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Príncipios	
  de	
  purificação	
  de	
  
biomoléculas	
  
Biotecnologia	
  
Purificação	
  de	
  moléculas	
  
IBF-­‐020	
  
	
  
Purificação 
            
 Proteína isolada proteína pura 
 
 
Características: solubilidade, tamanho, carga e capacidade de ligação a um dado 
ligante. 
 
 
 
Métodos de 
purificação proteína isolada 
Proteínas de uma célula 
•  	
  Qual	
  a	
  atividade	
  biológica	
  desempenhada	
  pela	
  biomolécula;	
  
•  Qual	
  a	
  massa	
  molecular	
  (NCBI	
  e	
  outros	
  banco	
  de	
  dados);	
  
•  Presença	
  de	
  carga	
  elétrica	
  (pI,	
  proteínas)	
  
•  Solubilidade	
  e	
  estabilidade	
  
•  Proteínas:	
  estado	
  oligomêrico/	
  monomêrico,	
  presença	
  ou	
  não	
  de	
  cofatores	
  
Começando a definir a estratégia de 
purificação 
            
Propriedades/Caracterísi9ca	
  da	
  molécula	
  alvo:	
  
•  	
  Qual	
  o	
  grau	
  de	
  pureza	
  desejado?	
  
•  Quais	
  componentes/contaminantes	
  devem	
  ser	
  removidos?	
  
•  Qual	
  é	
  a	
  fonte	
  da	
  molécula	
  
•  Qual	
  a	
  escala	
  e	
  custo	
  da	
  purificação?	
  
•  Qual	
  o	
  rendimento	
  esperado	
  para	
  a	
  molécula	
  purificada?	
  	
  
Definir	
  os	
  obje9vos	
  da	
  purificação:	
  
Custo	
  de	
  até	
  80%	
  do	
  valor	
  total	
  da	
  produção	
  	
  
Pureza, atividade e quantidade final de proteína 
purificada 
            
Para eficiênica e alto rendimento 
 
 Reduzir o número de etapas 
            
Estratégias de purificação 
            
CIPP-­‐	
  capture,	
  intermediate	
  purificaPon	
  and	
  polishing	
  
Parâmetros de performance da purificação 
            
Resolução:	
  Capacidade	
  de	
  separar	
  a	
  molécula	
  
com	
  especificidade;	
  	
  
	
  
Capacidade:	
  o	
  quanto	
  de	
  amostra	
  pode	
  ser	
  
carregada,	
  limite	
  de	
  carreamento;	
  
	
  
Velocidade:	
  tempo	
  para	
  o	
  procedimento	
  
completar;	
  	
  
	
  
Recuperação:	
  o	
  quanto	
  da	
  molécula	
  é	
  
recuperada	
  ao	
  fim	
  de	
  um	
  passo.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Passos inicial: captura 
            
•  Velocidade	
  e	
  Capacidade	
  
Purificação intermediária 
            
•  Resolução	
  e	
  Capacidade	
  
•  Pode	
  ser	
  dispensável	
  
•  Volume	
  reduzido	
  
Polimento 
            
•  Resolução	
  e	
  recuperação	
  
•  Alto	
  custo	
  
Extração	
  -­‐Captura	
  
Purificação	
  intermediária	
  
Polimento	
  
Fluxograma das etapas de purificação 
ORGANELAS 
Lisossomos 
Mitocôndria 
Golgi 
Núcleo 
SOBRENADANTE 
F 1 F 2 F 3 F 4 
F 2 .1 F 2 .2 F 2 .3 
F 2 .3.1 F 2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N 
Centrifugação 
Cromatografia Troca Iônica 
F 2.3.2.X 
 
Uma única proteína purificada 
 
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total 
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) 
Cromatografia de Gel Filtração 
Cromatografia de afinidade 
Precipitação com Sal/Solvente 
Alguns	
  marcos	
  na	
  história	
  da	
  purificação	
  de	
  proteínas	
  
Mikhail	
   =	
   coluna	
   de	
   carbonato	
   de	
   cálcio	
  
para	
  separação	
  de	
  pigmentos	
  de	
  plantas	
  	
  
1990-­‐	
  ….	
  =	
  estruturas	
  resolvidas	
  
2000-­‐	
  ….=	
  proteômica	
  
Em todos os passos devemos: 
            
•  Determinar a atividade biológica da molécula de estudo: 
atividade enzimática ou efeito biológico como ligação a um 
dado ligante. 
 
 
Corante	
  
+	
  	
  
Complexo	
  do	
  produto/corante	
  
-Técnicas colorimétricas 
- Espectofotometria 
 
A	
  razão	
  entre	
  a	
  radiação	
  transmiPda	
  e	
  a	
  radiação	
  absorvida	
  pela	
  amostra	
  
analisada	
  é	
  a	
  transmitância	
  (T).	
  O	
  equipamento,	
  o	
  espectofotomêtro	
  já	
  fornece	
  a	
  
medida	
  em	
  absorbância	
  (A=	
  -­‐logT	
  ).	
  
b	
  
Curva padrão e leituras 
            
Concentrações	
  crescentes	
  de	
  uma	
  molécula	
  padrão	
  
Atividade enzimática 
α-Galactosidase 
            
Componente	
  aPvo	
  nos	
  produtos	
  das	
  empresas	
  	
  Beano	
  (EUA),	
  Suntaqzyme,	
  Bean-­‐zyme,	
  and	
  
Gas-­‐zyme	
  3X,	
  Bloateez	
  (Índia)	
  indicados	
  para	
  reduzir	
  a	
  produção	
  de	
  gás	
  intesPnais	
  após	
  o	
  
consumo	
  de	
  alimentos	
  que	
  os	
  geram.	
  	
  	
  
Apsen	
  Laboratório	
  
Atividade enzimática 
α-Galactosidase 
            
pNPαGAl	
  
pNP	
  
(λmax=410nm)	
  
α-­‐Galactosidase	
  
+	
  
D-­‐galactose	
  
Elevação	
  do	
  pH	
  
1U=	
   quanPdade	
   de	
   produto/substrato	
  
consumido	
  (em	
  µmol)	
  em	
  1	
  minuto	
  de	
  reação)	
  	
  
Determinação da atividade antioxidante 
            
•  Ensaios	
  DPPH	
  e	
  ABTS	
  =	
  indicam	
  a	
  capacidade	
  anPoxidante	
  total	
  da	
  molécula	
  
Radical	
  2,2,difenil	
  1-­‐	
  picril-­‐hidrozila	
  DPPH	
  
difenil	
  1-­‐	
  picril-­‐hidrozina	
  
•  	
  Fenóis	
  
•  	
  Fenilpropanóides	
  
•  Cumarinas	
  
•  Antocianinas	
  
•  Antociadininas	
  
	
  517nm	
  
Imunoensaios 
            	
  
ELISA	
  (enzyme	
  linked	
  immunosorbent	
  assay)	
  	
  
Cadeias	
  laterais	
  
báisicas	
  e	
  
aromá9cas	
   Coomassie	
  G250	
  
Em todos os passos devemos: 
            
•  Determinar a atividade biológica da proteína de estudo: atividade 
enzimática ou efeito biológico 
•  Quantificar as biomoléculas totais: 
Metódos colorimétricos: reação das proteínas com 
um corantes como o ensaio de Bradford 
Leitura	
  595	
  nm	
  	
  
espectrofotômetro	
  
Complexo	
  proteína-­‐	
  
corante	
  
Diretamente proporcional ao seu conteúdo proteico, desde que essas contenham esses 
aminoácidos na sua composição. 
(+) = Metódo não destrutivo. 
Em geral, leitura de 1,0 A280 = [1 mg/mL] 
Comprimento de onda 
A
bs
or
tiv
id
ad
e 
m
ol
ar
, ε
Absorção de luz UV 
            
Trp	
  
Tyr	
  
*Phe	
  
*Contribui	
  pouco	
  
assim	
  com	
  a	
  ligação	
  
dissulfeto	
  
A280	
  
Absorção de luz UV 
            
Absorção	
  a	
  220nm	
  da	
  ligação	
  peppdica	
  
Mais	
  sensível	
  porém	
  maior	
  número	
  de	
  interferentes	
  
que	
   absorvem	
   nas	
   faixas	
   citadas	
   como	
   ácido	
  
núcleicos,	
   fenóis	
   e	
   outras	
   moléculas	
   orgânicas	
  
contendo	
  dupla	
  ligações.	
  	
  
Metódos colorimétricos 
            
Metódo	
  do	
  reagente	
  de	
  Biureto	
  
Reagente:	
  sulfato de Cu+2 em meio alcalino 
(NaOH) e tartarato de sódio como complexante	
  
•  Íons Cu2+ reage com as ligações peptídicas e produz um complexo púrpura 
com 2 bandas de absorção 270 nm e 540 nm. 
•  Baixo custo, pouco sensível 
 
Interferentes	
  na	
  determinação	
  de	
  proteínas	
  totais	
  pelo	
  
método	
  do	
  reagente	
  de	
  Biureto	
  
Metódos colorimétricos 
            
Metódo	
  de	
  Lowry	
  (Lowry	
  et	
  al.,	
  1951)	
  
Reagente:	
  Folin-Ciocalteu 	
  
	
  
•  Sensiblidade	
  superior	
  ao	
  do	
  biureto	
  –	
  grande	
  aplicação	
  
Processa-­‐se	
  em	
  2	
  etapas:	
  
	
  
	
  
1).	
  A	
  reação	
  de	
  biureto	
  
	
  
2).	
  Reaçãode	
  oxido-­‐redução	
  entre	
  o	
  complexo	
  do	
  biureto	
  e	
  o	
  reagente	
  Folin-­‐
Ciocalteu	
  (Molibdato	
  +	
  tungstato	
  +	
  ácido	
  fosfórico) 
	
  
Mo5+,	
  W5+	
  
(cor	
  azul)	
  
Mo6+,	
  W6+	
  
(cor	
  amarela)	
  
2e-­‐	
  
Metódos colorimétricos 
            
Interferentes	
  na	
  determinação	
  de	
  proteínas	
  totais	
  pelo	
  
método	
  de	
  Lowry	
  e	
  colaboradores	
  
Metódos colorimétricos 
            
Metódo	
  de	
  Bradford	
  (Bradford,	
  1976)	
  	
  
	
  
Reagente:	
  Coomassie Brilliant Blue G-250 
	
  •  Método baseado em uma mudança espectral do dye/corante (Absorvance 
shift) induzida pela sua ligação ás proteínas com valor de 595 nm (cor azul). 
 
•  Interação com proteínas se dá através de forças de Van der Waals e 
ligações iônicas, especialmente com arginina, mas também com resíduos 
de histidina, lisina, tirosina, triptofano e fenlialanina. 
Metódos colorimétricos 
            
Metódo	
  de	
  Bradford	
  
Reagente:	
  Coomassie Brilliant Blue G-250 
	
  
BSA=	
  soro	
  albulmina	
  bovina	
  
BGG=	
  gama	
  globulina	
  bovina	
  
Metódos colorimétricos 
            
Metódo	
  do	
  BCA	
  	
  (Smith	
  et.	
  al,	
  1985)	
  
Reagente:	
  ácido 2,2'-Bicinconínico 	
  
•  Íons Cu2+ reduzidos a Cu+ na presença de resíduos de aminoácidos 
específicos de proteínas. 
 
•  O Cu+ reage fortemente com o BCA formando um composto azul com 
leitura a 562nm