B01 Espectrofotômetro

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UERJ
 INSTITUTO DE QUÍMICA
 DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS BIOQUÍMICOS
 BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL
Professora: Márcia Monteiro Machado Gonçalves
Prática n° 1: ESPECTROFOTOMETRIA
OBJETIVO
Treinamento na utilização de técnicas espectrofotométricas.
Elaborar uma curva padrão para determinação da concentração de leveduras numa solução aquosa.
MATERIAL UTILIZADO
Balão volumétrico de 50 mL; 100 mL; 200 mL; 250mL; 500mL
Cubetas retangulares de 1 cm de largura
Pipeta de 1mL
Espectrofotômetro
PROCEDIMENTOS
Preparou-se uma suspensão de fermento biológico contendo 15 g de fermento em 10 mL de água destilada. Em seguida, tomou-se 5 quantidades de 1 mL desta suspensão e diluiu em 1/50, 1/100, 1/200, 1/250 e 1/500 no balão volumétrico. 
Utilizou-se água destilada como branco numa das cubetas para “zerar” o espectrofotômetro e na outra cubeta a solução diluída. Anotou-se a absorbância a um comprimento de onda de 570 nm de cada solução para se construir a curva padrão.
Em seguida, fez-se o mesmo procedimento para as suspensões A e B de concentrações desconhecida.
RESULTADOS 
4.1. Cálculo das concentrações das soluções
Cálculos das diluições a partir de 1 mL de uma solução contendo 15g de fermento em 100 mL de água destilada:
C1 = 0,15 / 0,05 = 3,00 g/L			Onde Ci = Concentração de cada diluição
C2 = 0,15 / 0,10 = 1,50 g/L
C3 = 0,15 / 0,20 = 0,75 g/L
C4 = 0,15 / 0,25 = 0,60 g/L
C5 = 0,15 / 0,50 = 0,30 g/L
4.2. Curva padrão
Na tabela 01, encontram-se a leitura das absorbâncias em relação a cada concentração feita após a diluição a 570 nm.
				Tabela 01: Leitura das absorbâncias
	Concentração (g/L)
	Absorbância
	3,00
	0,565
	1,50
	0,340
	0,75
	0,180
	0,60
	0,135
	0,30
	0,065
A partir dos valores da tabela 01, pode-se construir o gráfico 01: absorbância x Concentração, uma curva padrão de comprimento de onda 570 nm. 
 Gráfico 01: Curva padrão de 570 nm: Absorbância x Concentração
4.3. Cálculo do coeficiente angular da reta, absortividade k
Observou-se a partir da tabela 01 e do gráfico 01 que quanto maior é a concentração, maior é a absorbância, isto é, a absorbância está diretamente proporcional à concentração conforme a equação 1 abaixo. 
Abs = kCd		(1)
Onde: 
k = absortividade
C = Concentração 
d = comprimento do caminho 
A absorbância também é diretamente proporcional ao comprimento da cubeta, porém nesta prática utilizou-se cubetas de comprimento constante de 1,0 cm conforme a equação 2. 
Como d = 1,0 cm ( Abs = kC 		(2)
Comparando a equação 2 com y = ax + b, pois no gráfico deu-se uma reta temos:
Abs = k . C + 0
 y = a . x + b
Observou-se pela equação da reta no gráfico 01 que a absortividade (coeficiente angular):
 k = 0,183 L/g.cm
Sendo então a equação da reta: 
 Abs = 0,183C + 0,0319	 	(3)
4.2. Cálculo das concentrações das suspensões desconhecidas A e B.
Absorbâncias lidas das suspensões desconhecida:
A = 0,265
B = 0,035
Utilizando a equação 3, tem-se:
Suspensão A ( Abs = 0,183CA + 0,0319
		 0,265 = 0,183 CA + 0,0319
		 CA = 1,27 g/L
Suspensão B ( Abs = 0,183CB + 0,0319
		 0,035 = 0,183 CB + 0,0319
		 CB = 0,02 g/L
Então as concentrações aproximadas são:
 Solução A: 1,27 g/L
 Solução B: 0,02 g/L
DISCUSSÕES DOS RESULTADOS
A partir do gráfico 01 obteve-se a equação da reta y = 0,183x + 0,0319 (y = ax + b). O termo b deveria ser igual a 0 (zero) em relação a equação 2, porém obteve-se uma valor de 0,0319. Isso pode-ser ser explicado pelas variáveis comuns que influenciam o espectro de absorbância de uma substância incluindo a natureza do solvente, o pH da solução, a temperatura, as concentrações e a presença de substâncias interferentes. Outros fatores que podem ter influenciado foram as medidas tomadas na pipeta, a limpeza e manuseio das cubetas, a escala limitada do espectrofotômetro. 
Nesse caso o que mais pode ter influenciado foi a escala limitada do espectrofotômetro. Uma forma de amenizar essa influência seria variando o comprimento das cubetas, pois seu comprimento é diretamente proporcional a absorbância como foi dito anteriormente.