Biotec AV2 aula 2

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Biotecnologia da Reprodução – Av2
09/10 – 2º Aula
 
PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES (PIV OU FIV).
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 TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÃO (Recapitulando - AULA PASSADA!)
Na transferência de embriões irá se pegar o embrião fecundado antes que ele desça para o útero e se fixe na parede do endométrio. O embrião será implantado numa receptora que estará na mesma fase do ciclo estral que a doadora. Nesse caso da transferência de embrião, a fecundação ocorre de forma natural, não irá se mexer na fecundação. Não importa se foi por monta natural ou IA.
As éguas respondem muito mal ou não respondem ao processo de superovulação, então não adianta sobrecarregar o animal de FSH que elas não irão produzir mais folículos. A transferência irá ocorrer a cada ciclo onde será retirado apenas um embrião. Ocorre de forma simples pelo embrião ser grande e razoavelmente fácil de ser visualizado a olho nu, lava o útero, mesmo que se saiba de que lado ela ovulou, serão lavados os dois lados, pois o embrião anda muito. Daqui a 21 dias, quando ela entrar no cio de novo, ela é inseminada de novo e o processo todo se repete. Pode ser repetido até 7 vezes durante a estação, dependendo do animal, sem prejudica-lo, diferente do que ocorre com a vaca, onde será usada uma quantidade alta de hormônios.
Na vaca ocorre estimulação com FSH, antes de se estabelecer a dominância folicular, os folículos vão começar a crescer e consegue-se aproveitar uma maior quantidade de óvulos (superovulação). Depois de lavada, aplica-se prostaglandina para tirar os embriões que ainda ficaram e retrabalhar esse animal daqui a 30-60 dias. Deve-se dar um tempo de pelo menos 60 dias na transferência clássica entre uma e outra e na segunda superovulação a vaca será colocada para gestar, para se desintoxicar desses hormônios durante a gestação. Os hormônios ficam acumulados nos tecidos do animal pela alta lipossolubilidade, ficam dissolvidos na gordura desse animal, impregnando os tecidos, então esse animal deve ser deixado um bom tempo sem hormônios para ocorrer a excreção. Por isso o intervalo tem que ser de pelo menos 60 ou 90 dias nesses animais. Pode-se ter problema de cistos ovarianos, desequilíbrio hormonal pela indução de superovulação.
Sem ocorrer o congelamento de embrião, a conta que se faz é de 10 receptoras para uma doadora. No congelamento irá ocorrer uma perda de qualidade, tendo uma viabilidade de 20 a 30% de gestações, nada dramático como na FIV. Os embriões usados na transferência são de melhor qualidade, congelam com maior facilidade. São ORIGINAIS.
Pode-se tirar 15 filhos de uma vaca por ano com essa técnica.
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 FERTILIZAÇÃO IN VITRO
Produção in vitro de embriões ou PIV, porém mais popularmente conhecida como Fertilização in vitro de embriões ou FIV, a fertilização é apenas uma parte do processo. 
Definição: Onde se pega o óvulo antes dele ovular, no ovário. Leva-se para o laboratório, cultiva-se esse óvulo para ficar maduro, fecundar ele (com sptz) e depois se cultiva esse embrião por um período e coloca o mesmo em uma receptora que está em uma mesma fase do ciclo estral. Depois que está na receptora a gestação ocorre normalmente. Esse processo normalmente é desenvolvido em animais e depois é usada na espécie humana.
Hoje muitas dessas técnicas são usadas ou foram desenvolvidas na reprodução humana.
Vantagens: Se recomenda a fecundação em vitro, quando se quer multiplicar uma fêmea de alto valor genético. Pode tirar pelo menos 50 filhos de uma vaca por ano. É a biotecnologia que mais possibilita a multiplicação de uma fêmea melhoradora. Recomendada quando se tem uma raça muito rara numa espécie que tem muitos animais, como por exemplo, a ovelha de lã azul, ou seja, uma raça rara dentro de uma espécie de ovelhas. Uma fêmea que tenha problema adquirido (não genético) de reprodução, ou seja, que por um acaso tenha algum problema (obstrução de trompa e o ovulo não passa), pode se aproveitar o óvulo diretamente no ovário, antes da trompa. 
Esse método, para a doadora, comparado com a transferência de embrião onde se faz uso de hormônio, é melhor para ela. Economiza na quantidade de sêmen, ou seja, se tem o aproveitamento máximo desse sêmen. O sêmen sexado (é a técnica para se usar esse tipo de sêmen, pois tem pouco espermatozoide, é bem mais fraco, normalmente bem “batido” pois o sexo já é definido) é o mais utilizado nesse método, e com uma dose podendo fecundar até 5 vacas. Mais benefícios em geral do que a transferência de embrião – em termos de utilização é a mais usada, cerca de 80%, comparado a 20% da transferência. O Brasil é o que mais faz transferência in vitro no mundo (empresa- In vitro).
Desvantagens: Cuidado, pois pode se reproduzir um animal que normalmente não se reproduziria (genético). Pode se estar reproduzindo animais que possam dar problemas em longo prazo, mais por conta do sptz do que do óvulo. Acaba-se produzindo um pioramente genético.
O produto, o embrião em geral, se deve usar a fresco e não congelados (sua qualidade é bem inferior do que o usado na transferência clássica), pois se não a viabilidade diminui ainda mais. À fresco, tendo 40% de gestação, é muito bom. No congelado, se tiver 10% é muito bom também, isso indica que se perde muito em qualidade. Todo o trabalho deve ser feito rapidamente, em laboratórios bem equipados, é caro.
Características da doadora: Animal de genética superior, ela pode ter algum problema reprodutivo desde que seja adquirido (cérvix torta). Tem que ser um animal que produza bons óvulos, em qualidade e em quantidade. Para descobrir se o animal é uma boa doadora é testando a mesma.
Doadora A: produz muitos óvulos, consegue-se tirar muitos óvulos, porem lá na frente esses óvulos vão virar poucos embriões. Mais para frente ainda pode dar pouca gestações.
Doadora B: produz muitos óvulos, e esses vão dar muitos embriões e lá na frente vão dar poucas gestações. Desses dois exemplos as duas não são boas doadoras, pois a principal característica necessária é a mantença da gestação. O produto final que interessa é a gestação.
Doadora C: produziu poucos óvulos, boa quantidade de embrião e boa gestação.
Doadora D: produziu pouco ovulo, poucos embriões, porém bons embriões, boa gestação.
Doadora E: produziu muitos óvulos, muitos embriões e muitas gestações. (É a vaca dos sonhos!).
Essas variações são individuais. Em geral (quando não se trabalha com hormônios, de uma forma mais natural), o mesmo animal tende a repetir o desempenho. 
Características de uma receptora: A receptora deve ter características igual ou superior em tamanho ao animal doador. Precisa ter sanidade, não pode ter nenhum tipo de doença infectocontagiosa, principalmente na esfera reprodutiva. A receptora tem que ser uma fêmea jovem, pois vai ter menos problemas de histórico reprodutivo ruim – de preferência uma novilha, mas também pode ser uma vaca jovem que tenha um bom histórico reprodutivo ou uma vaca com excelente histórico reprodutivo. Temperamento da receptora tem que ser bom, pois esses animais vão ser muito manipulados, deve-se ter uma boa habilidade materna (carinhosa e cuidadosa com o bezerro), boa produtora de leite. Os produtos quando nascem são muito fracos, bezerros quando nascem de FIV tem problemas respiratórios, diarréia e de umbigo; ou um, ou os dois, ou os três problemas de uma vez - isso se deve a problemas de desenvolvimento de placenta, o desenvolvimento é muito pior do que os dos normais, isso dará problemas para eles lá na frente.
Curiosidade (FIV): A coleta de óvulos é feita em equipes de campo, e transfere o produto para os laboratórios regionais, e posteriormente para os animais de fazenda paraimplantar. O Gargalo de todo esse processo são as receptoras, ou seja, o maior problema é para a fêmea conseguir aceitar uma maior quantidade de óvulos.
A FIV é um trabalho de laboratório, quase que exclusivamente.
O laboratório tem que ser muito bem montado. A qualidade do laboratório é um gargalo muito grande, ou seja, tem que ser um ambiente muito controlado, qualquer contaminação, qualquer coisa fora do normal irá causar a morte desses embriões, pois os mesmos são muito fracos, muito suscetíveis. Deve-se ter uma pré-sala, para receber o material, uma área suja e uma área limpa com capela de fluxo laminar (igual a um laboratório de bacteriologia). 
Os equipamentos são muito caros, sensíveis, e o equipamento principal é a ESTUFA.
ESTUFA: Custa em torno de 20 a 30 mil reais. A estufa vai imitar um útero de vaca, égua o que for tentando reproduzir as mesmas condições (temperatura 38,5 graus de forma constante). A Estufa tem que ter um termômetro, e não se recomenda ficar abrindo e fechando a porta. A estufa tem duas portas, ou seja, a porta de entrada e a outra que na verdade são várias portas (dividida em prateleiras portas de vidro), onde tem as divisões com determinado tipo de material, isso e feito para evitar variação brusca de temperatura. 
Dentro do útero se tem meio micro aeróbio, e a estufa precisa de um ambiente parecido, então essa estufa ela é ligada a um balão, que vai injetar Co2 para dentro do mesmo. Na estufa tem que se ter um sensor para o Co2 e o mesmo deve estar na concentração de 5%. Com relação ao pH, se coloca tudo junto aos óvulos (na placa de Petri) conteúdo com nutrientes, estabilizador de pH, antibiótico (entre outros, como em um diluidor/conversador) e umidade em torno de 70% (+ ou -), colocando um copo com água comum ou água destilada (melhor). Importante que se tenha um gerador também (caso falte luz), e preciso ter reserva de Co2 também. 
No laboratório se necessita de uma boa Lupa, capela de fluxo laminar, água destilada (destilador de agua) para fazer os meios, geladeira para os meios, almoxarifado, micropipetas e ponteiras, necessita de um botijão com sêmen e todos os outros reagentes que serão utilizados.
A fonte de óvulos é o ovário. São duas fontes onde se pode tirar esse óvulo, ou seja, pode se tirar no matadouro (pela evisceração) pegando os dois ovários, colocando-os em um isopor e leva o mais rápido possível para o laboratório e a outra forma é com o animal vivo. Quando se coletar esse material, deve-se tomar cuidado com o choque térmico. 
No laboratório se vê no ovário os folículos, corpo lúteo e etc. Se aspira os folículos e cultiva o material. 
Para aspirar se necessita de apenas uma seringa com agulha, joga em um meio de cultura. Depois de aspirado, se fatia o ovário e na camada cortical se aparece mais e continua aspirando, limpando de maneira geral esse ovário.
A genética desses ovários é de uma vaca de matadouro, de animais mortos geralmente são usados para estudo, desenvolver técnicas, testar viabilidade (fertilidade) de sptz, enfim, basicamente para estudo e desenvolvimento de técnica.
Na estufa geralmente se tem duas baterias. Uma bateria onde se tem o material do cliente e outro o material do matadouro.
A segunda fonte foi desenvolvida baseada em mulher e depois nos animais. Ocorre uma técnica de aspirar esses óvulos em uma mulher viva diretamente no ovário (técnica de aspiração folicular), baseada em cima do uso de ultrassom. 
Faz-se o ultrassom transvaginal com sonda frontal (emissão de ondas). Pela vagina se coloca o probe de ultrassom que vai emitir frontalmente o raio em leque, por baixo da cérvix e com a mão no reto se trás o ovário em direção ao feixe. Na imagem do ultrassom avalia-se pontos pretos (anecóicos) mostrando onde estão os folículos. E para retirar os folículos, no mesmo aparelho de ultrassom se tem 2 canos, um ligado na probe de ultra, e o outro se tem como se fosse uma muleta onde na ponta se tem uma agulha ligada em um tubo, e se tem uma bomba (igual a de dentista) que puxa os folículos (por vácuo). Aspira vários pontos e o material vai caindo em um recipiente apropriado. Deve se anotar nesse recipiente o número da vaca, que horas iniciou e hora que terminou e mensurar mais ou menos a quantidade de óvulos que ele enviou, em todo esse processo é necessário se fazer uma anestesia epidural baixa (se for alta o animal cai). A desvantagem da técnica é que pode fibrosar o ovário e com o tempo vai perder a capacidade de gerar folículos. Terminado tudo e envia ao laboratório. 
Chegando ao laboratório, se recebe o material colocando ele em um filtro de embrião (pois o material vem com sangue e outras sujidades), com o soro fetal bovino que já veio e tem que lavar esse material várias vezes. Depois que fica claro sai da parte suja do laboratório e vai para a área limpa. A temperatura de todo esse processo tem que estar em torno de 37 graus (de chegada - dentro da própria bomba se tem um termostato que mantém a temperatura).
Na parte limpa se faz a seleção dos óvulos que vieram. O bom óvulo é o que tem toda a estrutura preservada, com zona pelúcida e etc. Um óvulo sem zona pelúcida, mais desnudo, pode ser devido a bomba com muita pressão que acaba rasgando, deve ser regulado entre a equipe de trabalho. Depois de selecionado vai se colocar no meio de cultura que se compra pronto, ou se faz. Depois se coloca dentro de uma estufa portátil (para transporte para o laboratório caso esteja longe). Deixa cultivando esses óvulos por 24 horas. Depois disso se faz a fecundação in vitro.
Nas placas de cultura se tem uns buraquinhos, onde cada um se tem um óvulo, geralmente é uma placa para cada doadora - na mesma placa se tem um meio com nutriente, tampão, antibiótico, ambiente micro aeróbio por causa do Co2 dentro da estufa, além de óleo mineral (que irá bloquear a entrada de oxigênio) para auxiliar na micro aerobiose.
Para fazer a fecundação pode se fazer uma imersão de espermatozoide no meio de cultura, porém se precisa fazer a capacitação do mesmo antes de aplicar no meio de cultura.
Pode se separar os sptz em uma centrifugação pegando os vivos e deixando os mortos, ou por filtragem onde só passa os sptz com condições (atravessando o filtro que estará imerso em um meio e a tendência do espermatozoide é nadar para cima, os mortos ficam presos no filtro) e coleta os mesmos. E esse meio de filtragem pode conter heparina que já capacita os mesmos, demora em torno de 1h30.
Uma dose de sêmen de bovino se tem no mínimo 10 milhões e para fazer uma inseminação, nesse caso se precisa de apenas uns 200 a 500 sptz. Por isso se consegue aproveitar bastante esse sêmen, vai se economizar muito.
Nessa etapa é importante usar sêmen sexado, pois caso o contrário o número de machos vai ser maior (70 a 80% de machos), pois os sptz com cromossomo Y são mais leves do que os que possuem o cromossomo X (tem 5% a mais de DNA), portanto passam mais rápido pela filtragem. Para se saber se houve fecundação nesse óvulo vai se observar se houve multiplicação celular, ou seja, em torno de 48 depois da FIV, se observa na célula a taxa de clivagem (multiplicação) e isso diz que o sêmen é bom ou ruim (taxa). Os óvulos não clivados são aproveitados para os outros que clivaram, pois se produzirá substâncias favoráveis para os mesmos, depende do laboratório. Depois da clivagem se coloca em um novo meio, pois as exigências são diferentes, ou pode não botar mantendo no mesmo, vai depender do laboratório. Depois dessa clivagem se volta para a estufa até o 7º dia. Depois desse tempo se avaliar e se estiver tudo ok, vão para as respectivas receptoras.
A questão das baterias se faz, pois, serve para determinar de onde se vem os erros (como um marcador). Pois caso uma cultura funcione, pode se dizer que o erro não é do laboratório.