B09 Ação Enzimática Influência do Tempo

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UERJ
 INSTITUTO DE QUÍMICA
 DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS BIOQUÍMICOS
 BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL
Professora: Márcia Monteiro Machado Gonçalves
Prática n° 9: Ação Enzimática – Influência do tempo
OBJETIVO
- Determinar a velocidade de reação e calcular a atividade da preparação enzimática.
MATERIAL UTILIZADO
- Vidraria: Becher, tubos de ensaio, pipetas, cubetas, tubos Folin-Wu. 
- Reagentes/soluções: Solução de sacarose 0,5 M em tampão de acetato 0,05 M, pH 4,7.
			Solução de enzima obtida por extração com NaCl de fermento biológico.
			Reagente do DNS (ácido 3,5 dinitro salicílico em meio alcalino).
			Solução padrão de glicose 5,0 µmoles/mL.
- Espectrofotômetro
PROCEDIMENTOS
3.1. Obtenção da enzima invertase
Pesou-se 15 g de fermento biológico e 15 g de NaCl. Misturou-se os dois sólidos por 10 minutos e centrifugou-se a mistura por 20 minutos a uma rotação aproximada de 2500rpm. Recolheu-se o sobrenadante e diluiu-se na proporção de 1:250 com água destilada.
3.2. Curva padrão da glicose
 Adicionou-se aos tubos de Folin-Wu 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mL da solução de glicose 5,0 µmoles/mL e completar para 1,0 mL com água destilada. Em seguida, adicionou-se em cada tubo 1,0 mL do reagente DNS. Aqueceu-se por 5 minutos e resfriaram-se os tubos em água corrente. Posteriormente, completou-se o volume de 12,5 mL com água destilada e homogeinizou-se. Em seguida, leu-se as absorbâncias das soluções em espectrofotômetro a 540 nm, tomando como referência o branco (0 mL da solução padrão de glicose 5,0 µmoles/mL. 
3.3. Influência no tempo de reação (T=ambiente)
Marcou- se 6 tubos de Folin-Wu com os tempos de reação a serem avaliados: 1, 2, 3, 5, 10 e 15 minutos. Adicionou-se 5,0 mL da solução de sacarose 0,5M em cada tubo. Em seguida, adicionou-se 5,0 mL da solução da enzima obtida no item 3.1 e disparou-se o cronômetro para cada tempo de reação a ser avaliado. Imediatamente após finalizado o tempo de reação, adicionou-se 1,0 mL do reagente DNS em cada tubo e aqueceu-os em banho-maria por 5 minutos. Posteriormente, completou-se o volume de 12,5 mL com água destilada e homogeinizou-se. Em seguida, leu-se as absorbâncias das soluções em espectrofotômetro a 540 nm, tomando como referência o branco (0 mL da solução padrão de glicose 5,0 µmoles/mL. Para a leitura, os tubos de 10 e 15 minutos forma diluídos de 1:5.
 
RESULTADOS 
4.1. Curva padrão da glicose
Cálculo das concentrações de glicose
C1 = 0,2 . 5,0 / 1,0 = 1,0 µmoles/mL
C2 = 0,4 . 5,0 / 1,0 = 2,0 µmoles/mL
C3 = 0,6 . 5,0 / 1,0 = 3,0 µmoles/mL
C4 = 0,8 . 5,0 / 1,0 = 4,0 µmoles/mL
C5 = 1,0 . 5,0 / 1,0 = 5,0 µmoles/mL
A tabela 1 tem-se os tubos utilizados para a curva padrão e as respectivas obsorbâncias
Tabela 1: Resultados para a curva padrão. 
	Tubo
	Sol. Glicose 
	Água
	[Glicose] ((mol/mL)
	Absorbância
	Branco
	0
	1,0
	-
	-
	1
	0,2
	0,8
	1,0
	0,055
	2
	0,4
	0,6
	2,0
	0,100
	3
	0,6
	0,4
	3,0
	0,170
	4
	0,8
	0,2
	4,0
	0,240
	5
	1,0
	0
	5,0
	0,290
Gráfico da curva padrão a partir da tabela 1
Figura 1: gráfico da curva padrão da glicose
4.2. Influência no tempo de reação (T=ambiente).
Cálculo da concentração de produto formado com o tempo
A partir do gráfico da figura 1 tem-se Abs = 0,061C – 0,012
Para t = 1min
Abs = 0,061C – 0,012
0,140 = 0,061C - 0,012
C = 2,49 (mol/mL
Para t = 2min
Abs = 0,061C – 0,012
0,300 = 0,061C - 0,012
C = 5,11 (mol/mL
Para t= 3min
Abs = 0,061C – 0,012
0,500 = 0,061C - 0,012
C = 8,39 (mol/mL
Para t= 5min
Abs = 0,061C – 0,012
0,800 = 0,061C - 0,012
C = 13,31 (mol/mL
Para t = 10min
Abs = 0,061C – 0,012
0,240 = 0,061C - 0,012
C = 4,13 (mol/mL (x fator de diluição)
C = 4,13 x 5 = 20,65 (mol/mL
Para t = 15min
Abs = 0,061C – 0,012
0,310 = 0,061C - 0,012
C = 5,28 (mol/mL (x fator de diluição)
C = 5,28 x 5 = 26,4 (mol/mL
Na tabela 2 tem-se o tempo e suas respectivas concentrações encontradas a partir do gráfico da figura 1.
Tabela 2: Resultado da concentração do produto formado em relação ao tempo
	Tempo (minuto)
	Absorbância (540nm)
	[produto] ((mol/mL)
	1
	0,140
	2,49
	2
	0,300
	5,11
	3
	0,500
	8,39
	5
	0,800
	13,31
	10
	0,240
	20,65
	15
	0,310
	26,40
Gráfico de produto formado por tempo
A partir da tabela 2 pôde-se construir o gráfico de produto formado ((mol/mL) por tempo (min).
Figura 2: Gráfico do produto formado pelo tempo
Cálculo da velocidade inicial da reação quando ΔP/Δt é constante
A velocidade inicial quando ΔP/Δt é constante é o coeficiente da reta indicado no gráfico da figura 2, y = 2,763x – 0,1723. 
Então v0 = 2,7263 µmol/mL.min. 
Cálculo da atividade da preparação enzimática 
Unidade padrão (U) de uma enzima é a quantidade de enzima que catalisa a formação de 1 µmol de produto por minuto sob a condição definida. Neste caso considerar U= 1 µmol de glicose/min a T=ambiente em pH = 4,7.
1 µmol/min -----------------U
2,7263 µmol/mL.min ----- x				x = 2,7263 U/mL
CONCLUSÕES
A determinação da velocidade inicial da reação é de extrema importância, pois ela nos fornece a taxa da conversão de substrato em produto. 
A velocidade da reação catalisada por uma enzima é aumentada devido ao abaixamento da energia de ativação necessária para converter o substrato no produto. O aceleramento da reação pode ser da ordem dos milhões de vezes. Num dado momento t a atividade catalítica é dada pelo declive da curva nesse tempo t. À medida que o tempo de ensaio aumenta diminui a velocidade e esse fato pode ser causado pela diminuição de concentração de reagentes (que se vão consumindo), pelo aumento de concentração de produtos (que podem tornar significativa a velocidade da reação inversa) ou/e simplesmente porque a enzima é instável nas condições de ensaio.