relatorio metodo de bradford

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CURSO TECNICO EM BIOTECNOLOGIA
DISCIPLINA DE PROCESSOS BIOQUÍMICOS
PROF.ª BIANCA PFAFFENSELLER
Prática V:
QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO 
MÉTODO DE BRADFORD
ALUNAS: JESSIKA LARA, PAULA SOARES E THAYANA DA SILVA
NOTA = 8,2 (o relatório está mais completo comparado ao anterior, com mais informações na introdução e discussão. Mas, falta vcs revisarem o texto, tem trechos confusos, repetidos, soltos. Sugiro tb rever a formatação do texto)
Porto Alegre, 22 de abril de 2014
Introdução�: O método de Bradford baseia-se na observação do “Coomassie brilliant blue” BG-250 que estabiliza a forma aniônica do corante, causando uma visível mudança de coloração, inicialmente castanho para tons de azul, de acordo com a concentração da proteína. O complexo é formado em cerca de 2 minutos e fica disperso na solução por uma mais, mais ou menos.�
Este método é baseado na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. Para isto ocorrer, a proteína deve ter estrutura macromolecular, ou seja, de 8-9 ligações peptídicas no mínimo. No pH de reação, a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm. �A comparação dos resultados com uma curva padrão �(de valores já conhecidos), permite a determinação da concentração da proteína em estudo. 
É mais indicado para a detecção e quantificação de proteínas (em meios sem detergentes) totais, tais como: plasma ou soro sanguíneo, liquor, saliva humana, produtos alimentícios, leite, leite humano, tecidos de plantas e urina. É simples, preciso e rápido. O método requer poucas etapas de misturas, não necessita de aquecimento e possui uma grande estabilidade colorimétrica, com pouca interferência de cátions como sódio ou potássio. 
Alguns interferentes: Lipídios, detergentes, melanina, açucares, RNA, bilirrubina e sulfato de amônio. 
Lei de Beer-Lambert �: “Quando uma faixa de luz monocromática atravessa uma solução colorida, a quantidade de luz absorvida é diretamente proporcional à concentração da solução colorida e à espessura da camada atravessada. A falta de linearidade também tem sido observada devido a uma variação do pH quando da adição da amostra ao reagente BG-250.�
Vantagens: sensibilidade; rapidez; menor número de interferentes.
Desvantagens: variação da absortividade específica; dependente da solubilidade e tamanho da proteína.
�
Objetivos: utilizar um método espectrofotômetro de quantificação de proteínas; determinar a concentração de proteína em uma amostra biológica através do método de Bradford.
Materiais: 
- 1 estante para tubos de ensaio
- 14 tubos de ensaio grandes 
- 350 µL de albumina 1 mg/mL (previamente preparada)
- 35 mL de Coomassie Blue
- Micropipeta de 10-200 µL
- Ponteiras pequenas para água, albumina e amostra
- 1 pipeta de vidro de 5 mL para o Comassie Blue
- Espectrofotômetro 
Métodos:
Diluição do leite em 50 x�
Pipetar a curva padrão e a amostra conforme tabelas abaixo:
	Curva Padrão - Bradford 1996
	[ ] de albumina (mg/mL)
	água (µL)
	Albumina 
	Coomassie
	
	
	1 mg/mL (µL)
	Blue (µL)
	branco
	50
	0
	2500
	0,2
	40
	10
	2500
	0,4
	30
	20
	2500
	0,6
	20
	30
	2500
	0,8
	10
	40
	2500
	1
	0
	50
	2500
	Amostra
	Tubos
	Água (µL)
	Amostra
	Coomassie 
	
	
	(µL)
	Blue (µL)
	1
	30
	20
	2500
	2
	30
	20
	2500
Realizar leituras no espectrofotômetro em 595 nm, iniciando pela curva padrão.
Deixar incubando por 20 minutos no escuro.�
Calcular o ponto de calibração para cada ponto da curva (FC = [ ]/Abs)
Calcular a concentração da proteína utilizada. (C = Abs x FCM) 
�
- Preparo do Coomassie Brilliant Blue 1 L:
Dissolver 100 mg de Comassie Brilliant Blue G 250 em 50 mL de etanol.
Agitar e adicionar lentamente 100 mL de ácido fosfórico concentrado. 
Completar o volume com água destilada e/ou deionizada para 1 L.
Filtrar a solução em papel filtro.
Resultados:
- Diluição do leite 50 x para a amostra:
30 mL de volume final:
1 – 50
X – 30
X= 0,6 mL 
Então:
600 µL de leite para 2400 µL de água.
- Curva Padrão de Albumina 1 mg/mL
�
- Fator de Calibração (FC = [ ]/Abs)
	Curva Padrão - Bradford 1996
	
	Tubo
	[ ] mg/mL
	Abs
	FC
	FCM
	1
	0,2
	0,203
	0,985
	1,0524
	2
	0,4
	0,451
	0,886
	 
	3
	0,6
	0,542
	1,107
	 
	4
	0,8
	0,715
	1,118
	 
	5
	1
	0,857
	1,166
	 
- Amostra – Quantificação de Proteínas (C = Abs x FCM)
	Amostra
	Tubos
	Abs
	[ ]
	1
	0,136
	0,143126
	2
	0,142
	0,149441
0,1431+0,1494 = 0,14628 x 50 x 2� = 18,285 mg/mL
 2
- x 50 porque o leite foi diluído 50 x.
- x 2,5 pela diluição da amostra no tubo de reação.
 
Discussões�: Na curva padrão podemos ver uma pequena variação entre a segunda e terceira medições no espectrofotômetro, o que resultou em um leve desnível, dificultando a linearidade da curva. Pode ter ocorrido um erro de pipetagem do preparo no tubo 3.
Se formos comparar os três experimentos de quantificação de proteínas, podemos dizer que o método de Lowry é sensível e preciso, com uma faixa de detecção de 10 a 1000 µg/mL, porém é incompatível com detergentes e agentes redutores, além de ser um processo demorado. Enquanto isso, o método de Bradford é compatível com agentes redutores e rápido, detectando entre 20 a 2000 µg/mL, mas também é incompatível com detergentes. Já o método de Biureto não tem praticamente nenhuma compatibilidade com agentes redutores, que são usados para estabilizarem proteínas em soluções, o que pode influenciar na qualidade da precisão de quantificação de proteínas.
Ao contrário do método de Lowry e Bradford este é compatível com detergentes, e também com agentes desnaturantes, o que lhe proporciona uma baixa variabilidade.
O método de Bradford como uma técnica rápida é eficiente, mas seu reagente exige altas concentrações de proteínas, isso poderia variar a quantificação, atribuindo uma menor precisão. Assim sendo, uma vantagem deste método é calcular proteínas de alta massa molecular, já que o reagente não se liga a baixas concentrações de proteínas. 
Comparando o resultado da quantificação do experimento com o valor nutricional na caixa do leite (Elege) obteve-se uma variação, enquanto no leite se tem aproximadamente 30 g/L, no experimento obtivemos 18 g/L. Variação� esta que pode ser por erros no procedimento de pipetagem, ou interferência de detergentes, como carboidratos e lipídios no caso do leite.�
Este método é comum na determinação de proteínas totais em plasma ou soro sanguíneo, leite e saliva humana, tecidos de planta e urina. Porém há contra indicações quanto ao uso deste método para determinar a quantidade de proteínas no leite, como o número de diluições da amostra e o resultado de proteínas que se obtém, e também a presença de proteínas de baixo peso molecular, subestimando a presença de proteínas totais na urina.�
Bibliografia�:
Relatório de aula prática “Quantificação de proteínas pelo método de Bradford”, IFRS – Técnico em Biotecnologia, data: 08/04/2014.
http://www.scielo.br/pdf/qn/v21n6/2914 Acesso: 22/04/2014
http://www.labome.com.br/method/Protein-Quantitation.html Acesso: 22/04/2014
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1413-41522008000200014 Acesso: 21/04/2014
LEHNINGER, Albert Lester, 1917-1986.
Lehninger princípios de bioquímica/David L. Nelson, Michael M. Cox; traduzido por Arnaldo Antônio Simões, Wilson Roberto Navega Lodi. 3. Ed. São Paulo 2002.
�Dica de formatação: usar fonte Times ou Arial para textos formais, como relatórios. E justificar o texto.
�?
�Unir estes dois parágrafos, tirando as partes repetitivas.
�Retomar o que é a curva padrão.
�Trecho está “solto” aqui sem conexão com o restante dotexto. Falar de espectrometria já q é utilizada para a dosagem de proteínas e então, dentro desse contexto, falar dessa Lei.
�? Frase solta aqui...
�Acima, já foi dito sobre interferentes e algumas vantagens. Juntar tudo em um único parágrafo.
�Explicar pq tem q diluir.
�Como eu comentei na aula dessa semana, dependendo do protocolo, o tempo de incubação varia de 5 a 20 minutos. E não precisa ser no escuro (confirmei isso depois da aula de Bradford).
�Onde:
FC é
FCM é
ABS é
C é
�Falta legenda no gráfico!!
�Não seria 2,5? 
�Formatar a discussão de modo que o texto seja organizado em parágrafos de acordo com o que se está discutindo em cada trecho.
�Comparar os valores obtidos entre os grupos. Mostrar as diferenças, colocando uma tabela com os valores de todos os grupos.
E os resultados de concentração de proteínas no leite são comparáveis com os da aula anterior?
�Como a amostra utilizada foi o leite, seria interessante falar dos tipos de proteínas presentes nele.
�? Frase confusa. Na frase anterior, diz é comum utilizar este método para dosar proteínas no leite e aqui se contradiz. E surge a urina na história. Ajeitar frase.
�Rever! Não está na formatação correta.