Resumo biologia molecular

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Heredograma 
Para entendermos melhor a genética, podemos representar determinadas 
características em heredogramas. Um heredograma é uma árvore 
genealógica que mostra uma história familiar. 
 
 
Nos heredogramas é representado apenas o fenótipo do indivíduo, e cabe a 
nós descobrir se é um caráter dominante ou recessivo, e se os indivíduos 
representados são homo ou heterozigotos. 
 
Primeiramente temos que entender melhor a diferença entre homozigotos e 
heterozigotos. Homozigotos são os indivíduos que apresentam alelos iguais 
para determinada característica, podendo ser homozigoto dominante quando 
os dois alelos são dominantes ou homozigoto recessivo quando os dois alelos 
presentes são dominantes. Heterozigotos são os indivíduos híbridos, que 
apresentam um alelo dominante e um alelo recessivo. 
 
Agora temos que saber também o que é um caráter dominante ou recessivo. 
Vocês se lembram da aula da 1ª lei de Mendel? Naquele caso o caráter 
semente amarela era dominante sobre o caráter semente verde. Um caráter 
dominante está presente em todas as gerações, pois a presença do alelo 
dominante já significa a manifestação do fenótipo associado. Já um caráter 
recessivo pode pular gerações, pois a presença de um alelo em um indivíduo 
pode passar despercebido por estar mascarado pelo alelo dominante. 
 
Vamos alguns exemplos para esclarecer o assunto. Abaixo está 
o heredograma de uma família representando uma doença hereditária. Ela é 
dominante ou recessiva? 
 
 
Pelo heredograma podemos dizer que a doença em questão (em preto) é 
dominante, pois está presente em todas as gerações. Podemos observar que a 
característica normal pula gerações, surgindo no indivíduo 14 que possui pais 
com a doença, mostrando que o normal é o recessivo. Podemos inferir então 
que os indivíduos 1, 4, 7, 12 e 13 são heterozigotos, pois só assim é possível 
que haja filhos homozigotos recessivos, já que é necessário um alelo recessivo 
vindo de cada parental. 
 
Vamos a outro exemplo. A característica abaixo é dominante ou recessiva? 
 
 
A característica é recessiva, pois ela “surge” de pais que não possuem o 
fenótipo em questão, mas que carregam os alelos recessivos. Por isso 
podemos dizer que os indivíduos 1, 2, 3 e 4 são heterozigotos. Todos os 
indivíduos afetados são homozigotos recessivos. 
 
Será que você já está craque em decifrar heredogramas? A doença abaixo,é 
de caráter dominante ou recessivo? 
 
 
Se você pensou dominante, acertou! Porque filhos afetados possuem sempre 
pais afetados e, portanto, a característica não “pula” gerações. 
 
Algumas características já sabemos “de cara” que são dominantes 
simplesmente pela observação cotidiana, como por exemplo cabelo crespo é 
dominante sobre cabelo liso, pele pigmentada é dominante dobre pele albina, 
destro sobre canhoto, assim como muitas outras. 
 
Todos os exemplos são de doenças ou características monogênicas, ou seja, 
que são causadas por um único gene, e que possuem somente dois alelos 
envolvidos. Existem heredogramas mais sofisticados, que consideram mais 
genes ou mais alelos, mas vamos deixar esse assunto para uma próxima aula. 
 
Marcadores Moleculares 
 
 A idéia de que os cromossomos contêm as unidades informacionais 
transferidas de uma geração para a outra foi proposta ainda no século 
XIX. Entretanto, a identificação e descrição do DNA como a molécula 
que contém esta informação só ocorreu na primeira metade do século 
XX. Cada cromossomo contém uma longa e única molécula de DNA, 
além de proteínas que atuam no empacotamento desta molécula. As 
tecnologias de análise molecular da variabilidade do DNA permitem 
determinar pontos de referência nos cromossomos, tecnicamente 
denominados “marcadores moleculares”. 
 
 
Figura. 1. Dogma Centra da Biologia Molecular, evidenciando a 
influência direta do DNA no fenótipo. 
 
 Por marcador molecular define-se todo e qualquer fenótipo molecular 
oriundo de um gene expresso, como no caso de isoenzimas, ou de um 
segmento específico de DNA (correspondentemente a regiões 
expressas ou não do genoma). Marcadores isoenzimáticos são muitas 
vezes chamados de marcadores bioquímicos. A sequência de 
nucleotídeos e a função de um marcador molecular podem ou não ser 
conhecidas e, em geral, são desconhecidas. Ao se verificar o seu 
comportamento de acordo com as leis básicas de herança de Mendel, 
um marcador molecular é adicionalmente definido como marcador 
genético. Isto é feito, por exemplo, através do estudo do comportamento 
do marcador em uma população segregante. Portanto, é importante 
enfatizar que o simples fato do marcador ser DNA, ou produto da 
transcrição e tradução de uma sequência de DNA, não implica em que 
se constitua em um marcador “genético”, como freqüentemente se 
supõe. 
 Até meados da década de 60, os marcadores utilizados em estudos 
de genética e melhoramento eram controlados por genes associados a 
caracteres morfológicos, em geral fenótipos de fácil identificação visual, 
como nanismo, deficiência clorofílica, cor de pétala ou morfologia foliar. 
Marcadores morfológicos contribuíram significativamente para o 
desenvolvimento teórico da análise de ligação gênica e para a 
construção das primeiras versões de mapas genéticos. 
 Entretanto, o pequeno número de marcadores morfológicos distintos 
em uma mesma linhagem reduzia a probabilidade de se encontrar 
associações significativas entre estes marcadores e caracteres de 
importância econômica através do estudo de populações segregante. 
Portanto, só ocasionalmente é que marcadores morfológicos ligados a 
genes de importância econômica eram identificados, limitando seu 
emprego em programas de melhoramento. Além disso, a disponibilidade 
de marcadores morfológicos era essencialmente restrita às poucas 
espécies de plantas utilizadas como sistemas modelo para o estudo da 
genética, tais como milho, tomate e ervilha, onde a intensidade de 
estudos e disponibilidade de informações genéticas eram maiores. 
 A revolução neste quadro iniciou-se com o desenvolvimento de 
marcadores isoenzimáticos. O número de marcadores genéticos foi 
ampliado em pelo menos uma ordem de magnitude, e a aplicabilidade 
da técnica passou a incluir potencialmente todas as espécies de plantas. 
Com o advento das técnicas modernas da biologia molecular, surgiram 
diversos métodos de detecção de polimorfismo genético diretamente ao 
nível de DNA. Inicialmente, a utilização de enzimas de restrição permitiu 
a análise de comprimento de fragmentos de restrição de DNA (RFLP – 
Grodzicker et al., 1974). Mais recentemente, o desenvolvimento do 
processo de amplificação em cadeia utilizando uma DNA polimerase 
(PCR – Mullis & Faloona, 1987; Saik et al., 1988) levou à descrição de 
outras classes de marcadores moleculares. Aliadas às técnicas de 
clonagem e seqüenciamento de DNA, estas metodologias têm 
possibilitado um rápido acúmulo de informações sobre a estrutura de 
genomas eucariotos. A disseminação do seu uso contribuiu para a 
descoberta e estudo de diversas classes de seqüências repetitivas de 
DNA, chamadas de mini e microssatélites, outra rica fonte de 
polimorfismo genético. Hoje, um número ilimitado de marcadores 
moleculares altamente polimórficos pode ser obtido em qualquer 
organismo vivo. 
 Algumas das vantagens de marcadores moleculares sobre 
marcadores morfológicos: 
 (1) Muito esforço e planejamento são necessários para se construir 
um mapa a partir de marcadores morfológicos uma vez que um número 
reduzido de marcadores por linhagem restringe a cobertura de genoma. 
Por outro lado, um grande número de locos de marcadores moleculares 
pode ter seus alelos estudados em populações segregantes de 
cruzamentos específicos. 
 (2) Marcadores moleculares são, em geral, neutros em relação a 
efeitos fenotípicos, commínimo ou nulo efeito epistático ou pleiotrófico. 
Enquanto os morfológicos muitas vezes coíbem ou restringem o 
desenvolvimento normal da planta (albinos, mutantes clorofílicos), e seu 
controle genético pode afetar, ou ser afetado, por genes controlando 
outros caracteres, dificultando a caracterização dos genótipos. 
 (3) Em geral os marcadores moleculares são co-dominantes, 
contendo maior quantidade de informação genética por loco. Já os 
marcadores morfológicos são em sua maioria dominantes ou recessivos. 
 Além destes aspectos, os marcadores morfológicos apresentam 
ainda a desvantagem de serem somente identificados ao nível de planta 
adulta. Entretanto os moleculares podem ser utilizado sem qualquer 
estágio de desenvolvimento da planta, desde que suficiente DNA possa 
ser obtida. A identificação de genótipos em estágios iniciais de 
desenvolvimento da planta abre a possibilidade de acelerar o processo 
de seleção e recombinação dos indivíduos desejados, reduzindo o 
tempo necessário para completar uma geração de melhoramento, o que 
aumenta consideravelmente a eficiência do programa. 
 Atualmente se dispõe de um grande arsenal de métodos para a 
análise de marcadores moleculares, entretanto, falaremos apenas sobre 
aqueles que são mais empregados. A maioria dos métodos de detecção 
de polimorfismos moleculares emprega a técnica de eletroforese, cujos 
princípios estão ilustrados na figura abaixo: 
 
 
 
 
Principais Classes de Marcadores Moleculares para Análise Genética 
 
 Atualmente, existe grande número de tecnologias de genética 
molecular que pode ser utilizada para fornecer informações úteis aos 
estudos genéticos e no melhoramento genético de plantas e animais. 
Cada tecnologia apresenta vantagens e desvantagens. O uso de uma 
ou de outra vai depender, entre outros fatores, do objetivo do estudo, da 
infraestrutura disponível, dos recursos financeiros para o investimento, 
da disponibilidade de recursos humanos com treinamento apropriado e 
nível de conhecimento da genética molecular da espécie a ser estudada. 
 
 
Isoenzimas 
 
 O termo isoenzimas define um grupo de múltiplas formas 
moleculares da mesma enzima que ocorre em uma espécie, como 
resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma das 
enzimas (Moss, 1982). O princípio básico da técnica reside no uso de 
eletroforese em geral de amido (Smithies, 1955) e na visualização do 
produto enzimático por métodos histoquímicos (Hunter & Markert, 
1957). A difusão de seu uso ocorreu através do desenvolvimento de 
métodos eficientes para visualização do produto enzimático e da 
aplicabilidade imediata encontrada em várias áreas de biologia. As 
isoenzimas têm sido utilizadas no estudo de dispersão de espécies, na 
análise de filogenias, no melhoramento de plantas, possibilitando a 
detectação de ligação gênica com caracteres mono e poligênicos, 
identificação de variedades, na seleção indireta de caracteres 
agronômicos, introgressão gênica e avaliação germoplasma. 
 Base genética dos marcadores isoenzimáticos: As isoenzimas 
desempenham a mesma atividade catalítica, mas podem ter diferentes 
propriedades cinéticas e ser separadas por processos bioquímicos. O 
número de isoenzimas de uma determinada enzima está relacionado ao 
número de compartimentos subcelulares onde a mesma reação 
catalítica é realizada (Gottlieb, 1982). 
 A premissa básica adotada ao se utilizar dados enzimáticos é que 
diferenças na mobilidade de isoenzimas em um campo elétrico são 
resultantes de diferenças ao nível de seqüencias de DNA que 
codificam tais enzimas. Assim, se os padrões de bandas de dois 
indivíduos diferem, assume-se que estas diferenças possuam base 
genética e sejam herdáveis (Murphy et al., 1990). Para interpretar os 
padrões de bandas resultantes, é importante ter um conhecimento 
prévio sobre o número de subunidades da enzima – enzimas 
monoméricas são formadas por um polipeptídeo, enquanto as diméricas 
por dois. Indivíduos heterozigotos para uma enzima dimérica, além de 
duas bandas correspondentes aos dois polipeptídeos, apresentam uma 
terceira banda intermediária, produto da conjugação dos dois 
polipeptídeos. É comum observar-se mais de um loco gênico em um 
mesmo gel, e a migração das bandas de cada loco é visualizada em 
zonas diferentes. As subunidades de uma enzima podem ser 
codificadas por locos genéticos distintos, tornando mais complexa à 
análise do padrão de bandas isoenzimáticas. 
 Detecção de marcadores isoenzimáticos: Envolve basicamente 
três etapas: extração de proteínas do tecido vegetal, separação destas 
proteínas através de eletroforese e coloração histoquímica do gel, o 
que permite a visualização do produto em forma de uma “banda”. Uma 
vez identificado o tecido, este é macerado na presença de um tampão 
que permita a extração das proteínas, a manutenção de sua atividade 
catalítica e a prevenção de oxidação de compostos fenólicos 
associados. O extrato é então separado em gel de eletroforese. Após a 
eletroforese, as isoenzimas são visualizadas através de corantes 
histoquímicos específicos, os quais fornecem um sub strato para as 
enzimas. A eletroforese é uma entre várias formas de caracterização 
de isoenzimas e muitas variações podem não ser detectadas por esta 
técnica. 
 Vantagens e limitações dos marcadores isoenzimáticos: Geralmente 
fornecem ampla informação genética para diversas aplicações, sua 
técnica é relativamente barata acessível. Embora em número limitado, 
vários locos isoenzimáticos podem ser analisados rápida e 
simultaneamente. Por isso, mesmo hoje, com técnicas mais modernas, 
as isoenzimas continuam sendo uma classe de marcadores muito útil 
para análises genéticas que não requeiram uma amostragem ampla 
do genoma. Alelos isoenzimáticos são co-dominantes, isto é, 
genótipos heterozigotos e homozigotos de um determinado loco são 
facilmente identificados, permitindo estimar parâmetros tais como 
frequências genotípicas e alélicas e a partir destes, coeficientes de 
diversidade gênica e heterozigosidade. 
 Porém, quando a investigação requer uma cobertura mais ampla do 
genoma, como no caso de mapeamento genético ou caracterização 
detalhada de germoplasma, as isoenzimas apresentam duas limitações 
básicas: o número total de locos que podem ser detectados no genoma 
e o número de alelos por loco, isto é, o nível de polimorfismo genético 
detectável em cada loco. Outras limitações das isoenzimas como 
marcadores dizem respeito a: modificações pós-tradução das enzimas, 
produzindo as “isoenzimas conformacionais”, as quais diferem em 
estruturas secundárias e terciárias; polimorfismo enzimático em 
resposta a condições ambientais; diferenças na atividade isoenzimática 
associadas a estágios diferentes de desenvolvimento; dentre outras. 
 
 
Figura 4. Eletroforese de Isoenzimas. A identificação dos alelos 
isoenzimáticos em gel de eletroforese é feita através da visualização do 
produto (muitas vezes indiretos) da reação por eles catalisada. A enzima 
resulta da transcrição e tradução da informação contida na fita do DNA. 
 
 
Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição - RFLP 
 
 Por RFLP entende-se o polimorfismo no comprimento de fragmentos 
obtidos por corte da fita dupla de DNA, que é evidenciado pela 
fragmentação do DNA através do uso de enzimas de restrição e 
observado por hibridização destes fragmentos com sequências 
homólogas de DNA marcadas com radioatividade ou compostos que 
desencadeiam uma reação de luminescência. Para que o polimorfismo 
seja detectado, é necessário que as sequências de nucleotídeos nas 
fitas de DNA de dois ou mais indivíduos comparados sejam distintas. 
 Há 25 anos os marcadores RFLP foram estudados pela primeiravez 
em um experimento destinado à detectação de mutações em DNA de 
vírus (Grodzicker et al., 1974). Em pouco tempo estes marcadores 
tornaram-se ferramenta importante em várias áreas de biologia e têm 
sido utilizados para aprofundar o conhecimento de diferentes temas 
biológicos. 
 Base genética dos marcadores RFLP: O polimorfismo observado na 
técnica de RFLP ocorre porque o DNA de indivíduos geneticamente 
distinto difere na sequência de nucleotídeos ao longo da fita. A 
presença ou ausência de sequências específicas de 4 a 8 pares de 
bases, reconhecidas e clivadas pelas enzimas de restrição, pode variar 
entre diferentes indivíduos, gerando polimorfismo. Ao ser submetido à 
clivagem com uma enzima de restrição, o DNA de indivíduos 
geneticamente distintos é cortado nos sítios de restrição, gerando 
fragmentos de diferentes tamanhos. A base genética do polimorfismo 
observado resulta de mutações nos sítios de restrição, deleções e 
rearranjos entre os sítios. 
 Obtenção de sondas para detecção dos marcadores RFLP: Os 
clones a serem utilizados como sondas podem ser obtidas de diferentes 
formas, as mais comuns sendo: através da transcrição reversa de 
mRNA do organismo em estudo, produzindo-se uma biblioteca de 
moléculas de DNA complementar (“cDNA library”); de fragmento de 
DNA genômico clonados ao acaso (“genomic library”); da amplificação 
via PCR de sequências conhecidas utilizando primers específicos; e por 
fim, através de bandas RAPD selecionadas e obtidas de gel de 
eletroforese, e amplificadas via PCR. 
 Depois de obtida a coleção de clones, faz-se uma seleção daqueles 
que serão utilizados como sondas, o objetivo deste processo, é 
selecionar clones que possuam cópia única, ou seja, que não 
contenham sequência de DNA repetitivo, pois estes hibridizam com 
vários fragmentos na membrana, o que resulta em borrões não 
interpretáveis em padrões de bandas múltiplas difíceis de acompanhar 
do ponto de vista de distinção de locos, alelos e segregação 
Mendeliana. 
 Vantagens e limitações dos marcadores RFLP: Comparados às 
isoenzimas, os marcadores RFLP possuem a vantagem de cobrir todo o 
genoma do organismo estudado. Possuem expressão co-dominante, 
isto é, em cada loco estudado é possível identificar genótipos hetero e 
homozigotos, gerando mais informações e permitindo uma análise 
detalhada da ação gênica e da interação entre os alelos. Ao contrário 
das isoenzimas, o número de marcadores RFLP é praticamente 
ilimitado, e o nível de polimorfismo alélico em cada loco é muito maior. 
Outra característica de marcadores de DNA em relação à isoenzimas é 
a alta estabilidade do DNA, que pode ser extraído, conservado e 
reutilizado por longos períodos de tempo. As membranas de 
hibridização também podem ser conservadas e reutilizadas por 15 ou 
mais vezes, o que assegura que o processo de obtenção das mesmas 
seja compensado por seu prolongado uso. 
 Sabendo que a maioria dos experimentos de melhoramento genético 
envolve a análise de centenas de indivíduos para vários locos 
marcadores, é fundamental que a técnica de marcadores moleculares 
utilizada seja eficiente na geração de dados e possa, em algum tempo 
ser automatizada. A técnica de RFLP apresenta uma série de limitações 
neste aspecto, uma vez que envolve vários passos intensivos em mão 
de obra. Outra limitação que se apresenta ao se iniciar um projeto é a 
inexistência de uma. Frequentemente, ao se iniciar um projeto não há 
uma biblioteca de sondas disponível, esta, portanto, deverá ser obtido 
em outro laboratório, o que leva vários meses. O uso de RFLP requer 
um pessoal técnico habilitado para a manipulação de DNA 
recombinante, neste aspecto é uma técnica mais complexa do que a 
isoenzimas. Estes aspectos têm tornado limitado o uso do RFLP. 
 
 
Figura 5. Autoradiografia de uma membrana de hibridização 
revelando marcadores RFLP. Indivíduos homozigotos para alelos A1(3, 
5, 6, 7, 8,9) e Homozigotos para os alelos A2 (1, 2,4) de um loco RFLP 
são identificados. 
 
 
Marcadores Baseados em Reação da Polimerase em Cadeia - PCR 
 
 A tecnologia da PCR foi concebida em meados da década de 80 
(Mullis & Faloona, 1987; Saiki et al., 1985). Desde então esta tecnologia 
causou uma revolução na biologia, na pesquisa visando o entendimento 
de processos biológicos fundamentais como nas áreas de 
melhoramento genético de plantas e animais domésticos, uma vez que 
esta técnica possibilitou a geração de grandes quantidades de DNA de 
segmentos específicos, podendo ser facilmente detectado a olho nu em 
gel de eletroforese através de corantes específicos. 
 PCR é uma técnica poderosa, que envolve a síntese enzimática in 
vitro de milhões de cópias de um segmento específico de DNA na 
presença da enzima DNA polimerase. Sua reação baseia-se no 
anelamento e extensão enzimática de um par de oligonucleotídeos 
(pequenas moléculas de DNA de fita simples) utilizados como 
indicadores (“primers”) que delimitam a sequência de DNA de fita dupla 
alvo da amplificação. 
 A PCR ocorre em vários ciclos, onde, em cada um deles, a cadeia 
específica teoricamente dobra de tamanho. Atenção: a frase "reação de 
PCR" é redundante, significa reação de reação em cadeia da 
polimerase! Abaixo está representado um ciclo de uma PCR, onde a 
polimerase do DNA é uma esfera verde, a cadeia "antiga" é azul, um 
primer é azul claro e o outro é verde, os nucleotídeos são vermelhos, 
assim como a cadeia sintetizada no presente ciclo: 
 
 
Figura 6. Ciclo de uma PCR 
 
 Um ciclo de PCR envolve três etapas: desnaturação, anelamento e 
extensão. A fita dupla do DNA alvo é desnaturada através da elevação 
da temperatura para 92°C a 95°C. Na etapa de anelamento, a 
temperatura é rapidamente reduzida para 35°C a 60°C, dependendo do 
tamanho e sequência do primer utilizado, permitindo a hibridização 
DNA-DNA de cada primer com as sequências complementares que 
flanqueiam a região alvo. Em seguida, a temperatura é elevada 
para 72°C para que a enzima DNA polimerase realize a extensão a 
partir de cada terminal 3’ dos primers. Esta extensão envolve a adição 
de nucleotídeos utilizando como molde a sequência-alvo, de maneira 
que uma cópia desta sequência é feita no processo. Este ciclo é 
repetido por algumas dezenas de vezes. Uma vez que a quantidade de 
DNA da sequência alvo dobra a cada ciclo, a amplificação segue uma 
progressão geométrica de maneira que, depois de apenas 20 ciclos, é 
produzido mais de um milhão de vezes a quantidade inicial de 
sequência alvo. Esta escala de amplificação permite iniciar com 
quantidades mínimas de DNA (da ordem de picogramas ou 
nanogramas) e terminar a reação com grandes quantidades de DNA de 
uma sequência específica de interesse. 
 
 Porém, a construção de primers para amplificação via PCR depende 
do conhecimento prévio das sequências de nucleotídeos que flanqueiam 
a sequência de DNA de interesse. Para conhecer estas sequências é 
necessária a clonagem e sequenciamento da região. Em vista disso, 
com exceção de alguns genes de sequência conhecida, a PCR 
apresentou de início, um uso limitado como técnica para a obtenção de 
marcadores moleculares. 
 
 
Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso - RAPD 
 
 O grande avanço na área de marcadores moleculares baseados em 
PCR ocorreu em 1990, com a idéia de utilizar primers mais curtos e de 
sequência arbitrária para dirigir a reação de amplificação, eliminando 
assim a necessidade do conhecimento prévio de sequência. A técnica 
foi desenvolvida por dois grupos nos Estados Unidos (Williams et al., 
1990). Foi descrito no trabalho, a técnica no contexto da análise 
Mendeliana, demonstrando a identificação de marcadores genéticos 
para melhoramento.Além de facilitar e acelerar os estudos que já 
ocorriam com as espécies tradicionais (ex: milho, tomate, arroz) a 
tecnologia RAPD permitiu a realização de estudos em espécies 
anteriormente não contempladas. As aplicações incluem: 
 (1) Obtenção de “fingerprints” (impressões digitais) genômicos de 
indivíduos, variedades e populações; 
 (2) Análise da estrutura e diversidade genética em populações 
naturais, populações de melhoramento e bancos de germoplasma; 
 (3) Estabelecimento de relacionamentos filogenéticos entre diferentes 
espécies; 
 (4) Construção de mapas genéticos de alta cobertura genômica e a 
localização de genes de interesse econômico. 
 
 Base genética dos marcadores RAPD: É basicamente uma variação 
do protocolo de PCR, com duas características distintas: 
 • Utiliza um primer único ao invés de um par de primers; 
 • O primer único tem sequência arbitrária, e portanto sua 
sequência alvo é desconhecida. 
 Para que haja amplificação de um fragmento RAPD no genoma, duas 
sequências de DNA complementares ao primer arbitrário devem estar 
suficientemente adjacentes (< 4000 pares de bases) e em orientação 
oposta, de maneira a permitir a amplificação exponencial de um 
segmento de DNA pela DNA polimerase. Em função da grande 
quantidade de DNA produzido, este segmento pode ser visualizado na 
forma de banda num gel de eletroforese. Cada primer arbitrário dirige a 
síntese de vários segmentos de DNA simultaneamente em diversos 
pontos do genoma, resultando em várias bandas no gel. 
 Dados experimentais de mapeamento genético em diversas espécies 
indicam que os locos de marcadores RAPD estão distribuídos ao acaso 
ao longo do genoma, sem evidências de agrupamento de marcadores 
em regiões específicas. As sequências internas dos segmentos 
amplificados pertencem a todas as classes de abundância de DNA no 
genoma, desde sequências de cópia única até altamente repetitivas. 
 A competitividade de um sítio de amplificação arbitrária é 
determinada pela homologia com o primer utilizado. Claramente, 
segmentos RAPD são amplificados mesmo que a homologia entre os 
sítios de iniciação e o primer não seja perfeita. O pareamento perfeito na 
extremidade 3’ do primer, a partir da qual a polimerização inicia, parece 
ser mais crítico que o pareamento na extremidade 5’. Algum nível de 
não homologia é permitido, o que varia com a composição de bases. 
Pareamento CG são mais estáveis que AT, o que afeta diretamente o 
tempo de residência do primer no sítio de iniciação da amplificação. Se 
este tempo for muito curto, a estabilização do pareamento do primer 
com o sítio de iniciação no DNA molde será prejudicado. Como 
resultado, o segmento poderá não ser amplificado, gerando em uma 
banda fraca no gel. 
 Uma característica fundamental dos marcadores RAPD é o fato 
deles se comportarem como marcadores dominantes. Dominância neste 
caso não se refere ao conceito clássico de interação gênica entre alelos, 
e sim do ponto de vista da interpretação relativa entre genótipo e 
fenótipo de um indivíduo. Ao se observar uma banda RAPD no gel, não 
é possível distinguir se aquele segmento se originou a partir de uma ou 
duas cópias da sequência amplificada. A técnica RAPD detecta apenas 
um alelo em cada loco. A ausência de banda representa o conjunto de 
todos os outros alelos daquele loco que não podem ser amplificados. 
Embora as grandes maiorias dos marcadores RAPD possuam um 
comportamento “dominante”, existe a possibilidade de se amplificar 
marcadores co-dominantes, ou seja, amplificar ambos os alelos de um 
loco. 
 Vantagens e limitações dos marcadores RAPD: Além das vantagens 
já mencionadas, a técnica de RAPD se baseia na amplificação do DNA, 
o que resulta em várias vantagens práticas, que podem ser resumidas 
em simplicidade e rapidez. A obtenção de dados é pelo menos duas 
ordens de magnitude mais rápida que a técnica de RFLP, que é 
baseada na hibridização do DNA. Por não utilizar sondas, é eliminada a 
necessidade de isótopos radioativos ou marcação não radioativa. Outra 
grande vantagem é a quantidade mínima de DNA necessária para a 
análise genotípica de um indivíduo (da ordem de dezenas de 
nanogramas). Permite ainda, gerar uma grande quantidade de 
polimorfismo de segmentos de DNA, distribuídos por todo o genoma do 
organismo, oferecendo a possibilidade de amostrar regiões de DNA 
repetitivo, uma vez que os primers utilizados pata a detecção de 
variação ao nível de DNA são arbitrários, ao contrário das sondas RFLP 
que são pré-selecionadas para regiões de cópia única. Esta tecnologia 
também é adequada para a construção de mapas genéticos ao nível 
intra-específico. RAPD reúne, portanto, a simplicidade da visualização 
direta dos marcadores de DNA. O uso desta, não requer experiência 
aprofundada em biologia molecular e nem tampouco instalações 
sofisticadas de laboratório. É uma tecnologia bastante acessível. 
 No entanto, a principal limitação dos marcadores RAPD é o baixo 
conteúdo de informação genética por loco. Apenas um alelo é 
detectado, o segmento que é amplificado, enquanto que as demais 
variações alélicas são classificadas conjuntamente como um alelo nulo. 
Genótipos heterozigotos não podem ser diretamente discriminados dos 
homozigotos por RAPD, esta limitação é comumente descrita como 
“dominância” dos marcadores. Outra limitação é o desconhecimento 
prévio da base genética das bandas RAPD. Uma banda RAPD 
observada no gel só pode ser considerada um marcador de 
comportamento Mendeliano depois de verificada sua segregação de 
parentais para descendentes. 
 
 
Figura 7. Base genética de marcadores moleculares RAPD. 
 
 
Marcadores Baseados na Amplificação de Microssatélites - AFLP 
 
 Diferentes experimentos no início dos anos 80 demonstraram que os 
genomas eucariotos são densamente povoados por diferentes classes 
de sequências repetidas, umas mais complexas e outras mais simples. 
Sequências simples repetidas (“SSR – Simple Sequence Repeats”, mais 
tarde denominadas também de “microssatélites’ (Litt & Luty, 1989) 
consistem de pequenas sequências com 1 a 4 nucleotídeos de 
comprimento, repetidas em tandem. 
 Microssatélites têm sido observados em diversos organismos como 
em seres humanos, baleias, Drosophila, camundongos, bovinos e 
caprinos, entre outros. Em plantas, uma busca em bancos de dados de 
sequência de DNA publicadas revelou que os sítios de microssatélites 
são largamente distribuídos com uma frequência de uma a cada 50 mil 
pares de bases. Sua presença foi constatada em 34 espécies vegetais, 
sendo que o elemento repetido mais comum foi o di-nucleotídeo AT. 
Marcadores baseados em microssatélites estão sendo desenvolvidos 
para aplicações de mapeamento genético para algumas culturas de 
maio expressão, tais como soja, arroz e trigo. 
 Base genética e detecção de marcadores microssatélites: Cada “ilha” 
microssatélite, independente do elemento repetido (CA, TG, ATG, etc.) 
constitui um loco genético altamente variável, multialélico, de grande 
conteúdo informativo. Cada segmento amplificado de tamanho diferente 
representa um alelo diferente do mesmo loco. 
 A detecção de sequências SSR via PCR é feita em gel de 
eletroforese utilizando-se poliacrilamida ou agarose especial de alta 
resolução, uma vez que é necessário um gel adequado para a 
separação de segmentos que diferem por poucos pares de bases, 
dependendo do número de nucleotídeos do elemento repetido no 
microssatélite. A visualização das bandas no gel pode ser feita 
diretamente por coloração com brometo de etídio, nitrato de prata ou 
através de autoradiografia ao se utilizar primers marcados com 
radioisótopos na reação de PCR. Cada loco de microssatélite é 
analisado ao se utilizar o para de primers construído especificamente 
para sua amplificação.Mais do que um loco pode ser analisado de cada 
vez quando os alelos de cada loco têm tamanhos suficientemente 
diferentes e migram para zonas separadas no gel. Nestes métodos de 
genotipagem denominados “multiplex”, mais do que um par de primers 
específicos é utilizado simultaneamente na mesma reação de PCR. 
Locos SSR parecem ser estáveis, possuem expressão co-dominante, ou 
seja, ambos os alelos de um indivíduo heterozigoto são visualizados e 
são altamente multialélicos, numa população onde potencialmente todos 
os alelos daquele loco podem ser detectados e discriminados. 
 Vantagens e limitações dos marcadores microssatélites: Tendo em 
vista a expressão co-dominante e o multialelismo, os marcadores SSR 
são os que possuem o mais elevado conteúdo de informação de 
polimorfismo na terminologia de marcadores moleculares. Por causa 
disso, toda e qualquer população segregante pode ser utilizada como 
população referência para estudos de ligação e mapeamento genético. 
Assim, a escolha da população para mapeamento não mais precisa ser 
feita com base na maximização da distância genética e sim visando à 
população mais informativa do ponto de vista das características 
biológicas ou econômicas de interesse. Os SSR são muito mais 
frequentes e distribuídos ao acaso, permitindo a mais completa 
cobertura de qualquer genoma eucarioto. A relevância, o nível de 
recursos e o número de laboratórios envolvidos fizeram com que 
milhares de marcadores SSR fossem desenvolvidos como parte do 
projeto de mapeamento do genoma humano. 
 Estas e outras características fazem com que marcadores baseados 
em SSR sejam marcadores ideais para mapeamento genético e físico 
de genomas, para a identificação discriminação de genótipos e estudos 
de genética de populações. 
 Porém, a maior limitação da tecnologia microssatélites é a grande 
quantidade de trabalho necessário para o desenvolvimento prévio dos 
marcadores. O protocolo de obtenção de marcadores SSR envolve 
resumidamente 5 passos, de acordo com a figura a seguir. 
 A limitação básica que existe hoje para a aplicação mais ampla desta 
tecnologia na análise genética e melhoramento de plantas refere-se à 
grande quantidade de trabalho envolvida, exigindo pessoal 
especializado e equipamento sofisticado para o sequenciamento 
automático aliado ao alto custo de um empreendimento desta natureza. 
Além disso, para várias espécies de plantas, principalmente de hábito 
alógamo, o elevado nível de diversidade genética no DNA, detectável 
com técnicas mais acessíveis, não justifica a magnitude do investimento 
necessário para o desenvolvimento de marcadores SSR. 
Tabela de Comparação entre os Marcadores Moleculares 
 
 As principais etapas requeridas para obtenção de resultados variam 
com o tipo de marcador molecular utilizado conforme tabela abaixo: 
Estágios dos 
Marcadores 
Moleculares 
Tipos de Marcadores 
 
RFL
P 
RAP
D 
AFL
P 
MICROSATÉLIT
ES 
Extração do 
DNA Sim Sim Sim Sim 
Corte do 
DNA com 
restrições de 
alguma 
enzima 
Sim Não Sim Não 
Separação 
dos 
fragmentos 
de DNA por 
eletroforese 
Sim Não Não Não 
Transferênci
a dos 
fragmentos 
do Gel para 
Membrana 
de Nitro 
Celulose 
Sim Não Não Não 
Obter e 
tratar as 
Sondas 
Moleculares 
Sim Não Não Não 
Hibridação 
da Sonda 
em 
membrana 
de nitro 
celulose 
Sim Não Não Não 
Exibição da 
membrana Sim Não Não Não 
em filme de 
Raios-X 
Conexão 
dos 
fragmentos 
de DNA 
cortados 
Não Não Sim Não 
Amplificação 
do 
fragmento 
de DNA em 
Termociclad
or com 
Primer 
Não Sim Sim Sim 
Separação 
por 
eletroforese 
dos 
fragmentos 
amplificados 
de DNA 
Não Sim Sim Sim 
Ver os 
fragmentos 
de DNA no 
gel contra 
luz 
ultravioleta 
em Gel de 
Agarose 
Não Sim Não Não 
Ver os 
fragmentos 
de DNA em 
nitrato de 
prata 
Não Não Sim Sim 
TEMPO 
NECESSÁRI
O PARA O 
RESULTAD
O (DIAS) 
7-21 1 - 2 2 - 3 2 - 3 
 
 
Reação em cadeia da polimerase (PCR) 
Uma técnica utilizada para amplificar, ou fazer muitas cópias de, uma região de 
interesse específica do DNA. 
Pontos Principais: 
• A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica para fazer muitas 
cópias de uma região específica do DNA, in vitro (em um tubo de ensaio, ao 
invés de um organismo). 
• A PCR depende de uma DNA polimerase termoestável, a Taq polimerase, e 
requer primers de DNA projetados especificamente para a região de interesse 
do DNA . 
• Na PCR, a reação é repetida ciclicamente através de uma série de alterações 
de temperatura, o que possibilita a produção de muitas cópias da região de 
interesse. 
• A PCR tem muitas aplicações práticas e em pesquisa. Ela é rotineiramente 
usada em clonagens de DNA, diagnósticos médicos e análises forenses de 
DNA. 
O que é PCR? 
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica rotineira de 
laboratório usada para fazer muitas cópias (milhões ou bilhões) de uma região 
específica do DNA. Essa região do DNA pode ser qualquer objeto de interesse 
do pesquisador. Por exemplo, pode haver um gene cuja função o pesquisador 
queira compreender ou um marcador genético usado pelos cientistas forenses 
para correlacionar o DNA da cena do crime com os suspeitos. 
Tipicamente, o objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente da região de 
interesse do DNA, de modo que essa possa ser analisada e utilizada de 
alguma outra maneira. Por exemplo, DNA amplificado por PCR pode ser 
enviado para sequenciamento, visualizado por eletroforese em gel, 
ou clonado em plasmídeo para futuros experimentos. 
A PCR é usada em muitas áreas da biologia e medicina, incluindo pesquisa em 
biologia molecular, diagnósticos médicos e mesmo alguns ramos da ecologia. 
Taq polimerase 
Assim como a replicação de DNA em um organismo, a PCR requer uma 
enzima DNA polimerase que faça novas fitas de DNA usando as existentes 
como moldes. A DNA polimerase tipicamente usada na PCR é chamada 
de Taq polimerase, em homenagem à bactéria resistente ao calor da qual ela 
foi isolada (Thermus aquaticus). 
T. aquaticus vive em fontes termais e de água quente. Sua DNA polimerase é 
bastante estável ao calor e é mais ativa à 70°C (temperatura em que as DNA 
polimerases humanas ou de E. coli seriam disfuncionais). Essa estabilidade ao 
calor torna a Taq polimerase ideal para PCRs. Como veremos, a alta 
temperatura é usada repetidamente na PCR para desnaturar o DNA molde, 
isto é, separar suas fitas. 
Primers de PCR 
Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase consegue fabricar DNA 
somente quando lhe é dado um primer, uma sequência curta de nucleotídeos 
que fornece um ponto de partida para a síntese de DNA. Em uma reação de 
PCR, o pesquisador determina a região do DNA que será copiada, ou 
amplificada, pelos primers que ela ou ele escolher.
Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA de fita simples, geralmente por 
volta de 202020 aminoácidos de comprimento. Dois primers
cada reação de PCR, e eles são projetados de modo que englobem a região de 
interesse (região que deve ser copiada). Isto é, são dadas sequências que os 
farão se ligar a fitas opostas do DNA molde, bem nas extremidades da região a 
ser copiada. Os primers se ligam ao molde por pareamento de bases 
complementares. 
5' TATCAGATCCATGGAGT...GAGTACTAGTCCTATGAGT
ATAGTCTAGGTACCTCA...CTCATGATCAGGATACTCA
PCR, o pesquisador determina a região do DNA que será copiada, ou 
ada, pelos primers que ela ou ele escolher. 
Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA de fita simples, geralmente por 
aminoácidos de comprimento. Dois primers são usados para 
cada reação de PCR, e eles são projetados de modo que englobem a região de 
interesse (região que deve ser copiada). Isto é, são dadas sequênciasque os 
farão se ligar a fitas opostas do DNA molde, bem nas extremidades da região a 
da. Os primers se ligam ao molde por pareamento de bases 
DNA molde: 
TATCAGATCCATGGAGT...GAGTACTAGTCCTATGAGT
ATAGTCTAGGTACCTCA...CTCATGATCAGGATACTCA
PCR, o pesquisador determina a região do DNA que será copiada, ou 
Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA de fita simples, geralmente por 
são usados para 
cada reação de PCR, e eles são projetados de modo que englobem a região de 
interesse (região que deve ser copiada). Isto é, são dadas sequências que os 
farão se ligar a fitas opostas do DNA molde, bem nas extremidades da região a 
da. Os primers se ligam ao molde por pareamento de bases 
 
TATCAGATCCATGGAGT...GAGTACTAGTCCTATGAGT 3' 3' 
ATAGTCTAGGTACCTCA...CTCATGATCAGGATACTCA 5' 
Primer
Quando os primers são ligados ao molde, eles podem ser estendidos pela 
polimerase, e a região que está entre eles será copiada.
[Diagrama mais detalhado
Primer 1: 5' CAGATCCATGG 3' Primer 2: 
são ligados ao molde, eles podem ser estendidos pela 
polimerase, e a região que está entre eles será copiada. 
detalhado mostrando a direcionalidade do DNA e
são ligados ao molde, eles podem ser estendidos pela 
 
e do primer] 
As etapas da PCR 
Os principais ingredientes de uma reação PCR são a
DNA molde e nucleotídeos (blocos que compõem o DNA). Os ingredientes são 
reunidos em um tubo, juntamente com cofatores de que a enzima precisa, e 
passam por repetidos ciclos de aquecimento e res
o DNA seja sintetizado. 
As etapas básicas são: 
ingredientes de uma reação PCR são a Taq polimerase, primers, 
DNA molde e nucleotídeos (blocos que compõem o DNA). Os ingredientes são 
reunidos em um tubo, juntamente com cofatores de que a enzima precisa, e 
passam por repetidos ciclos de aquecimento e resfriamento que permitem que 
 
 
polimerase, primers, 
DNA molde e nucleotídeos (blocos que compõem o DNA). Os ingredientes são 
reunidos em um tubo, juntamente com cofatores de que a enzima precisa, e 
friamento que permitem que 
1. Desnaturação (96°C): Aquece fortemente a reação para separar, ou 
desnaturar, as fitas de DNA. Isso proporciona um molde de fita simples para a 
próxima etapa. 
2. Anelamento (555555 - 656565°C): Resfria a reação para que os primers 
possam se ligar às suas sequências complementares no DNA molde de fita 
simples. 
3. Extensão (72°C): Eleva a temperatura da reação para que a Taqpolimerase 
estenda os primers, sintetizando novas fitas de DNA. 
Este ciclo se repete 2525
geralmente ocorre em 22
de DNA a ser copiada. Se a reação for eficiente (funcionar bem), a região de 
interesse pode gerar de uma 
Isso porque não é apenas o DNA original que é utilizado como molde a cada 
vez. Ao invés, o novo DNA feito em uma rodada pode servir de molde na 
2525 - 353535 vezes em uma reação típica de PCR, que 
22 - 444 horas, dependendo do comprimento da região 
de DNA a ser copiada. Se a reação for eficiente (funcionar bem), a região de 
interesse pode gerar de uma ou poucas cópias até bilhões. 
Isso porque não é apenas o DNA original que é utilizado como molde a cada 
vez. Ao invés, o novo DNA feito em uma rodada pode servir de molde na 
 
vezes em uma reação típica de PCR, que 
horas, dependendo do comprimento da região 
de DNA a ser copiada. Se a reação for eficiente (funcionar bem), a região de 
Isso porque não é apenas o DNA original que é utilizado como molde a cada 
vez. Ao invés, o novo DNA feito em uma rodada pode servir de molde na 
próxima rodada de síntese de DNA. Há muitas cópias dos primers e muitas 
moléculas de Taq polimerase flutuando pela reação, então o número de 
moléculas de DNA pode aproximadamente dobrar a cada rodada do ciclo. Esse 
padrão de crescimento exponencial é mostrado na imagem abaixo.
próxima rodada de síntese de DNA. Há muitas cópias dos primers e muitas 
polimerase flutuando pela reação, então o número de 
moléculas de DNA pode aproximadamente dobrar a cada rodada do ciclo. Esse 
padrão de crescimento exponencial é mostrado na imagem abaixo.
próxima rodada de síntese de DNA. Há muitas cópias dos primers e muitas 
polimerase flutuando pela reação, então o número de 
moléculas de DNA pode aproximadamente dobrar a cada rodada do ciclo. Esse 
padrão de crescimento exponencial é mostrado na imagem abaixo. 
 
Uso da eletroforese em gel para visualizar os resultados d
Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados (tornam
visíveis) através do uso da
técnica na qual fragmentos de DNA são puxados por uma corrente elétrica 
através de uma matriz de gel, e que separa os fragmentos de DNA de acordo 
com o tamanho. Um padrão, ou escada de DNA, é tipicamente incluído para 
que o tamanho dos fragmentos nas amostras da PCR possa ser determinado.
Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma "banda" no gel, que 
pode ser vista a olho nu se o gel for pigmentado com um corante que se liga ao 
DNA. Por exemplo, uma reação de PCR pro
de 400400400 pares de bases (pb) apareceria desta maneira no gel:
Coluna esquerda: Escada
Coluna direita: resultado
Uso da eletroforese em gel para visualizar os resultados da PCR
Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados (tornam
visíveis) através do uso da eletroforese em gel. Eletroforese em
técnica na qual fragmentos de DNA são puxados por uma corrente elétrica 
através de uma matriz de gel, e que separa os fragmentos de DNA de acordo 
com o tamanho. Um padrão, ou escada de DNA, é tipicamente incluído para 
o tamanho dos fragmentos nas amostras da PCR possa ser determinado.
Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma "banda" no gel, que 
pode ser vista a olho nu se o gel for pigmentado com um corante que se liga ao 
DNA. Por exemplo, uma reação de PCR produzindo um fragmento 
pares de bases (pb) apareceria desta maneira no gel:
Escada de DNA com bandas de 100, 200, 300,
resultado da reação PCR, uma banda em 
a PCR 
Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados (tornam-se 
em gel é uma 
técnica na qual fragmentos de DNA são puxados por uma corrente elétrica 
através de uma matriz de gel, e que separa os fragmentos de DNA de acordo 
com o tamanho. Um padrão, ou escada de DNA, é tipicamente incluído para 
o tamanho dos fragmentos nas amostras da PCR possa ser determinado. 
Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma "banda" no gel, que 
pode ser vista a olho nu se o gel for pigmentado com um corante que se liga ao 
duzindo um fragmento 
pares de bases (pb) apareceria desta maneira no gel: 
 
300, 400, 500 pb. 
 400pb. 
Uma banda de DNA contém muitas e muitas cópias da região de interesse do 
DNA, não apenas uma ou algumas cópias. Como o DNA é microscópico, 
muitas cópias têm de estar presentes antes que possamos vê-las a olho nu. 
Isso é uma grande parte do porquê de a PCR ser uma ferramenta importante: 
ela produz cópias suficientes de uma sequência de DNA de modo que 
possamos ver ou manipular aquela região de DNA. 
Aplicações da PCR 
Através da PCR, uma sequência de DNA pode ser amplificada milhões ou 
bilhões de vezes, produzindo cópias suficientes de DNA para serem analisadas 
por outras técnicas. Por exemplo, o DNA pode ser visualizado por eletroforese 
em gel, enviado para sequenciamento, ou digerido por enzimas de restrição 
e clonado em um plasmídeo. 
A PCR é usada em muitos laboratórios de pesquisa e também tem aplicações 
práticas em ciências forenses, testes genéticos e diagnósticos. Por exemplo, a 
PCR é utilizada para amplificar genes associados a desordens genéticas a 
partir do DNA de pacientes (ou do DNA fetal, nos casos de teste pré-natal). A 
PCR também pode ser utilizada para testar se há DNA bacteriano ou viralno 
corpo de um paciente: se o patógeno estiver presente, pode ser possível 
amplificar regiões de seu DNA a partir de uma amostra de sangue ou tecido. 
Amostra-problema: A PCR nas ciências forenses
Suponha que você esteja trabalhando em um laboratório de ciências forenses. 
Você acabou de receber uma amostra de DNA de um cabelo deixado em uma 
cena de crime, juntamente com amostras de DNA de três possíveis suspeitos
Seu trabalho é examinar um marcador genético em particular e verificar se 
algum dos três suspeitos coincide com o DNA do cabelo para esse marcador.
O marcador vem em dois alelos, ou versões. Um deles contém uma única 
repetição (região marrom abaixo), enq
repetição. Em uma reação PCR com primers que atuam na região de repetição, 
o primeiro alelo produz um fragmento de DNA de
enquanto o segundo produz um fragmento de DNA de
p: 
Marcador do alelo 1: primers
roblema: A PCR nas ciências forenses 
Suponha que você esteja trabalhando em um laboratório de ciências forenses. 
Você acabou de receber uma amostra de DNA de um cabelo deixado em uma 
cena de crime, juntamente com amostras de DNA de três possíveis suspeitos
Seu trabalho é examinar um marcador genético em particular e verificar se 
algum dos três suspeitos coincide com o DNA do cabelo para esse marcador.
O marcador vem em dois alelos, ou versões. Um deles contém uma única 
repetição (região marrom abaixo), enquanto o outro contém duas cópias da 
repetição. Em uma reação PCR com primers que atuam na região de repetição, 
o primeiro alelo produz um fragmento de DNA de 200200200 \text{bp}
enquanto o segundo produz um fragmento de DNA de 300300300
primers que atuam na região de repetição amplificam
fragmento de DNA de 200 pb 
Suponha que você esteja trabalhando em um laboratório de ciências forenses. 
Você acabou de receber uma amostra de DNA de um cabelo deixado em uma 
cena de crime, juntamente com amostras de DNA de três possíveis suspeitos. 
Seu trabalho é examinar um marcador genético em particular e verificar se 
algum dos três suspeitos coincide com o DNA do cabelo para esse marcador. 
O marcador vem em dois alelos, ou versões. Um deles contém uma única 
uanto o outro contém duas cópias da 
repetição. Em uma reação PCR com primers que atuam na região de repetição, 
text{bp}bpb, p, 
300 \text{bp}bpb, 
amplificam um 
Marcador do alelo 2: primers
Você faz uma PCR nas quatro amostras de DNA
eletroforese em gel, como representado abaixo:
Primeira faixa: Escada 
Segunda faixa:
Terceira faixa:
Quarta faixa: DNA
Quinta faixa:
primers que atuam na região de repetição amplificam
fragmento de DNA de 300 pb 
Você faz uma PCR nas quatro amostras de DNA e visualiza os resultados por 
eletroforese em gel, como representado abaixo: 
O gel tem cinco faixas: 
 de DNA com bandas de 100, 200, 300, 400,
faixa: DNA da cena do crime, banda de 200 
faixa: DNA do suspeito #1, banda de 300 pb.
DNA do suspeito #2, bandas de 200 e 300
faixa: DNA do suspeito #3, banda de 200 pb.
amplificam um 
e visualiza os resultados por 
 
400, e 500 pb. 
 pb. 
pb. 
300 pb. 
pb. 
Mais sobre PCR e ciências forenses 
Em testes forenses reais com o DNA da cena do crime, os técnicos fariam uma 
análise conceitual similar à representada no exemplo acima. Contudo, uma 
série de marcadores diferentes (não apenas o único marcador do exemplo) 
seria comparada entre o DNA da cena do crime e o DNA do suspeito. 
Ademais, os marcadores usados em análises forenses típicas não vêm apenas 
em duas formas diferentes. Em vez disso, eles são 
altamente polimórficos (poli = muitas, morfo = formas). Isto é, eles vêm em 
muitos alelos que variam minimamente em comprimento. 
O tipo mais comum de marcadores usado nas ciências forenses, 
chamado microssatélites (STRs na sigla em inglês), consiste em várias 
cópias da mesma sequência curta de nucleotídeos que se repetem 
(tipicamente, 222 a 555nucleotídeos de comprimento). Um alelo de um STR 
pode ter 202020 repetições, enquanto outro pode ter 181818 e um outro 
apenas 101010^11start superscript, 1, end superscript. 
Por meio do exame de múltiplos marcadores, cada um dos quais vem em 
muitas formas de alelos, os cientistas forenses podem montar uma "impressão 
digital" singular a partir de uma amostra de DNA. Em uma análise típica de 
STR usando 131313 marcadores, as chances de um falso positivo (duas 
pessoas tendo a mesma "impressão digital" de DNA) são menores 
que 111 em 101010 \text{bilhões}bilhões^11start superscript, 1, end 
superscript! 
Embora possamos pensar na evidência de DNA sendo usada para condenar 
criminosos, ela tem tido um papel crucial na exoneração de pessoas 
falsamente acusadas (incluindo algumas que estavam presas há muitos anos). 
A análise forense também é usada para estabelecer paternidade e identificar 
restos mortais de cenas de desastres. 
Eletroforese em gel 
Uma técnica utilizada para separar fragmentos de DNA e outras 
macromoléculas por tamanho e carga. 
Pontos Principais: 
• A eletroforese em gel é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA 
de acordo com seu tamanho. 
• As amostras de DNA são carregadas nos poços (cavidades) localizados numa 
das extremidades de um gel, e uma corrente elétrica é aplicada para fazê-las 
avançar pelo gel. 
• Os fragmentos DNA estão carregados negativamente, então movem-se na 
direção do eletrodo positivo. Já que todos os fragmentos de DNA têm a mesma 
quantidade de carga por massa, os fragmentos menores atravessam o gel mais 
rapidamente do que os maiores. 
• Quando um gel é pigmentado com um corante que se liga ao DNA, os 
fragmentos de DNA podem ser vistos como bandas, cada uma representando 
um grupo de fragmentos de DNA de mesmo tamanho. 
Introdução 
Suponha que você tenha acabado de fazer uma reação de PCR, criando várias 
cópias de uma região de interesse do DNA. Ou talvez você tenha feito 
uma clonagem de DNA, tentando "colar" um gene em um plasmídeo de DNA 
circular. 
Agora, você quer verificar se seu PCR funcionou, ou se seu plasmídeo contém 
o gene certo. Que técnica você pode usar para visualizar (observar 
diretamente) os fragmentos de DNA? 
Eletroforese em gel 
A Eletroforese em gel é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA 
(ou outras macromoléculas, como o RNA e proteínas) com base no tamanho e 
carga. A eletroforese envolve a passagem de uma corrente através de um gel 
contendo as moléculas de interesse. Em função de seu tamanho e carga, as 
moléculas vão se mover através do gel em diferentes direções ou em 
diferentes velocidades, o que permite que sejam separadas umas das outras. 
Todas as moléculas de DNA têm a mesma quantidade de carga por massa. 
Por essa razão, a eletroforese em gel de fragmentos de DNA faz a separação 
baseada apenas no tamanho. Através do uso da eletroforese, podemos ver 
quantos diferentes fragmentos de DNA estão presentes em uma amostra, e o 
quão grandes eles são em relação aos outros. Podemos também determinar o 
tamanho absoluto de um pedaço de DNA examinando-o ao lado de um DNA 
"padrão", composto de fragmentos de DNA de tamanhos conhecidos. 
O que é um gel? 
Como o nome sugere, a gel electroforese envolve um gel: uma placa de 
material gelatinoso. Géis para separação de DNA são muitas vezes feitos de 
um polissacarídeo chamado
pó. Quando a agarose é aquecida em um tampão (água com alguns sais) e 
deixada para esfriar, forma um gel sólido ligeiramente mole. No nível molecular, 
o gel é uma matriz de moléculas de agarose que são mantidas unidas por 
ligações de hidrogênio e formam micro poros.
Em uma extremidade, o gel tem cavidades semelhantes a bolsos 
chamadas poços, onde as amostras de DNA serão colocadas:
Como o nomesugere, a gel electroforese envolve um gel: uma placa de 
material gelatinoso. Géis para separação de DNA são muitas vezes feitos de 
um polissacarídeo chamado agarose, que vem na forma de flocos secos em 
a agarose é aquecida em um tampão (água com alguns sais) e 
deixada para esfriar, forma um gel sólido ligeiramente mole. No nível molecular, 
o gel é uma matriz de moléculas de agarose que são mantidas unidas por 
ligações de hidrogênio e formam micro poros. 
Em uma extremidade, o gel tem cavidades semelhantes a bolsos 
, onde as amostras de DNA serão colocadas: 
Como o nome sugere, a gel electroforese envolve um gel: uma placa de 
material gelatinoso. Géis para separação de DNA são muitas vezes feitos de 
, que vem na forma de flocos secos em 
a agarose é aquecida em um tampão (água com alguns sais) e 
deixada para esfriar, forma um gel sólido ligeiramente mole. No nível molecular, 
o gel é uma matriz de moléculas de agarose que são mantidas unidas por 
Em uma extremidade, o gel tem cavidades semelhantes a bolsos 
Antes das amostras de DNA serem adicionadas, o gel deve ser colocado em 
uma caixa de gel. Uma extremidade da caixa é ligada a um eletrodo positivo, 
enquanto a outra extremidade é ligada a um eletrodo negativo. O corpo 
principal da caixa, onde o gel é colocado, é preenchido com uma solução 
tampão contendo sal que pode conduzir corrente. Embora você não seja capaz 
de ver na imagem acima (graças a minhas incríveis habilidades artísticas), o 
tampão preenche a caixa de gel até o nível em que ele mal chega a cobrir o 
gel. 
A extremidade do gel com os poços está voltada para o eletrodo negativo. A 
extremidade sem poços (para a qual os fragmentos de DNA vão migrar) está 
voltada para o eletrodo positivo. 
Como os fragmentos de DNA movem-se através do gel? 
Uma vez que o gel esteja na caixa, cada uma das amostras de DNA que 
queremos examinar (por exemplo, cada reação de PCR ou cada plasmídeo 
digerido por restrição) é cuidadosamente transferida para um dos poços. Um 
poço é reservado para uma escada de DNA, um padrão de referência que 
contém fragmentos de DNA de comprimentos conhecidos. As escadas de DNA 
comerciais vêm em diferentes intervalos de tamanho, então podemos escolher 
uma que tenha boa "cobertura" para a faixa de tamanho esperada de nossos 
fragmentos. 
A seguir, a caixa é ligada e a corrente começa a fluir através do gel. As 
moléculas de DNA têm carga negativa devido aos grupos fosfato em seus 
esqueletos de açúcar-fosfato, assim elas começam a se mover através da 
matriz de gel, para o polo positivo. Quando a energia é ligada e a corrente 
passa através do gel, diz
[Qual voltagem é usada 
matriz de gel, para o polo positivo. Quando a energia é ligada e a corrente 
passa através do gel, diz-se que o gel está correndo. 
 para correr o gel?] 
matriz de gel, para o polo positivo. Quando a energia é ligada e a corrente 
 
As amostras de DNA são carregadas nos poços na extremidade do eletrodo 
negativo do gel. 
A energia é ligada e os fragmentos de DNA migram através do gel (para o 
eletrodo positivo). 
Após a corrida do gel, os fragmentos são separados por tamanho. Os 
fragmentos maiores estão perto da extremidade superior do gel (eletrodo 
negativo, onde eles começaram), e os fragmentos menores estão próximos da 
extremidade inferior (eletrodo positivo). 
Adaptado do diagrama de Reece et al.^55start superscript, 5, end superscript 
Qual fragmento de DNA vai ganhar a "corrida" para o polo positivo? Pedaços 
curtos de DNA vão viajar através dos poros da matriz de gel mais rapidamente 
que os mais longos. Após o gel ter corrido por algum tempo, os pedaços mais 
curtos de DNA vão estar mais próximos do polo positivo do gel, enquanto os 
mais longos vão permanecer próximos aos poços. Pedaços muitos curtos de 
DNA podem correr diretamente para a extremidade do gel se forem deixados 
por períodos suficientemente longos (algo de que me senti definitivamente 
culpado!). 
Visualização dos fragmentos de DNA 
Uma vez que os fragmentos tenham sido separados, podemos examinar o gel 
e ver quais tamanhos de faixas são encontrados. Quando um gel é pigmentado 
com um corante que se liga ao DNA e depois colocado sob luz UV, os 
fragmentos de DNA brilham, o que nos permite visualizar o DNA presente em 
diferentes locais ao longo da extensão do gel.
O bp ao lado de cada número na escada indica quantos
comprimento do fragmento de DNA.
Uma "linha" bem definida de DNA em um gel é chamada de
banda contém um grande número de fragmentos de DNA do mesmo tamanho 
e todos os que viajaram, como um grupo, para a mesma posição. Um 
fragmento único de DNA (ou até mesmo um pequeno grupo de fragmentos de 
DNA) não seria visível por si só em um gel.
Ao comparar as bandas em uma amostra à escada de DNA, podemos 
determinar os tamanhos aproximados. Por exemplo, a banda brilhante no gel 
acima tem, aproximadamen
Sequenciamento de DNA
Como a sequência de bases
pedaço de DNA é determinada.
Pontos Principais: 
• Sequenciamento de DNA
nucleotídeos (As, Ts, Cs, e Gs) em um pedaço de DNA.
fragmentos de DNA brilham, o que nos permite visualizar o DNA presente em 
diferentes locais ao longo da extensão do gel. 
ao lado de cada número na escada indica quantos pares de
comprimento do fragmento de DNA. 
Uma "linha" bem definida de DNA em um gel é chamada de banda
banda contém um grande número de fragmentos de DNA do mesmo tamanho 
e todos os que viajaram, como um grupo, para a mesma posição. Um 
DNA (ou até mesmo um pequeno grupo de fragmentos de 
DNA) não seria visível por si só em um gel. 
Ao comparar as bandas em uma amostra à escada de DNA, podemos 
determinar os tamanhos aproximados. Por exemplo, a banda brilhante no gel 
acima tem, aproximadamente, o tamanho de 700700700 pares de bases (bp).
DNA 
bases de nucleotídeos (As, Ts, Cs, and Gs)
determinada. 
DNA é o processo de determinação da sequência
nucleotídeos (As, Ts, Cs, e Gs) em um pedaço de DNA. 
fragmentos de DNA brilham, o que nos permite visualizar o DNA presente em 
 
de basetem no 
banda. Cada 
banda contém um grande número de fragmentos de DNA do mesmo tamanho 
e todos os que viajaram, como um grupo, para a mesma posição. Um 
DNA (ou até mesmo um pequeno grupo de fragmentos de 
Ao comparar as bandas em uma amostra à escada de DNA, podemos 
determinar os tamanhos aproximados. Por exemplo, a banda brilhante no gel 
pares de bases (bp). 
Gs) de um 
é o processo de determinação da sequência de 
• No método Sanger de sequenciamento, o DNA alvo é copiado muitas vezes, 
produzindo fragmentos de comprimentos diferentes. Nucleotídeos 
“terminadores de cadeia” fluorescentes marcam os finais dos fragmentos e 
permitem que a sequência seja determinada. 
• As técnicas de Sequenciamento de Última Geração são novas abordagens 
feitas em grande escala que aumentam a velocidade e diminuem os custos do 
sequenciamento. 
O que é sequenciamento? 
Você deve ter ouvido falar que genomas estão sendo sequenciados. Por 
exemplo, o genoma humano foi concluído em 2003, depois de vários anos de 
esforços internacionais. Mas o que significa sequenciar um genoma ou mesmo 
pequenos fragmentos de DNA? 
Sequenciamento de DNA é o processo de determinação da sequência de 
bases nucleotídicas (As, Ts, Cs, e Gs) em um pedaço de DNA. Hoje em dia, 
com os materiais e equipamentos corretos, sequenciar um pequeno fragmento 
de DNA é relativamente simples. 
Sequenciar um genoma inteiro (todo o DNA de um organismo) permanece uma 
tarefa complexa. Isso requer quebrar o DNA do genoma em pequenos 
fragmentos, sequenciar esses pedaços e montar as sequências em uma única 
e longa sequência "consenso". Entretanto, graças a novos métodosque tem 
sido desenvolvidos nas duas últimas décadas, o sequenciamento genômico é 
agora muito mais rápido e mais barato do que era durante o Projeto Genoma 
Humano^11start superscript, 1, end superscript. 
Neste artigo, nós veremos os métodos usados para sequenciamento de DNA. 
Focaremos no método já bem estabelecido, método Sanger de 
sequenciamento, mas também discutiremos os novos métodos ("nova 
geração") que tem reduzido custos e acelerado a velocidade de 
sequenciamentos em larga escala. 
Sequenciamento de Sanger: o método de terminação da cadeia 
Regiões de DNA com até 900900900 pares de base de comprimento são 
rotineiramente sequenciados pelo chamado método Sanger de 
sequenciamento ou método de terminação da cadeia. O método Sanger foi 
desenvolvido pelo bioquímico britânico Fred Sanger e seus colaboradores, em 
1977. 
No Projeto Genoma Humano, o método Sanger foi usado para determinar as 
sequencias de muitos fragmentos relativamente pequenos de DNA humano. 
(Esses fragmentos não tinham necessariamente 900900900 pb ou menos, mas 
os pesquisadores conseguiam "caminhar" ao longo de cada fragmento usando 
diversas rodadas de sequenciamento por Sanger.) Os fragmentos foram 
alinhados com base nas porções de sobreposição compondo sequencias de 
regiões mais longas de DNA e, eventualmente, os cromossomos inteiros. 
Embora os genomas sejam agora tipicamente sequenciados usando outros 
métodos mais rápidos e baratos, o método Sanger ainda é amplamente usado 
para o sequenciamento de fragmentos individuais de DNA, como fragmentos 
usados na Clonagem de DNA ou gerados pela Reação em Cadeia da 
Polimerase (PCR). 
Ingredientes para o sequenciamento de Sanger 
O método Sanger envolve a produção de muitas cópias de uma região alvo de 
DNA. Os ingredientes são similares àqueles usados para replicação de 
DNA em um organismo, ou para a reação em cadeia da polimerase (PCR), os 
quais fazem cópias de DNA in vitro. Eles incluem: 
• Uma enzima DNA polimerase 
• Um primer, que é um pequeno fragmento de DNA de fita simples que se liga 
ao DNA molde e atua como um "iniciador" para a polimerase 
• Os quatro nucleotídeos do DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 
• O DNA molde a ser sequenciado 
Entretanto, uma reação de sequenciamento de Sanger contém um ingrediente 
único: 
• Versões Dideoxi, ou terminadores de cadeia, para os quatro nucleotídeos 
(ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), cada uma marcada com um corante de uma 
cor diferente 
Créditos da Imagem: "Sequenciamento
College, Biology (CC BY
Dideoxinucleotídeos são similares aos nucleotídeos comuns, ou 
deoxinucleotídeos, mas com uma diferença chave: falta um grupo hidroxila na 
posição 3' do carbono do anel de saca
grupo 3' hidroxila atua como um "gancho", permitindo que um novo nucleotídeo 
seja adicionado à cadeia existente.
Uma vez que um dideoxinucleotídeo é adicionado à cadeia, não há hidroxila 
disponível e nenhum outro nucleotíde
com o dideoxinucleotídeo, o qual é marcado com um cor particular de corante 
dependendo da base (A, T, C or G) que carrega.
[Onde o corante está ligado?
Sequenciamento de genoma: Figura 1," by
BY 4.0). 
Dideoxinucleotídeos são similares aos nucleotídeos comuns, ou 
deoxinucleotídeos, mas com uma diferença chave: falta um grupo hidroxila na 
posição 3' do carbono do anel de sacarose. Em um nucleotídeo comum, o 
grupo 3' hidroxila atua como um "gancho", permitindo que um novo nucleotídeo 
seja adicionado à cadeia existente. 
Uma vez que um dideoxinucleotídeo é adicionado à cadeia, não há hidroxila 
disponível e nenhum outro nucleotídeo pode ser adicionado. A cadeia termina 
com o dideoxinucleotídeo, o qual é marcado com um cor particular de corante 
dependendo da base (A, T, C or G) que carrega. 
ligado? ] 
 
by OpenStax 
deoxinucleotídeos, mas com uma diferença chave: falta um grupo hidroxila na 
rose. Em um nucleotídeo comum, o 
grupo 3' hidroxila atua como um "gancho", permitindo que um novo nucleotídeo 
Uma vez que um dideoxinucleotídeo é adicionado à cadeia, não há hidroxila 
o pode ser adicionado. A cadeia termina 
com o dideoxinucleotídeo, o qual é marcado com um cor particular de corante 
Método Sanger de sequenciamento 
A amostra de DNA a ser sequenciada é combinada em um tubo com primer, 
DNA polimerase e nucleotídeos de DNA (dATP, dTTP, dGTP, and dCTP). Os 
quatro nucleotídeos terminadores de cadeia marcados com corantes são 
adicionados também, mas em concentração muito menor que a dos 
nucleotídeos comuns. 
A mistura é primeiro aquecida para a denaturação do DNA molde (separar as 
fitas), então resfriadas para que os primers possam se ligar ao molde de fita 
simples. Uma vez que o primer se ligou, a temperatura é aumentada 
novamente, permitindo que a DNA polimerase sintetize um novo DNA a partir 
do primer. A DNA polimerase continuará a adicionar nucleotídeos à cadeia até 
que aconteça a adição de um dideoxinucleotídeo ao invés de um normal. 
Nesse ponto, os nucleotídeos não podem mais ser adicionados, e portanto a 
fita terminará em um dideoxinucleotídeo. 
Este processo é repetido em um número de ciclos. Quando o ciclo se completa, 
é praticamente garantido que um dideóxinucleotídeo terá se incorporado em 
todas as posições do DNA alvo em pelo menos uma reação. Ou seja, o tubo irá 
conter fragmentos de diferentes comprimentos, terminando em cada uma das 
posições de nucleotídeos no DNA original. (veja a figura abaixo). As 
extremidades dos fragmentos serão rotuladas com corantes que indicam o 
nucleotídeo final. 
[Todos os fragmentos serão rotulados?] 
Imagem modificada de "Sanger
modified image is licensed
Depois que a reação é executada, os fragme
longo e fino tubo contanto uma matriz de gel em um processo chamado 
de electroforese capilar
rapidamente através dos poros do gel, enquanto longos fragmentos movem
mais devagar. Assim que cada fragmento cruza a "linha de chegada" no final 
do tubo, ele é iluminado por um laser, permitindo que o corante anexado seja 
detectado. 
Sanger sequencing," by Estevezj (CC BY
licensed under a (CC BY-SA 3.0) license. 
Depois que a reação é executada, os fragmentos são levados através de um 
longo e fino tubo contanto uma matriz de gel em um processo chamado 
capilar em gel. Pequenos fragmentos movem-
rapidamente através dos poros do gel, enquanto longos fragmentos movem
ue cada fragmento cruza a "linha de chegada" no final 
do tubo, ele é iluminado por um laser, permitindo que o corante anexado seja 
 
BY-SA 3.0). The 
ntos são levados através de um 
longo e fino tubo contanto uma matriz de gel em um processo chamado 
-se 
rapidamente através dos poros do gel, enquanto longos fragmentos movem-se 
ue cada fragmento cruza a "linha de chegada" no final 
do tubo, ele é iluminado por um laser, permitindo que o corante anexado seja 
O menor fragmento (que termina apenas um nucleotídeo após o primer) 
atravessa a linha de chegada primeiro, seguido do próximo menor fragmento 
(terminando dois nucleotídeos após o primer), e assim por diante. Portanto, a 
partir das cores dos corantes registradas uma após a outra no detector, a 
sequência do pedaço original de DNA pode ser construída com um nucleotídeo 
por vez. Os dados registrados pelo detector consistem em uma série de picos 
em intensidade de fluorescência, como mostrado no cromatograma acima. A 
sequência de DNA é lida a partir dos picos no cromatograma. 
Usos e limitações 
O método Sanger de sequenciamento promove sequências de alta qualidade 
para trechos relativamente longos (por volta de 900900900 pares de base). É 
tipicamente usado para sequenciar peças individuais de DNA, 
como plasmídeos bacterianos ou DNA copiado em PCR. 
Entretanto, o método Sanger de sequenciamentoé caro e ineficiente para 
projetos de larga escala, como o sequenciamento de um genoma inteiro ou 
metagenoma (o "genoma coletivo" de uma comunidade microbiana). Para 
tarefas como essa, novas técnicas de sequenciamento de larga escala são 
mais rápidas e menos caras. 
Sequenciamento da nova geração 
O nome pode soar Star Trek, mas é realmente como é chamado! O mais 
recente conjunto de tecnologias de sequenciamento de DNA é coletivamente 
chamado de sequenciamento da nova geração. 
Existe uma variedade de técnicas de sequenciamento de nova geração que 
usam diferentes tecnologias. No entanto, a maioria tem algumas características 
em comum que as distinguem do sequenciamento Sanger: 
• Alto paralelismo: muitas reações de sequenciamento ocorrem ao mesmo 
tempo 
• Microescala: reações são pequenas e muitas podem ser realizadas de uma 
vez em um chip 
• Rapidez: pelas reações serem feitas em paralelo, resultados são obtidos muito 
mais rápido 
• Baixo custo: sequenciar um genoma é mais barato do que com o 
sequenciamento Sanger 
• Menor comprimento: leituras tipicamente variam entre 505050 -
700700700nucleotídeos de comprimento 
Conceitualmente, o sequenciamento de nova geração é algo como conduzir um 
grande número de pequenas reações Sanger de sequenciamento em paralelo. 
Graças a essa paralelização e pequena escala, grandes quantidades de DNA 
podem ser sequenciadas de forma muito mais rápida e barata com métodos de 
próxima geração do que com sequenciamento Sanger. Por exemplo, em 2001, 
o custo de sequenciar o genoma humano era quase \$100$100dollar sign, 
100 \text{milhões}milhões de dólares. Em 2015, era apenas \$1245$1245dollar 
sign, 1245^22start superscript, 2, end superscript! 
Por que um sequenciamento rápido e barato importa? A habilidade de 
sequenciar genomas rotineiramente abre novas possibilidades para pesquisa 
em biologia e aplicações biomédicas. Por exemplo, sequenciamento de baixo 
custo é um passo em direção à medicina personalizada – isso é, tratamento 
médico adaptado às necessidades de um indivíduo, baseado nas variante 
gênicas no seu genoma