transporte, defesa (anticorpo), catálise de reações, hormônios, neurotransmissores, controle do metabolismo e contração. E as estruturais, que promovem a sustentação estrutural da célula e dos tecidos, como exemplo as o colágeno e elastina. 
A quantificação precisa de proteínas é essencial para todo tipo de experimento que trabalha com elas, em várias áreas como biologia molecular e celular, bioquímica, biologia do desenvolvimento e neurociências. Desde o século passado métodos de quantificação diferentes foram desenvolvidos, devido a sua ampla utilização.
A quantificação total de proteínas engloba métodos tradicionais como absorbância de UV em 280 nm, ensaio de ácido bicinconínico (BCA), Bradford e método de Lowry. Os reagentes são vendidos normalmente como kits, mais práticos, desenvolvidos pelos fornecedores comerciais. As quantificações envolvendo apenas uma proteína específica incluem o teste ELISA, western blot, espectrometria de massa, dentre outros.
Objetivos
Realizar extração de proteínas a partir de tecidos vegetais;
Quantificar proteínas totais em uma amostra biológica por espectrofotometria – método de Bradford.
Materiais e Métodos
A prática foi realizada no laboratório de Bioquímica, Biotecnologia e Bioprodutos (LBBB), no dia 31 de maio de 2017. Foi triturado o material de trabalho em N2 líquido até que se transformar em pó fino, logo em seguida se pesou 0,1 g da amostra triturada. Foi adicionada a solução de extração (tampão PBS) no microtubo contendo o material triturado. Logo após, a amostra foi homogeinezada com auxílio de um vortex. Em seguida, foi centrifugado a amostra a 14.000 rpm por 15 min, 4 °C. Utilizando uma micropipeta se coletou o sobrenadante (material que contém as proteínas) e o transferiu para outro eppendorf. 
Em seguida determinou-se a concentração de proteínas utilizando a solução de abumina bovina como padrão e leitura da absorbância a 595 nm em espectrofotômetro, como descrito por Bradford (1976). 
Resultados
Quando quisermos saber a concentração de uma solução, acha-se a densidade ótica leva-se este dado a curva, encontrando-se imediatamente sua concentração. Logo abaixo segue um Gráfico contendo a curva confeccionada com os dados da amostra. 
Gráfico 1. Curva analítica e determinar a concentração de proteínas totais das amostras analisadas
Questões
Qual a importância das proteínas nos processos biológicos?
As proteínas têm papel fundamental em praticamente todos os processos biológicos. Devido a sua diversidade, as proteínas podem assumir muitas configurações moleculares e desta forma ter participação em variados processos em células e tecidos.
Qual a importância da trituração do material biológico com nitrogênio líquido e do uso de tampão na extração de proteínas?
O azoto líquido, popularmente conhecido como nitrogênio líquido, é uma substância líquida produzida de maneira industrial, por meio de um método de destilação fracionada. Possibilita, por meio do processo de imersão, o congelamento de células e outros materiais. 
Qual a finalidade da curva analítica para a quantificação de proteínas e em que se baseia o método de Bradford?
O método de Bradford é uma técnica para a determinação de proteínas totais que utiliza o corante de "Coomassie brilliant blue" BG-250. Este método é baseado na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação, a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm.
Traçar a curva analítica e determinar a concentração de proteínas totais das amostras analisadas?
Segue logo acima em resultados.