Proteinas recombinantes

Prévia do material em texto

Proteinas recombinantes
O que são proteínas recombinantes?
São proteínas produzidas artificialmente a partir de genes clonados. Isto é, advêm da técnica de DNA recombinante.
Genes: O gene é um segmento de uma molécula de DNA (ácido desoxirribonucleico), responsável pelas características herdadas geneticamente. Cada gene é composto por uma sequência específica de DNA que contém um código (instruções) para produzir uma proteína que desempenha uma função específica no corpo
Para que servem?
 A produção de proteínas recombinantes permite obter benefícios em várias áreas:
Saúde:
Biologia
Bioquímica
Microbiologia
Genética
Biotecnologia
Agricultura
Algumas Aplicações:
Terapia de genetica
Criação de modelos de animais
Melhoramento animal e vegetal
Explicar a imagem
Técnica de produção de proteínas 
Isolar e preparar o DNA;
Escolher o vetor apropriado;
O fragmento do DNA a clonar é introduzido em vetores de clonagem, formando o DNA recombinante;
O DNA recombinante é inserido na célula hospedeira, onde ocorre a transformação; que possui mecanismos enzimáticos para a replicação do DNA e para a síntese proteica;
Seleção e identificação de células que incorporam o DNA recombinante;
Verificar se a proteína foi expressa;
Remoção e purificação das proteínas.
Vetor: é todo ser vivo capaz de transmitir um agente infectante, de maneira ativa ou passiva. 
OBS: Este passo-a-passo esta na imagem em seguida
Algumas enzimas envolvidas no processo:
	Enzimas
	Função
	TipoII (endonuclease de restrição)
	Cortam os DNAs em sequências de bases específicas.
	DNA ligase
	Juntam duas moléculas de DNA ou fragmentos.
	Taq DNA polimerase
	Adiciona os nucleotídeos na extremidade 3´ da cadeia de DNA
	Transcriptase reversa
	Produz uma molécula de DNA através de uma molécula de RNA.
Endonuclease: cada uma das enzimas capazes de clivar as ligações entre os nucleotídeos não terminais de uma cadeia de ácido nucleico.
DNA ligase: DNA ligase é a enzima que une os fragmentos de Okazaki, após a retirada dos iniciadores (ou primers) pela DNA polimerase de reparação. Também é utilizada como ferramenta em técnicas de Biologia Molecular para “colar” fragmentos deDNA de interesse.
Taq DNA polimerase: é uma DNA polimerase termoestável, utilizada na amplificação de fragmentos de DNA através da técnica de PCR.
Transcriptase reversa:  é uma enzima encontrada nos vírus cujo material genético é o RNA, também chamados de retrovírus. Essa enzima faz uma transcrição inversa, produzindo uma molécula de DNA a partir de seu RNA.
Enzimas de restrição - Endonuclease
Os fragmentos de DNA usados para criar moléculas recombinantes são normalmente gerados por digestão através de endonucleases de restrição.
Enzimas de restrição: desempenhando função de clivagem (corte) da molécula de DNA em pontos específicos, em reconhecimento a determinadas seqüências de nucleotídeos.
Vetores de clonagem
Capaz de transportar uma sequência de DNA estranha dando origem a um DNA híbrido ou recombinante;
Capacidade de se auto-replicar;
Conter pelo menos um gene que confira resistência a antibióticos;
Possuir locais de restrição únicos;
Fácil de purificar.
Híbrido: diz-se de ou organismo formado pelo cruzamento de dois progenitores de raças, linhagens, variedades, espécies ou gêneros diferentes e que freq. é estéril [O hibridismo, natural ou manipulado, é comum entre as plantas, mas o exemplo mais conhecido é o burro ou mula, cruza entre o cavalo e a jumenta ou entre a égua e o jumento.
Tipos de vectores de clonagem
Plasmídeos; 
Fasmídeos ou fagemídeos;
Cosmídeos;
Bacteriófagos.
Vetores de clonagem: Um fragmento de ADN contendo o gene a ser clonado, é inserido num elemento genético auto-replicante – geralmente um vírus ou um plasmídeo – chamado vector, de modo a produzir uma "quimera" ou "molécula de ADN recombinante". ... Cada célula no clone contém uma ou mais cópias da molécula de ADN recombinante.
Plasmideos: são moléculas circulares duplas de DNA capazes de se reproduzir independentemente do DNA cromossômico. Ocorrem geralmente em bactérias e por vezes também em organismos eucarióticos unicelulares
Fasmideos ou fagemideos: família de insetos 
Cosmideos: é um tipo de vetor de clonagem utilizado em técnicas de biotecnologia para transportar segmentos de DNA tanto para dentro como para fora das células.
Bacteriófagos: odem ser vírus de DNA ou de RNA que infectam somente organismos procariotos
Vetores de expressão
Promotor;
Codão de iniciação seguido de polylinker;
Local de ligação ao ribossoma.
Vetor de expressão: Se os elementos genéticos permitem a expressão em células bacterianas, este é um vetor de expressão procarioto. É o tipo mais utilizado em pesquisas, pois a manipulação de culturas bacterianas é mais fácil. ... O processo de transformação refere-se à introdução de um DNA exógeno em uma célula hospedeira.
Codão de iniciação: codão que assinala o início da síntese de uma proteína; e  polylinker é um sítio de clivagem de endonucleases de restrição no qual é inserido um fragmento de DNA de interesse sem interferir na funcionalidade do plasmídeo
Transformação
Ocorre quando uma célula incorpora e exprime um fragmento de material genético.
Para a introdução do DNA recombinante podem ser utilizados vários métodos:
Células competentes; Transformação de células bacterianas. ... Na transformação química (ou clássica) as células (principalmente de E. coli) são tornadas competentes,
Electroporação; é uma técnica de biologia molecular na qual um campo elétrico é aplicado a células, por forma a aumentar a permeabilidade das suas membranas, permitindo a introdução de fármacos ou DNA nas células.
Bombardeamento de DNA revestido de Tungsténio;
Microinjecção; Consiste na introdução de uma pequena quantidade de DNA diretamente no núcleo da célula-alvo com o auxílio de um aparelho denominado micromanipulador. 
Transfecção; é o processo de introdução intencional de ácido nucleicos nas células
Extração e purificação de proteínas
Extração -> Lise celular 
Purificação -> Cromatografia de afinidade 
Lise celular: é o processo de destruição ou dissolução da célula causada pela rotura da membrana plasmática.
Cromatografia de afinidade: é uma técnica que utiliza propriedades físicoquímicas para separação dos componentes de uma mistura, a partir da distribuição destes em duas fases uma móvel e outra estacionária que se encontram em íntimo contato.
Exemplos de proteínas recombinantes:
Hormona de crescimento humano; é uma proteína e um hormônio peptídico sintetizado e secretado pela glândula hipófise anterior.
Anticoagulantes; os fármacos usados para prevenir a formação de trombos sanguíneos
Dismústase do superóxido; uma enzima extremamente importante devido ao seu efeito antioxidante no nosso organismo, ajudando a prevenir o envelhecimento e morte celular resultado da exposição ao oxigénio da nossa atmosfera
Anticorpos monoclonais; são proteínas usadas pelo sistema imunológico para identificar e neutralizar corpos estranhos como bactérias, vírus ou células tumorais. Um anticorpo reconhece um alvo específico, o antígeno, presente nas células estranhas ao organismo.