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MMAANNUUAALL DDEE AANNDDRROOLLOOGGIIAA EE MMAANNIIPPUULLAAÇÇÃÃOO DDEE SSÊÊMMEENN EEQQUUIINNOO PPRROOFF.. DDRR.. FFRREEDDEERRIICCOO OOZZAANNAAMM PPAAPPAA PPRROOFF.. DDRR.. MMAARRCCOO AANNTTOONNIIOO AALLVVAARREENNGGAA DDRR.. JJOOSSÉÉ AANNTTOONNIIOO DDEELLLL’’AAQQUUAA JJRR.. MMSS.. GGAABBRRIIEELL AAUUGGUUSSTTOO MMOONNTTEEIIRROO 2011 05-12 www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 2 ÍNDICE 1. ANATOMIA DO SISTEMA GENITAL MASCULINO EQÜINO 04 2. ENDOCRINOLOGIA DA REPRODUÇÃO DO GARANHÃO 05 3. PATOLOGIAS DO SISTEMA REPRODUTIVO DO GARANHÃO 07 3.1 PÊNIS E PREPÚCIO 07 3.2. TESTÍCULOS 08 3.3. EPIDÍDIMO, GLÂDULAS ANEXAS E CONDUTOS ESPERMÁTICOS 10 4. EXAME ANDROLÓGICO 12 4.1 INTRODUÇÃO 12 4.2 MATERIAL NECESSÁRIO 12 4.3 SEQUÊNCIA DO EXAME 13 5 ULTRASSONOGRAFIA APLICADA AO EXAME ANDROLÓGICO 14 5.1 INDRODUÇÃO 14 5.2 ANATOMIA ULTRASSONOGRÁFICA DO ESCROTO, TESTÍCULO, EPIDÍDIMO E FUNÍCULO ESPERMÁTICO 14 5.3 EXAME ULTRASSONOGRÁFICO DO ESCROTO, TESTÍCULO, EPIDÍDIMO E FUNÍCULO ESPERMÁTICO 16 6 COLHEITA DO SÊMEN 19 6.1 ANÁLISE DO SÊMEN 19 6.1.1 EXAMES IMEDIATOS 19 6.1.2 EXAMES MEDIATOS 20 6.1.3 CÂMARA DE NEUBAUER 21 6.2 PADRÕES DE PATOLOGIAS ESPERMÁTICAS 24 6.3 PRINCIPAIS CAUSAS DAS PATOLOGIAS ESPERMÁTICAS 24 6.4 MODELO DE LAUDO DE EXAME ANDROLÓGICO 29 6.5 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE SÊMEN DE GARANHÕES DESCRITOS POR VÁRIOS PESQUISADORES 31 7. METODOLOGIA BÁSICA PARA REFRIGERAÇÃO DE SÊMEN 31 7.1 DILUIÇÃO 31 7.2 REFRIGERAÇÃO 31 7.3 INSEMINAÇÃO 31 8. CONGELAÇÃO DE SÊMEN 32 8.1 INTRODUÇÃO 32 8.2 MATERIAL NECESSÁRIO 32 8.3 SEQUÊNCIA PARA CONGELAÇÃO 33 8.4 LAUDO PARA SÊMEN CONGELADO 36 8.5 PROVAS LABORATORIAIS DE INTEGRIDADE DA MEMBRANA PLASMÁTICA 37 www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 3 9. AUTORES 40 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 41 ANEXO 1- MONTAGEM DA BOTUFLEX PASSO A PASSO 42 ANEXO 2- MONTAGEM DA BOTUBOX PASSO A PASSO 43 ANEXO 3- MONTAGEM DA BOTUTANIER PASSO A PASSO 44 ANEXO 4-COMO UTILIZAR O BOTU-IA? 45 ANEXO 5- COMO MONTAR A VAGINA ARTIFICIAL 46 www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 4 1.ANATOMIA DO SISTEMA GENITAL MASCULINO GARANHÃO www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 5 2. ENDOCRINOLOGIA DA REPRODUÇÃO DO GARANHÃO Para que os testículos possam produzir espermatozóides de maneira contínua é necessário que o eixo hipotálamo – hipófise – gônadas, esteja em sincronia, de tal forma que os hormônios envolvidos para esta finalidade sejam liberados em quantidades adequadas. O hipotálamo é uma região cerebral localizada no diencéfalo, responsável pela liberação de GnRH. Este hormônio peptídico via sistema porta hiposisário vai até a hipófise, onde é reconhecido pelas células lá presentes desencadeando a secreção das gonadotrofinas (FSH e LH) que através corrente da sangüínea se dirigem até os testículos, resultando na produção de esteróides (estrógeno e testosterona), que participam da formação dos espermatozóides. Os hormônios envolvidos na reprodução são liberados através de retroalimentação positiva ou negativa, conforme a necessidade. Sua produção é estimulada ou inibida, de maneira a se manter concentrações adequadas para a plena produção espermática. Nos testículos há a presença de dois tipos de células. As células de Leydig que produzem testosterona pelo estímulo do LH, testosterona esta que é “ligada” por uma proteína ligadora de andrógenos (ABP) a luz das células de Sértoli (estimulada pelo FSH) produtoras da ABP e responsáveis pelo controle da espermatogênese. Conforme há um aumento das concentrações de testosterona circulante, ocorre uma retroalimentação negativa a nível do hipotálamo resultando numa diminuição dos pulsos de liberação de GnRH desencadeando uma menor liberação de gonadotrofina (LH) que diminui a produção de testosterona pelos testículos. Quando existe a necessidade de uma maior produção deste hormônio ocorre uma retroalimentação positiva e os níveis testosterona são novamente restabelecidos. Outro hormônio que participa dos processos de regulação da secreção de GnRH é a inibina produzida pelas células de Sértoli, ela promove uma maior ou menor liberação dos pulsos de GnRH que diminuem ou aumentam a secreção do FSH afetando a produção da ABP e da própria inibina. É de grande importância o conhecimento deste mecanismo para um bom diagnóstico de alterações reprodutivas que possam vir a afetar o macho prejudicando sua função reprodutiva e qualidade espermática. Segue abaixo o esquema do eixo hipotálamo - hipófise – gônadas. www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 6 NEUROENCDOCRINE AND ANATOMY AND FUNCTION. Proposed positive(+) and (-) feedback control of hormone production and release in the stallion. VNO ,Vomeronasal organ: GnRh, gonadotropin-releasing hormone: LH, luteinizing hormone; PRL prolactin; FSH, follicle-stimulating hormone; T, testosterone; E, estrogens; I, inhibin; A, activin. Potencial external influences on hypothalamic secretion are also cted. (Adapta also Adapted from Pickett,B.W.,Amann,R.P.,McKinnon,A.O.,et al: Management of the stallion for maximum reproductive efficiency. II. Animal Reproduction Laboratory General Series Bulletin nº 05,Fort Collins,CO: Colorado State University,1989,p1) (Equine Breeding Management and Artificial Insemination, Juan C. Samper, second edition). www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 7 3. PATOLOGIAS DO SISTEMA REPRODUTIVO DO GARANHÃO 3.1 PÊNIS E PREPÚCIO Fimose Incapacidade de expor o pênis comumente, podendo ser congênito ou adquirida, por traumas ou infecções. Tratamento: cirúrgico. Parafimose Dificuldade de retração do pênis, principalmente devido a lesões de medula, lesões do músculo retrator do pênis, estenose. Tratamento: limpeza de lesões no pênis, compressas de água fria, aumento do diâmetro do óstio prepucial. Balanopostite Inflamação do pênis (balanite) e prepúcio (postite), freqüentemente ocorrem simultaneamente balanopostite. Agentes causadores: P. aeroginosa, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus spp, Staphilococcus spp., B. abortus, Mycoplasma, Ureaplasma, Chlamydia, Protozoa , Virus, , Sendo mais comum em garanhões as lesões parasitárias causadas por Habronema ou mesmo miíases ou também por traumatismos. Tratamento: Retirada da causa, tratamento antibacteriano (infecções secundárias) com antibióticos sistêmicos de eliminação pela urina, ivermectina (infecções parasitárias), organofosforado (habronemose). Hematoma peniano Geralmente devido a ruptura da túnica albugínea, por traumas no momento da cópula, freqüentemente o hematoma ocorre no dorso do pênis, a identificação da patologia é dada pela inspeção e palpação. Tratamento: o tempo de recuperação esta diretamente envolvido com a evolução do quadro, hidroterapia (ducha 3 x ao dia), punção se necessário, colocar suspensório, anti-inflamatórios não esteróide, antibióticoterapia Edema prepucial Traumatismos, picada de insetos ou ofídios. Tratamento: baseado nos agentes causadores. www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 8 Laceração prepucial Lesões traumáticas no prepúcio, dependendo da extensão e tempo de evolução suturacom plastia local almejando evitar alterações no óstio prepucial, se o tempo de evolução for maior que 24hs ferida já contaminada tratamento tópico (limpeza, agentes desinfetantes, ducha e repelentes), cicatrização por segunda intenção. 3.2 TESTÍCULOS Degeneração testicular Condição adquirida decorrente de fatores que afetam a homeostase testicular. Muitos deles envolvendo alterações da termorregulação testicular como piques febris , o processo de degeneração é classificado em graus I, II e III, quanto maior o grau maior a severidade da patologia. Podem também ser de origem medicamentosa ( Anabolizantes e corticoesteróides ). O prognóstico é bom a não ser nos casos onde já houve perda de massa testicular e formação de tecido conjuntivo. Tratamento: retirada da causa e tempo mínimo de 60 dias. www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 9 Hipoplasia e aplasia testicular A aplasia testicular é a ausência de um ou dos dois testículos é de rara incidência. Já a hipoplasia (diminuição do tamanho testicular) uni ou bilateral é mais comumente encontrada, ambas patologias são de origem genética causadas por um gene recessivo de penetrância incompleta. Tratamento: por se tratar de uma patologia de origem genética deve-se afastar o animal da reprodução. Para se diferenciar um quadro de hipoplasia testicular de uma degeneração necessita-se de uma anamnese bem detalhada. Nos casos de degeneração os testículos tinham tamanho normais, nas hipoplasias sempre foram pequenos e as alterações do ejaculado não se alteram como no caso da Degeneração Testicular, Orquite Freqüentemente causada por uma infecção ou traumatismo e associada a epididimite. Aguda: aparecimento súbito, presença de aumento de temperatura local, dor, aumento de volume, perda da função, animal se locomove pouco. Causas infecciosas mais comuns nos equinos são: P. aeroginosa, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus spp, Staphilococcus spp., B. abortus, E. coli, Mycoplasma , Ureaplasma , Chlamydia, Protozoa, Virus. Tratamento: Ducha, antiinflamatório sistêmico (Sulfa +Trimetropin, Enrofloxacina). Crônica: aumento de volume, alteração da consistência e perda da sensibilidade dolorosa acentuada. Neoplasias testiculares Os tumores testiculares são raros, os mais comumente diagnosticados em garanhões são os seminomas (de células germinativas), sendo encontrados também os tumores das células intersticiais (células de Leydig) e os tumores das células de Sertoli. Diagnóstico: Acomete idosos, superfície dura e irregular, lesões circulares a Ultra- sonografia. Tratamento: retirada cirúrgica do testículo afetado. Hérnia inguino-escrotal Presença de conteúdo abdominal na bolsa escrotal, pode haver presença de alças sem prejuízo do trânsito intestinal, entretanto pode ocorrer o encarceramento das alças com parada do trânsito intestinal. Testículo aumentado e frio dor aguda e intensa, Tratamento: cirúrgico com retirada do testículo do lado acometido e fechamento do anel. Rotação testicular O testículo afetado mantém seu posicionamento horizontal em relação ao eixo cranio-caudal do animal, porém com giro de 180o observado pela alteração de localização www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 10 da cauda do epidídimo em relação à parede abdominal. Tratamento: depende do grau de rotação, podendo dispensar intervenção desde que não haja interferência na qualidade seminal do garanhão ou exigir o reposicionamento do testículo com utilização de sedação ou até procedimento cirúrgico. Torção Testicular No testículo afetado, observa-se um giro no eixo longitudinal de modo que nos casos de torção de 90° a cauda do epidídimo estará em posição lateral ou medial e nos casos de torção de 180° a cauda do epidídimo estará em posição cranial. Dependendo do grau de torção pode haver comprometimento circulatório e, nesses casos, o tratamento é cirúrgico com a retirada do testículo afetado. 3.3. EPIDÍDIMO, GLÂNDULAS ANEXAS E CONDUTOS ESPERMÁTICOS EPIDÍDIMO: a)Defeitos congênitos: • Aplasia Segmentar: todo ou parte do epidídimo, vasos deferentes ou vesículas seminais podem estar ausentes. • Hipoplasia : geralmente acompanha a hipoplasia testicular. b)Granuloma Espermático: obstruções congênitas dos ductos e se encontram na cabeça do epidídimo. Os granulomas podem alcançar tamanho suficiente para obstruir outros tubos eferentes. c)Espermatocele: Dilatação cística do condutodo epidídimo, com acúmulo de espermatozóides. Oclusão congênita ou adquirida. As espermatoceles progridem para granulomas. O esperma condensado na espermatocele ou no granuloma tem uma cor amarela e de consistência caseosa como pus na infecção por Corinebacterium spp. d)Epididimite: Esta afecção às vezes coexiste com a orquite .A fibrose inflamatória produz na fase crônica endurecimento e aumento de volume do epidídimo, sobretudo do corpo. Pode haver aderência entre as capas parietal e visceral da túnica vaginal com obliteração parcial ou total. Epididimites: mais freqüente na cauda . Infecções do epidídimo pelos agentes=> Strep Beta Hemolítico,P. aeroginosa, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus spp, Staphilococcus spp., B. abortus, Mycoplasma , Ureaplasma , Chlamydia, Protozoa , Virus. Sintomas: podem ser agudos ou crônicos como dor, temperatura elevada, sensibilidade, tumefação da cauda do epidídimo. Nódulos no conduto deferente facilmente perceptíveis à palpação=>obliteração=>azoospermia, quando os dois condutos estiverem afetados. www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 11 Geralmente a infecção atinge=>testículos e as vesículas seminais. Diminui a libido pelo componente Dor ,podendo haver piospermia. Diagnóstico: exame bacteriológico, Ultra-sonografia alterações a palpação. Prognóstico: grave por agentes específicos , reservado devido obliteração dos condutos e aspermia. Tratamento: Específicos: sulfa+ trimetropin , Cloranfenicol . CONDUTOS ESPERMÁTICOS: a) Espermiostasia: Azoospermia de origem excretora devido obliteração total ou parcial da vias espermáticas, cuja etiologia pode ser: traumática, infecciosa e hereditária. Lesões: cabeça epidídimo bastante espessa e saliente , corpo é duro e com superfície irregular, cauda distendida e saliente na base do testículo. Ao corte estas estruturas apresentam material caseoso, seco, branco, aglomerado celular denso: numerosos espermatozóides alterados e ou anormais, restos células epiteliais e grandes células macrófagas. Patogenia: Com o estreitamento das vias , congênito ou adquirida, o sêmen não pode ser expulso e se acumula nos segmentos do epidídimo e depois nos tubos seminíferos inclusive provocando alteração na espermatogenese. Geralmente ocorre espermofagia . Sintomas: fertilidade baixa em 1 ou 2 anos , instalando-se a seguir a esterilidade. A libido é mantido , a ejaculação é mínima e constituida por secreções vesico uretrais Prognóstico: negativo. Os de origem hereditária devem ser descartados. Unilaterais de outras origens devem sofrer castração do testículo afetado. b) Fístula Uretral: Traumas na porção do pênis=>hemospermia grave. Diagnóstico: Exame de sêmen e Endoscopia. Tratamento: Cauterização, Cirurgia e Tratamento com antibióticos e sulfas. GLÂNDULAS ANEXAS: a) Vesiculite: Inflamação aguda e crônica. Causa de perda econômica prematura em touros: redução da qualidade do sêmen e da motilidade pós-descongelação. Idade pode ser fator predisponente . Causa: Bactérias, Vírus, Chlamydia, Fungos e Protozoários., Staphilococcus spp., Streptococcus spp., Escherichia coli, Leptospira interrogans , Proteus mirabilis , Clamydia psittaci, Candida guilliermondii ,Pseudomonas aeroginosa, Klebsiella pneumoniae,Ureaplasma. Em geral não apresenta dor (micção, defecação e ejaculação). Sêmen: piospermia, sem alteração da motilidade imediata, havendo diminuição da viabilidade após algum tempo. Palpação: difícil diagnóstico de vesiculite, abscedação: rara, Ultrasom: dificil diagnóstico www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 12 pelas características da vesícula seminal => antes da cobertura repleta (anecóica), após ejaculação => vazia. Tratamento clínico: antibioticoterapia sistêmica após antibiograma, muitos antibióticos não conseguem penetrar na luz da glândula em concentração terapêutica. Antibióticos precisam ter alta solubilidade em lipídeos, baixo peso molecular, afinidade por proteínas plasmáticas, pKa alto, pH alto (Sulfa +Trimetropin, Enrofloxacina, Cloranfenicol). Endoscopia: lavagem (5x) da glândula com solução salina e antibióticos (ticarcilina sódica ou ampicilina sódica). Remoção Cirúrgica: não é usada rotineiramente, podendo apresentar complicações pós- operatórias como: hemorragias, infecções e lesões nos nervos pélvicos (ligados à ejaculação). 4.EXAME ANDROLÓGICO 4.1. INTRODUÇÃO O exame andrológico reflete as atuais condições reprodutivas de um macho. O potencial reprodutivo do animal deve ser verificado sempre quando este for para exposições, iniciar uma estação de monta, diagnostico de sub ou infertilidade, ocorrência da puberdade, destinado a criopreservação de sêmen, etc. A avaliação destina-se a observação das condições semiológicas, bem como as condições de sanidade, alterações genéticas, saúde geral, deficiências na cópula por alterações locomotoras ou alterações do sistema genital (impotência coeundi) e problemas espermáticos (impotência generandi). O laudo de um exame andrológico nunca é definitivo (para o resto da vida reprodutiva), sempre deve-se levar em consideração que o animal logo após o exame pode vir a sofrer de alguma patologia que leve-o a depreciações em sua qualidade espermática, por isso o laudo não deve ser emitido com uma validade superior a 60 dias (tempo em que ocorre a espermatogênese mais o trânsito epididimário). 4.2. MATERIAL NECESSÁRIO A) ficha para anotações + caneta B) paquímetro C) fita métrica D) luva de palpação E) vagina artificial F) copo coletor G) microscópio H) mesa aquecedora (37°C) I) lâminas e lamínulas J) câmara de Neubauer www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 13 K) vidraria (proveta de 100ml, tubo de ensaio, becker) L) pipeta de Sahli ou micropipeta de 20µl ou palheta de 0,5ml M) corantes para patologia espermática 4.3. SEQÜÊNCIA DO EXAME A) Identificação do animal: • Nome, registro, idade, raça B) Identificação do proprietário: • Nome, endereço, telefone, nome da propriedade C) Exame do animal: • Anamnese (animal estabulado ou a campo, quanto tempo se cobrir, doenças anteriores, medicamentos aplicados) • Exame clínico geral (verificação dos parâmetros respiratório, cardíaco, digestivo, aprumos, sensibilidade na coluna) • Exame clínico específico do aparelho reprodutivo (padrões normais) Prepúcio – sem nenhuma alteração, edema, lesões etc. Pênis – sem nenhuma alteração, escaras, edema, hematoma, forma. Glândulas anexas – Palpação retal (somente deverá ser realizada a palpação retal se ficar constatado quadro de piospermia ou hemospermia). Testículos e Bolsa escrotal – Observa-se bem o escroto, se não há feridas, bernes, edema, varicocele (dilatações vasculares), então palpa-se os testículos que no eqüino têm a forma ovóide e posicionamento horizontal em relação ao animal. Devem ter mobilidade dentro da bolsa, ausência de dor a palpação, simetria, consistência fibroelástica. Devem ser feitas mensurações individuais de cada testículo, que demonstram com maior exatidão a verdadeira massa testicular, devendo ser realizadas com o auxílio de um paquímetro. Comprimento 5 a 12cm (do polo proximal até o polo distal do testículo), largura 4 a 8 cm (medida latero-madial, na porção média do testículo), altura 4 a 8 cm (medida infero-superior, na porção média do testículo). Epidídimos – Devem ser palpados verificando sua presença, sensibilidade, forma e localização (cabeça acoplada ao polo cranial, corpo localizado na face medial dos testículos e cauda geralmente bem definida na região caudal dos testículos, apresentado consistência fibro-eslástica de tamanho variando de 1x1 a 3x3, conforme idade do animal e freqüência de ejaculados). www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 14 5. ULTRASSONOGRAFIA APLICADA AO EXAME ANDROLÓGICO EM GARANHÕES 5.1 INTRODUÇÃO A ultrassonografia é um método diagnóstico não invasivo que fornece importantes informações sobre a arquitetura interna de órgãos. Embora o exame ultrassonográfico do trato reprodutivo de éguas seja utilizado há mais de 30 anos, este exame não é rotineiramente utilizado na avaliação dos órgãos genitais de garanhões durante o exame andrológico, sendo somente requerido quando há suspeita de algum processo patológico específico. A ultrassonografia do trato reprodutivo de garanhões é uma excelente ferramenta no diagnóstico de inúmeras condições patológicas como granuloma espermático, epididimites, criptorquidismo, varicocele, estruturas císticas do epidídimo, aumento da espessura da túnica vaginal e neoplasias testiculares. Além disso, este exame permite aferições exatas de medidas tais como altura, largura e comprimento, bem como área transversal e circunferência na parte mais larga de cada testículo, medidas estas utilizadas para estimar volume testicular e produção diária de espermatozóides. 5.2 ANATOMIA ULTRASSONOGRÁFICA DO ESCROTO, TESTÍCULO, EPIDÍDIMO E FUNÍCULO ESPERMÁTICO Um garanhão normal possui dois testículos localizados na região inguinal, cada um com formato elipsóide, orientados longitudinalmente no eixo horizontal com um cordão espermático localizado cranio-dorsal (LOVE, 1992; TURNER, 1998). O funículo espermático é recoberto pela túnica albugínea e contém a artéria testicular, plexo pampiniforme e ducto deferente (Figura 1). A artéria testicular forma ramificações sobre a superfície do testículo, que se estendem para o parênquima testicular e retornam no plexo pampiniforme do funículo espermático para o abdômen (TURNER, 1998). A região cranial do testículo é ligeiramente mais elevada do que a porção caudal (LOVE, 1992). O sangue é drenado do testículo pela veia central, podendo este vaso, muitas vezes, ser visualizado no corte transversal (Figura 2), especialmente em testículos maiores (LOVE, 1992). A veia central atravessa a túnica albugínea, ramificando-se para a formação do plexo pampiniforme. www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 15 Figura 1- Representação esquemática da orientação do testículo, epidídimo, funículo espermático e estruturas ultrasonográficas importantes. A avaliação ultrassonográfica de estase venosa dentro dos vasos do funículo espermático, pode ter significado clínico na avaliação do suprimento sanguíneo testicular (LOVE, 1992). Distensão anormal das veias do plexo pampiniforme é rara em garanhões, sendo esta condição denominada varicocele (CHENIER, 2009). Figura 2 – O esquema à esquerda demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequência) foi colocado no testículo para avaliação da veia central. Na imagem ultrassonográfica (direita) de um testículo normal (corte transversal), a veia central aparece como uma estrutura anecóica com formato circular (seta). O epidídimo é um órgão alongado, enovelado, localizado na superfície do testículo (SULLIVAN et al., 2005). Ele pode ser dividido anatomicamente em três segmentos: cabeça, intimamente ligada à região crânio-dorsaldo testículo; corpo, que se encontra horizontalmente disposto na superfície dorso-lateral do testículo; cauda, responsável pelo armazenamento dos espermatozóides, formado por um ducto epididimário com a forma cilíndrica que se estende na região caudal do testículo (LOVE, 1992) que com auxílio do ligamento espesso (ligamento da cauda do epidídimo), mantêm-se firmemente fixado ao testículo. O ducto deferente é uma continuação do ducto da cauda do epidídimo (TURNER, 1998). A túnica albugínea é uma forte cápsula fibrosa que está intimamente associada com a superfície do testículo, produzindo delicada compressão do parênquima testicular. Os septos que se estendem no parênquima, a partir do interior da cápsula, não juntam para formar um mediastino visivelmente distinto. (DYCE et al., 2005). Por isso no garanhão não www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 16 é possível a distinção do mediastino testicular presente em outras espécies, como em humanos, bovinos, suínos e caninos (CARTEE et al., 1986). A túnica vaginal visceral está intimamente justaposta à túnica albugínea em torno do testículo, epidídimo e funículo espermático. A próxima camada externa é a túnica vaginal parietal que é a continuação do peritônio parietal. Entre as duas camadas vaginais existe uma pequena quantidade de líquido peritoneal (TURNER, 1998). 5.3 EXAME ULTRASSONOGRÁFICO DO ESCROTO, TESTÍCULO, EPIDÍDIMO E FUNÍCULO ESPERMÁTICO O exame ultrassonográfico desta região normalmente é realizado com o animal em estação e devidamente contido, tendo em vista que o examinador deverá colocar-se em uma posição potencialmente perigosa em frente aos membros pélvicos do garanhão. A maioria dos garanhões são mais facilmente manipulados após a colheita de sêmen, pois eles estão mais relaxados e toleram melhor a manipulação (LOVE, 1992; TURNER, 1998; CHENIER, 2009). O transdutor linear ou setorial de 5.0 ou 7.5MHz irá fornecer imagens de boa qualidade para avaliação dos órgãos genitais externos (TURNER, 1998; CHENIER, 2009). A utilização de transdutor convexo ou linear fornece imagem de melhor qualidade para avaliação do epidídimo (CHENIER, 2009). A aplicação de gel no local ou a utilização de um distanciador (standoff pad), melhoram a qualidade da imagem por aumentarem o contato com a pele (LOVE, 1992). Para realização do exame dos testículos o examinador deve posicionar-se lateralmente ao animal em estação, empurrando o testículo contralateral dorsalmente, facilitando assim, a apreensão do funículo espermático do testículo a ser examinado (Figura 4). Após manter o testículo na posição ventral do escroto a probe é colocada na posição vertical, iniciando o escaneamento da região cranial para região caudal (LOVE, 1992). Figura 5 – Exame ultrassonográfico dos testículos e epidídimos. www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 17 O funículo espermático é mais facilmente visualizado pela colocação da probe na posição horizontal, bem próximo ao testículo (Figura 6). Figura 6 – Exame ultrassonográfico do funículo espermático. O plexo pampiniforme apresenta-se como uma imagem manchada heterogênea, e a artéria testicular é identificada em cortes (CHENIER, 2009) com aspecto de queijo suíço (LOVE, 1992; Figura 7). Figura 7 – O esquema à esquerda demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequência) foi colocado para avaliação do funículo espermático. Na imagem ultrassonográfica (direita) a artéria testicular é identificada como estruturas anecóicas em cortes (seta branca), e o plexo pampiniforme como uma estrutura heterogênea envolvendo a artéria (seta preta). Em um posicionamento transversal é possível distinguir vasos sanguíneos do funículo espermático e a cabeça do epidídimo. A veia central pode ser vista em alguns casos e não deve ser considerada patológica. A medida que a probe é deslocada caudalmente os vasos do funículo espermático são perdidos de vista, e a veia central torna- se mais reduzida em diâmetro (LOVE, 1992; Figura 8). Figura 8 – O esquema à esquerda demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequência) foi colocado no testículo para avaliação da veia central. Na imagem ultrassonográfica (corte longitudinal), a veia central aparece como uma estrutura anecóica (setas), que diminui em diâmetro à medida que segue para a região caudal. www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 18 O corpo do epidídimo pode ser mais identificado na superfície dorso-lateral do testículo, sendo, melhor observado quando, colocado em contraste com os vasos do funículo espermático, e torna-se menos perceptível quando a probe é deslocada caudalmente (LOVE, 1992; Figura 9). Duas manchas brancas (reflexo especular) são observadas na região dorsal e ventral da superfície do corpo do epidídimo (LOVE, 1992). Figura 9 – O esquema à esquerda demonstra que o transdutor linear (5 MHz de frequência) foi colocado na superfície dorso-lateral do testículo para avaliação do corpo do epidídimo. Na imagem ultrassonográfica o corpo do epidídimo (setas) apresenta-se hipoecóico em relação ao parênquima testicular normal. A cauda do epidídimo é identificada quando a probe é colocada na posição caudal ao testículo com os feixes voltados na direção cranial (Figura 10). O lúmen do ducto epididimário pode ser visualizado na cauda do epidídimo, devido ao seu maior tamanho nesse local. A textura do epidídimo varia de anecóica para hipoecóica com relação ao parênquima testicular (TURNER, 1998). Figura 10 – O esquema demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequência na imagem à esquerda e 7,5 MHz de frequência na imagem à direita) foi colocado para avaliação da cauda do epidídimo. Na imagem ultrassonográfica, observa-se a cauda do epidídimo (setas) hipoecóica em relação ao parênquima testicular. A presença de líquido na cavidade vaginal facilita o exame. Em certas posições é possível visualizar ramos da artéria testicular (Figura 11), sendo esses vasos maiores e mais proeminentes próximo à cauda do epidídimo. O parênquima testicular normal possui textura homogênea (LOVE, 1992). www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 19 Figura 11 – O esquema à esquerda demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequência) foi colocado no testículo, possibilitando a vizualização dos ramos da artéria testicular (setas). 6. COLHEITA DO SÊMEN A colheita do sêmen é efetuada por auxílio de vagina artificial, onde o animal deve ter um condicionamento prévio para que este monte em uma égua em cio ou em manequim. • Colheita com vagina artificial: a vagina artificial modelo Botucatu é composta de um tubo rígido, uma mucosa de látex, um copo coletor protegido de luz e alterações de temperatura. (Anexo1). A vagina deve preenchida com água quente, para permanecer com temperatura de 42-45°C para colheita. O animal condicionado saltando sobre o manequim, deve ter o pênis desviado e introduzido na vagina artificial. A constatação da ejaculação pode ser verificada com as seguintes características: • Movimento da cauda para cima e para baixo/ contração dos músculos perianais/ sapatear/ fluxo pulsátil uretral da ejaculação. 6.1. ANÁLISE DO SÊMEN 6.1.1 EXAMES IMEDIATOS Logo após a colheita o sêmen deve ser analisado segundo suas características macro e microscópicas. • Volume = Podendo variar de 20 á 100ml • Cor = desde branco acizentado até um branco leitoso. • Densidade = Varia do tipo aquoso até leitoso – diretamente relacionado com a concentração espermática • Odor = “Sui-generis” • Motilidade espermática = Se faz uma pequena gota de sêmen entre lâmina e lamínula aquecidas a 37°C e realiza-sea visualização em microscópio com aumento de 200 vezes. A motilidade espermática é analisada segundo uma escala de porcentagem variando de 0 a 100% (Motilidade Total=MT, www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 20 porcentagem de células móveis). Caso a amostra esteja muito concentrada deve-se realizar uma diluição em meio diluidor (por ex. Kenney), esta diluição pode ser 1:1 ( Motilidade ideal ≥ 70%) • Vigor espermático = Concomitantemente com a motilidade espermática se avalia o vigor espermático na escala de 0 a 5 (velocidade com que o espermatozóide se desloca, quanto maior a velocidade maior o valor). (Vigor ideal ≥ 3) 6.1.2. EXAMES MEDIATOS São realizados no momento da colheita, entretanto podem ser analisados posteriormente. • Concentração espermática = Retira-se do volume ejaculado uma alíquota de 10µl utilizando-se uma micropipeta e coloca-se em um tubo de ensaio contendo 190 µl de água destilada aquecida ou 1 gota de sêmen em 19 gotas de água destilada (diluição 1:20). Após boa homogeneização, monta-se uma Câmara de Neubauer (ver esquemas), preenchendo seus 2 retículos, conta-se todos os espermatozoides presentes em 5 quadrados de cada retículo (vide exemplo), sendo que a variação entre cada uma dos lados da câmara (retículos) não pode ser mais que 10% (se for maior repete-se a operação). Após a operação calcula-se a média aritmética, o valor encontrado é representado pela letra (n). www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 21 6.1.3 CÃMARA DE NEUBAUER www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 22 A concentração espermática média para um garanhão adulto colhido na vagina artificial é de 0,1-0,2x109 espermatozóides por ml. (100 a 200 milhões/ml) Ex:. De um dos lados da Câmara de Neubauer = Retículo Neste exemplo temos 12 espermatozóides azuis que deverão ser contados para efeito de cálculo, os mesmos localizam-se nos quadrados cinzas e sobre as linhas, relativos aos cinco quadrados representados, levando-se em consideração o posicionamento da cabeça. Espermatozóides que apresentam apenas a cauda dentro do quadrado não são contados. Após a contagem das células espermáticas (n),utilizamos a seguinte fórmula para cálculo da concentração espermática. Concentração espermática = espermatozóides/mm3 n = Número médio de células contadas nos dois lados da Câmara de Neubauer = Altura entre a lamínula e a Câmara de Neubauer em mm * 5 = Média ( ) de 5 quadrados de 1º retículo + 5 quadrados do 2º retículo 5 x = 5 quadrados contados x a área do quadrado mm2 = Diluição realizada (1 gota de sêmen em 19 gotas de água dest. ou 10µL de sêmen em 190µL de água dest.) 1 10 1 20 1 25 1 25 Contáveis Não contáveis = Esquema da contagem dos sptz : diagonal (quadrados pretos) ou cantos + centro (círculos azuis). 1 10 25 x 5* * x 1 20 n x www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 23 O resultado encontrado é referente a concentração de espermatozóides no ejaculado por mm3, para converter esse dado para mL, basta multiplicá-lo por 103 (1000). Ex:. Foram contadas 100 células de um lado câmara=retículo (em cinco quadrados) e 104 células do outro lado (variação entre os lados menor que 10%), tira- se a média aritmética, o n = 102 (espermatozóides), colocando-se na fórmula, adotando a diluição de 1/20, temos: Concentração espermática = , resolvendo a equação Concentração espermática = 102 x 103 espermatozóides por mm3, convertendo para ml (x103), a concentração espermática desse touro foi de 102 x 106 espermatozóides por ml. “Dica” Sempre que a diluição efetuada for de 1/20, basta multiplicar o n (número médio contado nos retículos) por milhão (106 )e tem-se direto a concentração por ml. No exemplo passado n = (102) multiplicado por 106, tem-se 102 x 106 espermatozóides por ml. (102 milhões/ml) • Preparo de material para análise de Patologia espermática = Coloca-se uma gota de sêmen em uma lâmina e realiza-se um esfregaço, fixa- se o esfregaço em metanol e cora-se a lâmina com corantes Ex:. Karras modificado por Papa et al (1998) (2 minutos no Rosa Bengala, lava-se a lâmina em água corrente fraca, então põe-se 1 min no Tanino, lava-se novamente e 30 segundos no Azul Vitória, lava-se a lâmina, deixa secar, observa-se em microscopia de luz (óptica) aumento de 1000x). Conta-se 200 células, percorrendo a lâmina de forma homogênea como mostra o esquema abaixo e classificando os espermatozóides conforme suas patologias, obtendo no final as porcentagens de espermatozóides normais e de cada patologia. Esquema de como se deve percorrer a lâmina para leitura de patologia espermática. 1 10 x 5 25 x 1 20 102 www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 24 6.3 PADRÕES DE PATOLOGIA ESPERMÁTICA As patologias espermáticas são divididas em Defeitos Maiores, relacionados com a infertilidade e Defeitos Menores não interferem diretamente sobre a fertilidade. • DEFEITOS MAIORES 1. Acrossomo: 2. Patologia da cabeça: Subdesenvolvida .............................................................. Isolada patológica ............................................................ Estreita na base................................................................ Piriforme.......................................................................... Pequena anormal ............................................................. Contorno anormal ............................................................ “Pouch formation” ........................................................... 3. Gota proximal: 4. Formas teratológicas: 5. Defeito de peça intermediária: (Desfibrilação, fratura, edema, pseudogota) ........................ 6. Patologia da cauda: Fortemente dobrada ou enrolada......................................... Dobrada com gota.............................................................. Enrolada na cabeça............................................................ 7. Formas duplas: • DEFEITOS MENORES 1. Patologia da cabeça: Delgada ............................................................................ Gigante, curta, larga, peq. normal.................................... Isolada normal................................................................... 2. Patologia da cauda e implantação: Retro e abaxial, oblíquo..................................................... Dobrada ou enrolada......................................................... 3. Gota Citop. Distal: Esquema das patologias espermáticas encontradas: www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 25 A = Patologias de Acrossomo B = Patologias de Cabeça C = Patologias de Inserção de Cauda D = Patologias de Peça Intermediária E = Patologias de Cauda F = Formas Teratológicas Elementos figurados do sêmen (Modificado de Mies Filho,1982). Descrição das patologias do quadro anterior: A) = Acrossomo A1 = normal A2 = grande A3 = com grânulos A4 = oblíquo A5 = pequeno A6a = sptz s/ acrossomo A6b = solto A7a e b = deformações B) = Cabeça B1a, b e c = normal B2 = estreita B3 = piriforme B4 = lanciforme B5= raquetiforme B6 = globuliforme B7 = gigante B8 = anã C) = Inserção C1 = normal C2 = reta C3 = invertida C4 = estreita C5 = larga C6 = simétrica C7 = excêntrica (abaxial) C8 = paraxial C9 = retroaxial C10 = rutura do colo C11 = ausência genética da cabeça D) = Peça Intermediária (PI) D1 = normal D2 = curta D3 = comprida D4 = estreita www.botupharma.com.br - Fone: (14) 3112-9900 26 D5 = disforme D6a e b = ruturada D7 = repregueada D8 = tipo axial D9a e b = tipo fibrilar E) = Cauda E1 = gota proximal E2 = gota distal E3 = gota presa na cauda E4 = gota presa na PI E5 = fortemente dobrada E6 = espiraliforme E7 = enrolada cabeça E8 = rudimentar F) = formas duplas Elementos figurados do sêmen (Modificado de Mies Filho,1982). a) espermatozóides normais b) gotas livres c) anormalidades primárias d a h) anormalidades secundárias d) cabeças isoladas e) gotas proximais f) gotas distais g) cauda dobrada com gota h) acrossomas livres i) formações ciliares (medusas) k) células epiteliais de descamação l) células linhagem espermática = casos de degeneração testicular m) hemácias n) piócitos 6.4 Principais causas das patologias espermáticas A) Cabeça Acrossomo = As alterações no acrossomo como: forma irregular, enrugado ou destacado, podem ser devido ao choque térmico, manipulação indevida ou senilidade. A presença de um grânulo no acrossomo, o denominado Knobbed sperm, pode ser origem hereditária ou relacionado a degeneração testicular e está ligado diretamente com a infertilidade do animal quando encontrado em grande quantidade. O Pouch formation, (diadema defect) caracterizado pela presença de vacúolos na região equatorial da cabeça não mais no acrossomo, formando um colar na cabeça do espermatozóide são invaginações da membrana nuclear devido a rarefação da cromatina, apresentam relação direta com a presença de hipoplasia ou degeneração testicular. Alterações na forma da cabeça como: estreita na base, piriforme, lanciforme, anã, são patologias de origem testicular podendo ser oriundas de hipoplasia ou degeneração testicular. Sendo mais comum em cavalos as cabeças sub-desenvolvidas nos casos de Degeneração Testicular, B) Colo Defeitos de inserção como: Abaxial, paraxial e retroaxial, são devido a presença de “goteira”, falha na formação do espermatozóide. A localização da “goteira” definirá o 27 tipo da inserção. A inserção abaxial (mais encontrada nos eqüinos e considerada como normal para cavalos), pode não afetar a fertilidade, pois o espermatozóide tende a se adaptar com o movimento e conseguir um deslocamento compatível com a fertilização. As inserções paraxial e retroaxial apresentam uma maior relação com a infertilidade pois impossibilitam o deslocamento necessário do espermatozóide para a fecundação. Gotas citoplasmáticas proximais ou distais são restos de citoplasma que são o nutriente do espermatozóide durante o trânsito epididimário. O espermatozóide durante sua maturação pelo epidídimo permanece três dias na cabeça do epidídimo ainda com a presença da gota, posteriormente fica um dia no corpo e finalmente seis dias na cauda onde deve se desprender desta gota; teorias afirmam que existem enzimas ativadoras no epidídimo, que dissolveriam a gota. A presença de gotas em grades quantidades podem ser devido: 1) animal imaturo, que começou a produção a pouco tempo, nestes casos colheitas seriadas resolvem, um animal que está há muito tempo em descanso sexual também pode vir a apresentar gotas, devido a um diminuição no trânsito epididimário, da mesma forma colheitas periódicas levam ao desaparecimento da patologia; 2) disfunção epididimária devido a alterações de temperatura (deficiência na termorregulação) levando a um desequilíbrio iônico Na+ e K+, causando alterações no ciclo de maturação; 3) degeneração testicular, levando a disfunção epididimária; 4) hipoplasia testicular, por se tratar de uma patologia hereditária a gota sempre irá aparecer no ejaculado. C) Peça Intermediária Corkscrew defect (defeito em saca rolha), devido a degeneração do plasmalema, afetando a região das mitocôndrias que fica com aspecto rugoso, podendo dificultar a saída da gota e mais grave afetando a conformação das microfibrilas que podem se soltar patologia vista em animais idosos. Cabeça destacada (isolada), “goteira” rasa quando se forma podendo ser decorrente de problema de inserção paraxial ou de origem genética. Forma duplas da PI e/ou cauda, origem hereditária. D) Cauda Enrolada, fortemente enrolada, dobrada e fortemente dobrada, são devidas a uma diminuição no número de microfibrilas 3 ou 4 (Dag defect) neste caso sendo de caráter hereditário, estes animais apresentam elevado nível de Zn no sêmen. Outra causa da apresentação de defeitos de cauda no espermatozóides pode ser devido a choque osmótico ou térmico e disfunções de epidídimo. E) Outras anormalidades Aglutinação de cabeça (head aglutination), os espermatozóides chegam em blocos ao epidídimo, e neste local há presença de antiaglutininas que promovem a separação das células, uma disfunção epididimária pode levar ao desenvolvimento desta patologia. Espermatozóides subdesenvolvidos, animais imaturos ou processos interferindo na espermatogênese (de animais maduros) havendo a liberação no ejaculado de células primordiais espermatócitos, espermatogônias, espermátides. Medusa, restos ciliares do epidídimo por disfunção epididimária, geralmente nos casos de recuperação de degeneração testicular. 28 Pseudogota, semelhante a gota citoplasmática, porém situada na porção média da PI, e apresentando tamanho maior que a gota tradicional devido ao envolvimento de 1 ou 2 camadas de mitocôndrias. 29 6.5 MODELO DO LAUDO DE EXAME ANDROLÓGICO FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU Dep. de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária 18618 - 000 - Botucatu/ SP - Rubião Junior - Fone/FAX (14)6802 6249/6326 CERTIFICADO ANDROLÓGICO A.) IDENTIFICAÇÃO DO REPRODUTOR Nome: Raça: Idade: Registro: Proprietário: Propriedade: Endereço: B.) EXAME CLÍNICO 1. Histórico: 2. Geral: 3. Sistema Genital - Prepúcio: Pênis: Testículos: Esquerdo Direito Dimensões (comp., larg. alt.)cm Simetria Forma Posição Consistência Sensibilidade Dolorosa Mobilidade Epidídimo Genitália interna: 4. Comportamento sexual (libido): C.) ESPERMIOGRAMA I. Método de coleta: Vagina Artificial Data: Horário: II. Características do ejaculado: 1. Volume ejaculado : ml 5. Motilidade : 2. Cor : 6. Vigor (0-5) : 3. Aspecto : 7. Concentr. (x106/mm3) : 4. Turbilhonamento : - 8. Total esperm. (x109) : III. Características morfológicas (anexo I): a. Defeitos maiores: % b. Defeitos menores: % Total: % IV. Outros elementos: Não detectados (1. Medusa, 2. Células primordiais, 3. Células gigantes, 4. Leucócitos, 5. Hemácias, 6. Células epiteliais, 7. Cristais de urina, 8. Bactérias.) D.) OBSERVAÇÃO: E.) CONCLUSÃO: ------------------------------------------------ Local, ........... Data, .../..../...... Méd. Veterinário Responsável CRMV fmvz-unesp 30 FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATUDep. de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária 18618 - 000 - Botucatu/SP - Rubião Junior - Fone/FAX (014) 821.2121 - Ramal 2249/2326 CERTIFICADO DE EXAME ANDROLÓGICO - (ANEXO I) NOME: REGISTRO: I.) MORFOLOGIA ESPERMÁTICA (KARRAS Mod. PAPA et alii,1987) A.- TOTAL DE DEFEITOS MAIORES: % 1. Patologia da cabeça: 4. Formas teratológicas : Subdesenvolvida : Isolada patológica : 5. Defeito de peça intermediária (Desfibrilação, Estreita na base : fratura, edema, pseudogota) : Piriforme : Pequena anormal : 6. Patologia da cauda : Contorno anormal : Fortemente dobrada ou enrolada: “Pouch formation” : Dobrada com gota : 2. Acrossomo : Enrolada na cabeça : 3. Gota proximal : 7. Formas duplas : B.-TOTAL DOS DEFEITOS MENORES: % 1. Patologia da cabeça: 2. Patologia da cauda e implantação: Delgada : Retro e abaxial, oblíquo : Gigante, curta, larga, peq. anormal: Dobrada ou enrolada : Isolada normal : 3. Gota Citop. Distal : C - TOTAL DE FORMAS ANORMAIS: % II.) OUTROS ELEMENTOS: 1. Medusa : 5. Hemácias : 2.Células primordiais: 6. Células epiteliais: 3. Células gigantes : 7. Cristais : 4. Leucócitos : 8. Bactérias : III.) EXAMES COMPLEMENTARES (Termoresistência, espermocultura, outros): ----------------------------------- Local, ........... Data, .../..../...... Med. Veterinário Responsável CRMV fmvz-unesp 31 6.6 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE SÊMEN DE GARANHÕES DESCRITOS POR VÁRIOS PESQUISADORES Características Dowsett and Pattle Pickett et al Jasko et al Espermatozóides normais (%) Não relatado 51 ( 15 ) 52.5 (20.1 ) Cabeças anornais 7.1 (5.9 ) 9 ( 8 ) 6.4 ( 6.9 ) Cabeças destacadas 2.6 ( 4.8 ) 5 ( 6 ) 1.3 ( 1.7 ) Gota citoplasmatica proximal 13.1 ( 10.3 ) 3 ( 5 ) 15.5 ( 11 ) Gota citoplasmatica distal 8.1 ( 11.7 ) 3 ( 4 ) 13.5 ( 11.4 ) Peça intermediária anormal Não relatado 11 (11) 7.4 ( 7.1 ) Cauda anormal 10.9 ( 9.2 ) 20 (13 ) 2.4 ( 3.9 ) 7. METODOLOGIA BÁSICA PARA REFRIGERAÇÃO DE SÊMEN 7.1 Diluição: • Diluir sêmen com meio á base de Leite (Botu-Sêmen/Botupharma), contendo como antibióticos de preferência uma associação de Amikacina e Penicilina cristalina, podendo ser utilizada a gentamicina. • Diluir no mínimo o sêmen fresco com 2 partes de meio (Ideal 3:1 Meio: Sêmen). • Utilizar dose inseminante com 1 bilhão de espermatozóides viáveis. • Diluir a uma concentração entre 20 e 50 de milhões de espermatozóides por ml.. • Envasar em recipiente plástico BOTU-IA (Botupharma) (ANEXO 4) com a menor quantidade de ar possível. • OBS: Para garanhões que não refrigeram bem a utilização do diluente Botu-Turbo (Botupharma) é uma opção adequada, devendo com este diluente o transporte ser realizado a 5°C. 7.2 Refrigeração: • Colocar em recipiente adequado. Lembrando-se que quando do resfriamento até 5°C deve-se utilizar Containers adequados como o Equitainer ou seus similares nacionais Botutainer (Anexo3) e Botuflex (Anexo1),seguindo regras indicadas pelo fabricante para montar o sistema. Este sistema permite manter a temperatura de 5°C por um período máximo de 48 horas 32 • Para resfriamento entre 15 e 20°C podemos utilizar Botuflex ou Botu-Box (Botupharma) (Anexo2). • Manter fonte de gelo biológica congelada por pelo menos 24 horas em Freezer (-10°C). • Não manter o sêmen por um período de tempo superior a 24 horas quando refrigerado a 15°C. 7.3 Inseminação: • De preferência inseminar antes de 24 horas de refrigeração, queda de fertilidade é esperada quando da refrigeração por mais que 24 hs. • Inseminar a cada 24 horas. • Aplicar HCG ou GnRH(deslorelina) para induzir ovulação e garantir só uma IA. • Não é necessário aquecer em banho-maria . Insemine o sêmen resfriado utilizando o Botu-IA® (Anexo4). • Para a avaliação é necessário aquecer por pelo menos 5 minutos a 37°C 8. CONGELAÇÃO DE SÊMEN 8.1 INTRODUÇÃO A congelação do sêmen trouxe vários benefícios ao sistema de produção dos eqüinos, facilitando o armazenamento por período indeterminado e a comercialização deste material genético, controlando doenças sexualmente transmissíveis e principalmente acelerando o ganho genético. Nos eqüinos esta técnica vem sendo aperfeiçoada, e já apresenta resultados satisfatórios de fertilidade com novos diluentes e crioprotetores. 8.2 MATERIAL NECESSÁRIO A) vagina artificial (modelo Botupharma) B) microscópio C) mesa aquecedora D) vidraria (proveta de 100ml, tubo de ensaio, becker) E) lâmina e lamínula F) palhetas de 0,25 ou 0,5ml (identificadas) As inseminações com sêmen fresco devem ser realizadas utilizando-se entre 500 a 1000x106 sptz viáveis. As amostras com sêmen refrigerado devem conter 1000x106 sptz viáveis . 33 G) Câmara de Neubauer H) pipeta de Sahli ou micropipeta de 20µl (10 a 100µL) I) álcool polivinílico ou bolinhas de metal ou vidro para lacrar palhetas J) diluente para congelação (BOTU-CRIO®) K) uma geladeira (no local) a 5°C para estabilização L) termômetro M) caixa de isopor 37 a 45L (45cm Comprimento x 36cm Largurax 38cm Altura) N) grade para as palhetas (local onde são colocadas as palhetas p/ estabilização), (modelo Botupharma) O) suporte para manter a grade de palhetas acima do nível do N2 (modelo Botupharma) P) botijão de N2 (no local) Q) Banho-Maria 8.3 SEQUÊNCIA PARA CONGELAÇÃO a) Preparo do laboratório Antes de iniciar a colheita do sêmen para congelação, preparar os materiais no laboratório ou sala onde será realizada a congelação. Aferir a geladeira se está entre 4 e 6°C, podendo também utilizar o sistema (Botutainer ou Botuflex para refrigeração a 5ºC). Descongelar os diluentes e colocá-los no banho Maria a 37°C, separar um tubo de ensaio ou Eppendorf com 19 gotas de água destilada ou 190µL de água destilada para a concentração espermática que será acrescido de uma gota (01) ou 10 µL de sêmen respectivamente, caracterizando uma diluição de 1:20 (uma parte de sêmen para 19 partes de água destilada). b) Colheita do Semên O sêmen pode ser colhido com a vagina artificial, modelo (modelo Botupharma) . - Análise dos parâmetros macro e microscópicos do sêmen. - Cálculo do número de palhetas a serem congeladas: Cada palheta deve conter 100 milhões de espermatozóides viáveis. Desta forma para o cálculo do número de palhetas basta dividir por 100 o número total de espermatozóides viáveis do ejaculado. - Ex: Um ejaculado de 50 mL com motilidade total de 80% e concentração espermática de 100 milhões por mL. Total de espermatozóides viáveis neste ejaculado: 50 mL x 100 milhões x 80% = 4 bilhões de espermatozóides viáveis dividido por 100 milhões = 40 palhetas. 34 - Centrifugação: deve ser feita para eliminar o plasma seminal, com sêmen diluído na proporção de 1:1 com Botu-Semen (Botupharma) 600xg ou 2200 rpm por 10 minutos (Ex. centrífuga da Fanem/Baby/n°2 por10 minutos). - Cálculo do volume final de ressuspensão: cada palheta contém 0,5mL, ou seja, multiplicar o número de palhetas por 0,5 que é o volume final da suspensão com o diluente de congelação. - Ressuspensão: Após a parada da centrífuga, o sobrenadante de cada frasco deve ser imediatamente desprezado e os “pellets” devem ser ressuspendidos no diluidor de congelação Botu-Crio® (Botupharma), previamente aquecido e calculado. - Envasamento: Deve ser feito em palhetas de 0,5mL. - Estabilização: 20 minutos em refrigerador a 5oC. - Resfriamento rápido: 15 a 20 minutos em vapor de nitrogênio, mantendo entre 3 e 6 cm acima do nível do nitrogênio líquido, em caixa isopor térmica tampada (37 a 45 litros). - Congelação: imersão das doses no nitrogênio líquido. - Descongelação: Sempre retira-se uma palheta da partida congelada para avaliação do procedimento. Esta palheta pode ser descongelada em Banho-maria a 46°C por 20 segundos e em seguida imergir a 37ºC. Aguardar de 1 a 2 minutos pós descongelação a temperatura de 37ºC para avaliação definitiva. Colocar o conteúdo de uma dose (0,5 ou 0,25mL) num eppendorf de 1,5 a 2,0mL e mantê-lo no Banho- seco a 37ºC ou sobre a mesa aquecedora para análise dos parâmetros. - Análise do sêmen pós-descongelação: Retirando-se a palheta do Banho-maria, deve-se secá-la bem com uma pano ou toalha de papel, para evitar que alguma gota de água entre em contato com o sêmen, posiciona-se a bolha para ponta da palheta e corta-se com uma tesoura na porção onde se localiza o lacre (álcool polivinílico). Verifica-se a motilidade, vigor, a concentração e faz-se um esfregaço, para análise da patologia espermática ou utiliza-se uma preparação com 40µl de solução de trabalho para fluorescência com 10µl de sêmen. Caso não possua microscópio de epi-fluorescência, a amostra congelada poderá ser enviada a Faculdade para análise. Recomenda-se os seguintes requisitos para que uma dose congelada esteja apta inseminação artificial. Motilidade total ≥ 50% Vigor ≥ 3 Porcentagem de patologia espermática aceita: Defeitos menores ≤ 20% Defeitos maiores ≤ 20% Defeitos Totais ≤ 40% 35 CUIDADOS NA INSEMINAÇÃO COM SÊMEN CONGELADO • Programe o momento da ovulação com HCG e ou GnRH(deslorelina). • Inseminar entre 12 horas antes até no máximo 6 horas após a ovulação. • Não diluir a dose inseminante, pois isto pode ser altamente lesivo e provocar dano osmótico. • Sempre que houver dúvidas sobre a manipulação do sêmen pós-descongelação, consulte um profissional mais experiente para orientá-lo(a). 36 8.4 LAUDO UTILIZADO PARA SÊMEN CONGELADO FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária 18618 - 000 - Botucatu/SP - Rubião Junior - Fone/FAX (014) 6802-6.249//6326 LAUDO DE ANÁLISE FISCAL DO SÊMEN CONGELADO DE EQUINO I.-) IDENTIFICAÇÃO ESTABELECIMENTO : PROPRIETÁRIO: NOME DO REPRODUTOR: RAÇA: EMBALAGEM: PARTIDA: Data: II.-) EXAME FÍSICO PÓS-DESCONGELAÇÃO: MÉTODO DE DESCONGELAÇÃO: VOLUME DA DOSE: TOTAL DE ESPERMATOZÓIDES DA DOSE: ANÁLISE SUBJETIVA DA MOTILIDADE ESPERMÁTICA : VIGOR (0-5): ANÁLISE COMPUTADORIZADA ( HTM-IVOS 10) ANÁLISE DA INTEGRIDADE DA MEMBRANA PELA FLUORESCÊNCIA: V.-) OBSERVAÇÃO: VI.-) CONCLUSÕES: Local, ...............Data............... Med. Veterinário Responsável CRMV fmvz-unesp 37 8.5 PROVAS LABORATORIAIS DE INTEGRIDADE DA MEMBRANA PLAMÁTICA Atualmente, um fator de grande importância pesquisado pela sociedade científica, é a integridade da membrana plasmática (IMP) do espermatozóide na pós-descongelação. As colorações simples como o Karras por exemplo não conseguem identificar se a membrana plasmática esta integra ou não. Assim sendo foram desenvolvidas provas que possibilitam identificar essa integridade como: 8.5.1 Coloração supra-vital utilizando eosina É uma prova simples onde se coloca uma gota de sêmen na extremidade de uma lâmina + uma gota deste corante, homogeneiza-se bem as gotas e realiza-se um esfregaço. Após a secagem da lâmina leva-se ao microscópio em aumento de 400 vezes e conta-se 200 células, sendo que os espermatozóides que estiverem com a coloração vermelha estavam com a membrana lesada e permitiram a entrada do corante os demais que não se coraram são classificados como íntegros e o valor é expresso em porcentagem. Espermatozóides vermelhos: Membrana Citoplasmática lesada Espermatozóides brancos: Membrana Citoplasmática íntegra 38 8.5.2 Choque osmótico (Dell'Aqua Jr., et al, 2002) Outra prova bem simples de ser realizada, submete-se o espermatozóide a um estresse osmótico utilizando água destilada aquecida a 37°C, coloca-se uma gota de sêmen em 19 gotas desta água destilada e conta-se também 200 células, sendo que as que apresentarem dobramento de cauda são consideradas íntegras e as que permanecerem retas lesadas. A fisiologia do processo é que as membranas íntegras começam a receber um grande influxo de água pois a água vai do meio menos concentrado no caso a água que tem osmolaridade 0, para o gradiente mais concentrado no caso a célula espermática com osmolaridade próximo de 280Mosmol e esse excesso de pressão dentro da célula faz com que esta se deforme dobrando a cauda. As células que não tinham a membrana íntegra não fazem esta troca osmótica e permanecem esticadas, o resultado é expresso em porcentagem, descontando-se os espermatozóides que já apresentavam caudas dobradas como patologia espermática. Ex. 60% de células dobraram a cauda após o choque osmótico e o touro tinha 5% de caudas dobradas ou enroladas como patologia espermática, logo concluímos que este animal tem 55% de células com integridade de membrana plasmática. Espermatozóides com caudas enroladas: Membrana Citoplasmática íntegra. Espermatozóides com caudas retas: Membrana Citoplasmática lesada. Obs. Não esquecer as caudas dobradas ou enroladas ejaculadas. Fazer o teste com formol-salina para descartar os espermatozóides com defeitos ejaculados. 39 8.5.3 Sondas fluorescentes É uma técnica mais refinada, que necessita de um microscópio de epifluorescência, cujo o custo é elevado, porém pode-se destinar a dose a um centro que possua esse equipamento para realização do exame. São utilizados duas sondas fluorescentes (“corantes”), um é um éster de carboxifluoresceína substância apolar que penetra em membrana íntegra, ela é metabolizada no citoplasma do espermatozóide por esterases lá presentes e transformado em fluoresceína que não consegue sair da célula e emite uma coloração verde. O outro corante é uma substância polar que não consegue penetrar em membrana íntegra. Só o faz quando ela está lesada ao penetrá-la atinge o núcleo do espermatozóide e libera um RNAm que codificará as organelas a produzirem uma fluorescência vermelha. Então as células que se coram de verde são as com membrana íntegra e as que expressarem cor vermelha apresentam algum tipo de lesão em sua membrana. Espermatozóides verdes: Membrana Citoplasmática íntegra. Espermatozóides vermelhos : Membrana Citoplasmática lesada. 40 9. AUTORES Prof. Dr. Frederico Ozanam Papa- Professor Titular do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da FMVZ, UNESP Botucatu - SP- PhD e Pós-Doutorado em Reprodução Animal - Hannover- Alemanha. Email: papa@fmvz.unesp.br Prof. Dr. Marco Antonio Alvarenga - Professor Adjunto do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da FMVZ, UNESP Botucatu - SP PhD em Reprodução Animal - Pós - Doutorado-Universidade do Colorado - USA Email: malvarenga@fmvz.unesp.br Dr. José Antonio Dell'Aqua Junior - Médico Veterinário, Mestrado, Doutorando e Pós-Doutorando na área de Reprodução Animal FMVZ, UNESP Botucatu - SP Email: dellaquajunior@uol.com.br Ms. Gabriel Augusto Monteiro - Médico Veterinário, Residência, Mestrado e Doutorando na área de Reprodução Animal FMVZ, UNESP Botucatu - SP Email: monteiroga@yahoo.com.br É VEDADA A CÓPIA OU MESMO UTILIZAÇÃO EM CURSOS DE REPRODUÇÃO EQÜINA DESTE MANUAL, SEM PRÉVIA AUTORIZAÇÃO DOS AUTORES. 41 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Angus O. McKinnon and James L. Voss. Equine Reproduction, Lea & Febiger, Philadelphia,London, 1993. Antonio Mies Filho. Reprodução dos Animais, 6ª Edição Sulina, Porto Alegre-RS. CARTEE, R.E.; POWE, T.A.; GRAY, B.W.; HUDSON, R.S.; KUHLERS, D.L. Ultrasonographic evaluation of normal boar testicles. Am J Vet Res, v.47, n.12, p.2543- 2544, 1986. CHENIER, T.S. Anatomy and physical examination of the stallion. In SAMPER, C.S. Equine breedins management and artificial insemination. 2 Ed, p.1-17, 2009. DYCE, K.M.; SACK, W.O.; WENSING, C.J.G. Tratado de anatomia veterinária, 3 ed, 2005, 567p. HAFEZ, E. S. E., HAFEZ, B. In: Reprodução Animal. 7.ed. Barueri:Manole, 2004 LOVE, C.C. Ultrasonographic evaluation of the testis, epididymis, and spermatic cord of the stallion. Vet Clin North Am Equine Pract. n.8, v.1, p.167-182, 1992. PAPA, F.O.; ALVARENGA, M.A.; CARVALHO, I.M.; BICUDO, S.D.; RAMIRES, P.R.N.; LOPES, M.D. Coloração espermática segundo karras modificado pelo emprego do barbatimão (Stryphnodendrum barbatiman). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.40, p.115-23, 1988. PAPA, F.O., MELO, C.M.; FIORATTI E.G.; DELLA’QUA, J.A.; ZAHN, F.S.; ALVARENGA, M.A. Freezing of stallion epididymal sperm. Animal Reproduction Science, v.107, p.293-301, 2008. SAMPER, J.C. Management and fertility of mares bred with frozen semen. Animal Reproduction Science, v. 68 p. 219-228, 2001. SAMPER, J.C; PYCOCK, J.F.; MCKINNON, A.O. Current Therapy in Equine Reproduction.1st.Ed, Saunders, Philadelphia, PA, 2007. TURNER, R.M. Ultrasonography of the genital tract of the stallion. In: REEF, V.B. Equine Diagnostic Ultrasound. 446-479, 1998. SULLIVAN, R.; SAEZ, F.; GIROUARD, J.; FRENETTE, G. Role of exosomes in sperm maturation during the transit along the male reproductive tract. Blood Cells, Molecules, & Diseases, v.35, p.1-10, 2005. TURNER, R.M. Ultrasonography of the genital tract of the stallion. In: REEF, V.B. Equine Diagnostic Ultrasound. 446-479, 1998. 42 ACONDICIONAR AS DOSES DE SÊMEN DENTRO DA BOTUFLEX COLOCAR O GELO NA BOTUFLEX TEMPERATURA= 15ºC UTILIZE 1 GELO IMPORTANTE UTILIZAR GELOS PREVIAMENTE CONGELADOS POR NO MÍNIMO 48 HORAS TEMPERATURA= 5ºC UTILIZE 2 GELOS ACOPLAR A TAMPA INTRODUZIR A BOTUFLEX NA CARTOLINA BOTUFLEX NA CARTOLINA PRONTA PARA ENVIO ANEXO 1- MONTAGEM DA BOTUFLEX PASSO A PASSO PPASSA PASSO PASSO 43 ANEXO 2 - MONTAGEM DA BOTUBOX PASSO A PASSO IMPORTANTE UTILIZAR GELOS PREVIAMENTE CONGELADOS POR NO MINIMO 48 HORAS ACONDICIONAR A DOSE DE SÊMEN DENTRO DA BOTUBOX DOSE DE SÊMEN ACONDICIONADA DENTRO DA BOTUBOX COLOCAR O GELO NA BOTUBOX GELO COLOCADO NA BOTUBOX ACOPLAR A TAMPA 44 ANEXO 3-MONTAGEM DA BOTUTAINER PASSO A PASSO COLOCAR O RECIPIENTE TERMO PROTETOR DENTRO DA BOTUTAINER COLOCAR OS GELOS DENTRO DA BOTUTAINER IMPORTANTE UTILIZAR GELOS PREVIAMENTE CONGELADOS POR NO MINIMO 48 HORAS ACONDICIONAR AS DOSES DE SEMEN DENTRO DO RECIPIENTE TÉRMICO DOSES DE SEMEN E GELOS ACONDICIONADOS DENTRO DO RECIPIENTE TÉRMICO BOTUTAINER FECHADO E PRONTO PARA ENVIO DO SEMEN 45 ANEXO 4 COMO UTILIZAR O BOTU-IA? FAÇA A DILUIÇÃO DO SEMEN COM O DILUENTE UTILIZANDO A GRADUAÇÃO DO BOTU-IA QUANDO SE UTILIZA O BOTU-IA PARA TRANSPORTE DE SEMEN, PODE-SE RETIRAR O AR EXCEDENTE DO FRASCO NO MOMENTO DA INSEMINAÇÃO CORTE A PONTA DO BOTU-IA ACOPLE A PONTA DO BOTU-IA NA PIPETA COM A PIPETA NO INTERIOR DO UTERO DA ÉGUA POSICIONE O BOTU-IA PARA CIMA E PRESSIONE O FRASCO PARA INTRODUZIR O SÊMEN. 46 ANEXO 5 COMO MONTAR A VAGINA ARTIFICIAL FIGS.3 e 4) INTRODUZIR A MUCOSA DE PLÁSTICO EXTERNAMENTE A MUCOSA DE LATEX E PRENDÊ-LA. FIG.2) INTRODUZIR A MUCOSA DE LATEX NO TUBO RÍGIDO E PRENDÊ-LA COM ANÉIS (N°4,FIG.1), PARA QUE NÃO VAZE A ÁGUA. 7 2 1 6 4 2 3 4 5 FIG.1) COMPONENTES DA V.A.: (1) Tubo Rígido, (2) Mucosa de Latex, (3) Mucosa Plástica, (4) Anéis de Latex, (5) Camisa interna, (6 e 7) Copo coletor e tampa respect. FIGS.5 e 6) ACOPLAR O COPO COLETOR NA MUCOSA PLÁSTICA, FIXANDO-A COM A TAMPA. Obs. CORTAR DOIS (2) ANÉIS DA MUCOSA DE LATÉX APROX. 4 CM, PARA FIXÁ- LA NO TUBO RÍGIDO (nº4, FIG.1). ANTES DE FIXAR O COPO COLETOR NA MUCOSA PLÁSTICA, INTRODUZIR A CAMISA PLÁSTICA DENTRO DO COPO ( nº5 FIG.1). .
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