Metabolismo do DNA RNA e prot

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METABOLISMO DO DNA
Profa. Dra. Daniela L. Ambrósio
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- Erros não corrigidos durante a síntese do DNA podem não apenas afetar ou eliminar permanentemente a função de um gene, mas tb torna esse erro herdável 
- Muitas descobertas foram feitas em E. coli
- Metabolismo do DNA: processo no qual cópias de moléculas de DNA são fielmente sintetizadas e o processo que afeta a estrutura da informação (reparo e recombinação)
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- Watson e Crick: uma fita é complementar à outra 
- 1957: Meselson e Stahl
- Cada fita serve como molde para a produção das fitas-filhas (seq previsível e complementar) - semiconservativa
REPLICAÇÃO DO DNA
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- A replicação é bidirecional – marcação da timidina com trítio (3H)
- A replicação começa na origem – sempre iniciam em um ponto (sequências ricas em A-T) 
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- A outra fita é sintetizada em pedaços curtos chamados de fragmentos de Okazaki (poucas centenas a alguns milhares de nt) 
- Fita descontínua ou atrasada: síntese 5’3’ prossegue na direção oposta 
- Fita contínua ou líder: síntese 5’3’ prossegue na mesma direção da movimentação da forquilha de replicação 
- A síntese do DNA ocorre na direção 5’3’ (alongamento ocorre no OH 3’ livre) e é semidescontínua
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- exonucleases: degradam DNA (dupla ou simples fita) a partir de uma extremidade da molécula (direção 5’3’ ou 3’5’) 
- endonucleases: degradam sítios internos 
Enzimas envolvidas no metabolismo do DNA 
- Nucleases ou DNAses: enzimas que degradam DNA (exonucleases e endonucleases) 
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- Requerimentos para a polimerização: molde (A-T e C-G) e iniciador
- iniciador: segmento de uma fita de DNA, complementar ao molde, com grupo OH 3’ livre, geralmente oligonucleotídios de RNA sintetizados por enzimas especializadas
- DNA polimerases: enzimas que sintetizam DNA
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Atividade exonucleásica 3’5’: revisão (aumento da acurácia 102-103)
Antes que a polimerase se movimente, a citosina sofre um deslocamento tautomérico de C* para C. O novo nucleotídio está agora despareado
A extremidade 3’-OH despareada na fita em crescimento bloqueia o alongamento posterior. A DNA polimerase desloca-se para trás para posicionar a base despareada no sítio ativo da exonuclease 3’5’
O nucleotídio despareado é removido
A DNA polimerase desloca-se para frente e reassume sua atividade de polimerização
- Fidelidade alta: em E. coli erro ocorre a cada 109-1010 nt adicionados – 1x a cada 1.000-10.000 replicações – discriminação pela geometria
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- DNA polimerases: I, II, III, IV e V em E. coli
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Atividade exonucleásica 5’3’: substituição de um segmento de DNA ou RNA pareado a uma fita molde (deslocamento de corte) para reparo ou remoção de iniciadores
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- Na replicação em E. coli, além da DNA polimerase, existem 20 ou mais proteínas com funções específicas
- Topoisomerases: alívio do estresse topológico no DNA 
- Helicases: separação das fitas de DNA com gasto de ATP
- Proteínas de ligação ao DNA: estabilizam as fitas de DNA separadas
- Iniciases: síntese de segmentos curtos de RNA (iniciadores)
Sistema da DNA replicase (replissomo) 
- Síntese de DNA: iniciação, alongamento e terminação (experimentos in vitro com E. coli) 
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INICIAÇÃO
- Origem de replicação da E. coli (oriC): 245pb contendo segmentos de DNA altamente conservados 
iniciossomo
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1) 4-5 moléculas da proteína DnaA se ligam às 4 repetições de 9pb na origem
2) Região das repetições de 13pb é reconhecida e desnaturada (requer ATP e prot HU)
3) Prot DnaC posiciona a prot DnaB na região desenovelada e esta funciona como helicase – forquilha de replicação bidirecional
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- Síntese da fita líder e da fita atrasada 
- Fita atrasada: fragmentos de Okasaki
- Fita líder: a iniciase (prot DnaG) sintetiza um pequeno RNA (10-60nt) na origem de replicação (iniciador) e em seguida a DNA pol III adiciona os dNTPs continuamente
ALONGAMENTO
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DNA pol III
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replissomo
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- As forquilhas de replicação do DNA circular de E. coli se encontram na região Ter (várias sequências 20pb) 
- O complexo Tus-Ter não permite a continuação da replicação 
TERMINAÇÃO
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- Moléculas de DNA maiores que as de bactérias e organizadas em estruturas complexas de nucleoproteínas
- As origens de replicação são chamadas de ARS (sequências de replicação autonômicas) ou replicadores e aparecem esparramadas pelos cromossomos
- Características essenciais da replicação são as mesmas 
- A iniciação requer uma proteína de subunidades múltiplas chamada de ORC (complexo de reconhecimento da origem) 
- A vel de replicação é de ~50 nt/seg (1/20 da observada em E. coli)
Replicação nas células eucarióticas 
- A terminação da replicação nos cromossomos eucarióticos lineares envolve a síntese dos telômeros na extremidades de cada cromossomo
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- Lesão do DNA: processos espontâneos ou catalisados por agentes ambientais
- Mutação: alteração permanente no DNA que é transmitida a gerações futuras
- Mutação silenciosa: afeta região não funcional do DNA ou não tem efeito funcional sobre o gene
- Mutação por substituição (substituição de bases) ou por inserção ou deleção (adição ou deleção de bases)
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- Cél de mamífero acumula milhares de lesões em 24h – mecanismos de reparo – 1 mutação em cada 1.000 lesões
- Mutações X Câncer
- Os danos de despareamento (presença de bases que não fazem o pareamento A-T ou C-G) ou excisão de bases podem ser reparados no DNA.
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- Rearranjo da informação dentro e entre moléculas de DNA
Funções da recombinação genética:
- Sistemas de reparo do DNA
- Atividades especializadas na replicação do DNA
- Regulação da expressão de certos genes
- Facilitação da segregação cromossômica durante a divisão celular eucariótica
- Manutenção da diversidade genética e implementação de rearranjos genéticos durante o desenvolvimento embrionário
- 3 classes gerais: recombinação genética homóloga, recombinação sítio-específica e transposição de DNA 
RECOMBINAÇÃO DO DNA 
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1) Recombinação genética homóloga
- Trocas genéticas entre quaisquer 2 moléculas de DNA (ou segmentos de uma mesma molécula) que compartilham uma região extensa de sequência quase idêntica
- Trocas ocorrem somente em uma determinada sequência 
- Esse sistema depende de uma recombinase específica que cliva somente determinadas sequências de DNA
- Ocorre na regulação da expressão gênica de certos genes e rearranjo de DNA programado no desenvolvimento embrionário ou nos ciclos de replicação de alguns DNAs virais e dos plasmídios
2) Recombinação sítio-específica 
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- Segmento curto de DNA capaz de se movimentar de uma localização para outra em um cromossomo ou cromossomos diferentes – elementos transponíveis, transposons ou “genes saltadores”
- Relacionado com resistência de bactérias a ATB
- Processo altamente regulado e usualmente muito infrequente
- Ex: genes das Igs
3) Transposição do DNA
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- Transcrição: conversão da informação genética de um segmento de DNA em uma fita de RNA (sequência complementar) por um sistema enzimático 
- Enquanto na replicação um cromossomo inteiro é copiado, na transcrição apenas genes particulares ou grupos de genes são transcritos em um determinado momento (certas partes do DNA nunca são transcritas)
- RNA: transmissão da informação, catálise e função estrutural 
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- Transcrição X Replicação: ocorre pelo mesmo mecanismo químico, polaridade e uso de molde, mas não necessita de um iniciador e envolve segmentos limitados do DNA
- A síntese ocorre na direção 5’3’
- RNA polimerase dependente de DNA: requer DNA molde, ribonucleosídeos 5’-trifosfatados (ATP, CTP, GTP e UTP) e Mg2+ 
- o início da transcrição é marcado por uma sequência de bases denominada de região promotora 
TRANSCRIÇÃO
- 50-90 nt/seg
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- As topoisomerases são responsáveis pelo alívio da tensão gerada na abertura das fitas
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- RNA polimerase: não apresenta sítio exonucleásico 3’5’ (revisão),
taxa de erro é maior que da DNA pol (1 erro a cada 104-105) 
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- RNA pol liga-se a sequências específicas (muito variáveis), denominadas promotores, que direcionam a transcrição de segmentos adjacentes de DNA (genes) 
INICIAÇÃO
- convenção: pb DNA que correspondem ao início do RNA são positivos e sequências anteriores (promotoras), são negativas – região promotora entre -70 e +30 
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- Sequência consenso: -10 5’-TATAAT-3’ 
- Elemento UP (“upstream promoter”): rico em AT, ocorre nas posições -40 e -60 nos promotores de certos genes altamente expressos 
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- O processo é regulado para que os produtos gênicos sejam formados nas proporções necessárias, podendo ocorrer em qualquer um dos estágios do processo 
TERMINAÇÃO 
- Ligação de proteínas ativadoras ou repressoras que regulam a atividade da RNA pol 
- O processo de terminação ainda não é bem entendido em eucariotos, mas em E. coli, a terminação ocorre dependente ou independente do fator protéico  (rho) 
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- 15-20 nt formam uma estrutura em grampo antes da terminação e uma sequência de 3 resíduos A próximo a extremidade 3’ do grampo 
Independente de  
- A terminação inclui uma sequência rica em CA (elemento rut). A proteína  associa-se com RNA em sítios específicos e migra na direção 5’3’ até encontrar o complexo de transcrição e liberar o RNA transcrito
Dependente de 
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RNA Pol I: síntese de RNA pré-ribossômico (rRNAs 18S, 5,8S e 28S) e os promotores variam bastante em sequência 
- Os eucariotos possuem 3 RNAs polimerases:
RNA Pol II: síntese de mRNAs e alguns RNAs especializados e reconhecem vários promotores diferentes (sequência comum TATA e Inr) 
RNA Pol III: sintetiza tRNAs, rRNA 5S e alguns outros RNAs pequenos especializados, os promotores são bem caracterizados 
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- A RNA Pol II requer outras proteínas chamadas de fatores de transcrição (TFII) que são altamente conservados em todos eucariotos 
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- A molécula de RNA recém-sintetizada (transcrito primário ou pré-RNA) contém uma sequência gênica codificante (éxons) interrompida por sequências não codificantes (íntrons) - splicing 
PROCESSAMENTO DOS RNAS 
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- O Cap tem a função de proteger o mRNA da ação de ribonucleases e tb ligar o mRNA ao ribossomo 
 
- A maioria dos mRNAs eucarióticos possuem um capacete 5’ (Cap) que é um resíduo de metilguanosina ligado ao resíduo 5’ terminal do mRNA por uma lig 5’,5’-trifosfato
Adição do Cap
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- S. cerevisiae, eubactérias e arqueobactérias praticamente não possuem íntrons 
Processamento dos íntrons 
- Os éxons em mRNAs de eucariotos possuem menos de 1.000 nt (100-200 nt geralmente) e os íntrons variam entre 50-20.000 nt 
- 4 classes de íntrons: grupo I, grupo II, íntrons processados e íntrons que requerem ATP e uma endonuclease 
- A maioria dos genes nos vertebrados contém íntrons, com poucas exceções como os genes que codificam as histonas 
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- Remoção ocorre por um complexo protéico chamado de ribonucleossomo (spliceosomo), pelo mesmo mecanismo da formação de laço dos íntrons do grupo II 
- 5 snRNPs estão envolvidas: U1, U2, U4, U5 e U6 
- Ribonucleossomo é formado por complexos de RNA (snRNAs) e proteínas especializados, denominados de pequenas ribonucleoproteínas (snRNPs) 
- Transcritos primários dos mRNAs nucleares 
Íntrons processados 
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- Adição de 80-250 resíduos de adenina na extremidade 3’ da maioria dos mRNAs eucarióticos 
- Sítio de ligação de proteínas específicas e proteção do RNA contra degradação 
Adição da cauda poli-A 
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- Processamento de diferentes formas gerando polipeptídeos diferentes 
Processamento alternativo 
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- Ex: gene calcitonina em ratos – regulação de Ca 
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- Síntese e degradação de mRNAs deve estar equilibrada 
- Produtos gênicos necessários somente por um curto período possuem mRNAs com meia-vida pequena (min ou seg) – ribonucleases 
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METABOLISMO DAS PROTEÍNAS
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- Síntese protéica: envolve quase 300 macromoléculas diferentes, 90% da energia de uma cél
- Início dos anos 50 (Zamecnik et al.) – injeção de aas radioativos em ratos e observação de frações subcelulares do fígado - ribossomos 
- 1 polipeptídeo de 100 resíduos é sintetizado em 5 seg pela E. coli
- As proteínas precisam ser sintetizadas em resposta às necessidades da célula, transportadas às localizações apropriadas e degradas qdo não forem mais necessárias
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- Francis Crick: 4 letras do ác nucléico poderia traduzir a liguagem de 20 letras das proteínas 
- tradução: síntese de proteína guiada por mRNA
- Código genético: 42=16, insuficiente para 20 aas
 43=64 
- códon: trinca de nt que codifica para um aa específico – lidas de maneira sucessiva e não superposta 
- Descobrimento dos tRNAs, como moléculas ligantes de aas (aminoacil-tRNA sintetases)
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- 1961: quais trincas correspondem cada aa? – RNA poli(U), poli(C), poli(A) e poli(G) correspondiam a fenilalanina, prolina, polilisina, não gerava, respectivamente 
- Khorana: síntese de RNA sintético com sequências repetitivas de 2 ou 4 bases definidas – 61 dos 64 possíveis códons 
- 1964: Nirenberg & Philip Leder – ribossomos isolados de E. coli poderiam se ligar a um tRNA específico na presença de um RNA sintético 
- Pauta de leitura: primeiro códon específica a sequência de códons a cada 3 nts 
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- Os outros 3 códons tratavam-se de códon de parada (stop códons)
- Códon de iniciação: AUG para todas as céls
- Códons de terminação: UAA, UAG e UGA 
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- Código genético é degenerado e universal (ancestral comum)
- Pauta aberta de leitura (ORF, open reading frame): pauta de leitura que não contenha um stop códon entre 50 ou mais códons – genes que codificam proteínas
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- Hipótese de oscilação (Crick) – no mín. 32 tRNAs para traduzir 61 códons
- A base oscilante do códon contribui para a rápida disociação do tRNA durante a síntese protéica 
- qdo vários códons especificam um aa, geralmente a diferença está na 3ª base – 2 primeiras letras são os determinantes de especificidade. Ex: Ala – GCU, GCC, GCA e GCG 
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1) Ativação dos aminoácidos: grupo carboxila do aa deve estar ativado para a formação da lig peptídica e cada aa deve estar ligado a um tRNA específico
3) Alongamento: polipeptídeo é sintetizado pela união dos aas codificados pelo mRNA 
2) Iniciação: ligação do mRNA ao ribossomo e tRNA de iniciação
4) Terminação e liberação: o término é sinalizado pelo stop códon e o polipeptídeo é liberado do ribossomo 
5) Enovelamento e processamento pós-tradução: o polipeptídeo adquire sua conformação tridimensional e pode sofrer processamento enzimático (adição ou remoção de aas, clivagem, lig de grupos)
SÍNTESE DE PROTEÍNAS
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- E. coli: 15.000 ou mais ribossomos, constituídos 65% rRNA e 35% proteínas (ribozima), compostos por subunidades 30S e 50S (70S total) 
Ribossomo
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- pequenos, fita única de RNA enovelada
tRNAs
- tRNAs em bactérias e no citosol de céls eucarióticas possuem entre 73-93 nt 
- No citosol, as aminoacil-tRNA sintetases esterificam os 20 aas aos seus tRNAs correspondentes, sendo cada enzima específica para um aa.
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- A síntese protéica começa na extremidade N-terminal e segue para a extremidade C-terminal 
- Em bactérias, o códon inicial é uma fMet (tRNAfMet e tRNAMet) e em eucariotos, o códon inicial é Met, mas existem tRNAs diferentes especializados para distinguir as diferentes posições
- O códon de iniciação AUG especifica o resíduo de Met inicial no N-terminal (2 tRNAs para Met) 
Iniciação
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1) Subunidade 30S do ribossomo se liga a IF-1 e IF-3, AUG do mRNA é posicionado (seq. Shine-Dalgarno) no sítio P (sítio peptidil)
2) tRNAfMet e IF-2 ligado ao GTP são adicionados no códon inicial
3) O complexo combina-se com a subunidade 50S. O GTP é hidrolisado e os IF são separados do complexo
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- As extremidades 5’ e 3’ do mRNA estão unidas por uma série de proteínas, o que facilita
a regulação da expressão
- O AUG de início é detectado após a procura pela primeira trinca a partir da extremidade 5’
- A tradução em geral é semelhante em bactérias e eucariotos, com algumas diferenças na iniciação
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Alongamento
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- Nos eucariotos não existe o sítio E, o tRNA é expelido diretamente qdo o ribossomo se move
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Terminação
- RF: fatores de terminação ou liberação (RF-1, RF-2 e RF-3) – hidrólise da lig entre o aa e o tRNA e dissociação do ribossomo 
- Em eucariotos há a presença de somente um fator de liberação, o eRF
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- Para uma tradução rápida de uma mensagem única são formados agregados de 10-100 ribossomos conectados a uma única fita de mRNA, traduzindo-a simultaneamente - polissomos
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- Em eucariotos o mRNA precisa deixar o núcleo para ser traduzido no citoplasma
- Em bactérias existe o acoplamento de transcrição e tradução
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- Durante ou após a síntese, o polipeptídeo assume progressivamente sua conformação natural (lig H, interações Van der Waals, iônicas e hidrofóbicas)
- Modificações pós-tradução: 
 modificações no N-terminal e C-terminal
 perda de seq de sinalização
 modificação de aas
 fixação de CHs
 adição de grupos isoprenil (ancoragem da proteína em membrana)
 adição de grupos prostéticos
 processamento proteolítico (ativação da proteína)
 formação de pontes S-S
- Algumas proteínas necessitam de algumas modificações para adquirirem sua conformação ativa
ENOVELAMENTO E PROCESSAMENTO
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- tetraciclinas: bloqueio do sítio A 
- cicloheximida:bloqueio da peptidiltransferase 
- cloranfenicol: bloqueio da transferência peptídica
- estreptomicina: induz má leitura do código genético
- Toxicidade em humanos: toxina diftérica (inativa um fator de elongamento) e ricina (inativa subunidade 60S do ribossomo) 
- Inibição da síntese protéica em bactérias: puromicina
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- Proteínas destinadas a secreção, integração em membrana plasmática, inclusão nos lisossomos, mitocôndria, cloroplastos e núcleo precisam ser direcionadas ao seu destino final – sequência sinalizadora
- As proteínas secretadas, do lisossomo e da membrana são enviadas para o RE e sofrem a clivagem da sequência sinalizadora
ENDEREÇAMENTO E DEGRADAÇÃO DE PROTEÍNAS
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SRP: partícula de reconhecimento da sinalização
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- As proteínas direcionadas ao núcleo possuem sequências sinalizadoras (NLS) que não são clivadas – entrada e saída do núcleo (ribossomo) e reimporte (divisão celular)
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- meia-vida de proteínas eucarióticas: 30 seg a muitos dias
- Proteínas defeituosas e de meia-vida curta são degradadas por sistemas citosólicos dependentes de ATP
- Nas céls eucarióticas a degradação envolve a ligação covalente à ubiquitina e degradação pelo proteassomo 26S
- A degradação de proteínas é necessária para impedir a liberação de proteínas anormais ou não desejáveis – reciclagem de aas
- Um sistema nos vertebrados presente nos lisossomos recicla os aas de prot de membrana, prot extracelulares e prot de meia-vida longa
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O DNA é a única molécula com sistema de reparo
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Pol IV e V estão envolvidas em uma forma não usual de reparo. Processividade das DNA polimerases: relacionada com o número de nt adicionados antes da enzima se dissociar
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Formam uma espécie de armadilha
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3 funções identificáveis em eucariotos: contribui para o reparo de lesões no DNA, fornece uma ligação transitória física entre as cromátides que promovem a segregação ordenada dos cromossomos na primeira divisão celular meiótica e aumenta a diversidade genética em uma população 
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Movimentação aleatória
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O primeiro nt inserido é mantem-se trifosfatado e durante o alongamento da fita, um segmento de 8pb é mantido temporariamente pareado
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Regiões -35 e -10 possuem semelhança entre promotores para diferentes genes
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Inr = sequência iniciadora
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TBP (TATA binding protein) se liga ao TATA box
TFIIH – desnatura as fitas e fosforila a pol II
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80-250 resíduos de A são adicionados após a clivagem de uma porção da região 3’
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No último grupo de íntrons as endonucleases clivem as lig em ambos lados e os éxons são unidos como na reação com DNA ligase
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Após horas ou dias da aplicação, todas as frações apresentavam-se radioativas, mas com min aparecia somente na fração ribonucleoproteica pequena. Depois por microscopia foi identificado o sítio de síntese proteica
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Crick acreditava que existia um adaptador ligando o aa e reconhecendo o código
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A síntese de novas sequências de RNA era aleatória
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2 tRNAs diferentes para códon iniciador e Met interna
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O tRNA se liga ao complexo EF-Tu-GTP e após a ligação do tRNA no sítio A o GTP é hidrolisado e o complexo liberado. Em seguida há a formação da lig peptídica (peptidil transferase) entre os aas e o tRNA fMet fica descarregado
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O ribossomo se move um códon a frente na direção da extremidade 3’. Assim, o tRNA descarregado vai para o sítio E para ser liberado, o tRNA que estava no sítio A passa para o sítio P e um novo tRNA se liga ao próximo códon no sítio A. 2 GTPs são hidrolisados no processo todo
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Puromicina possui grupamento semelhante ao 3’ do tRNA e com isso entra no polipeptídeo e a sintese é parada
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Ran GTPase