Aula 5 Separação de produtos naturais por técnicas cromatográficas

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
SEPARAÇÃO DE PRODUTOS NATURAIS POR TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
Acadêmicos: Daíse Miranda Ávila			RA: 94364
		 Lucas Folin Pereira		 	RA: 95183
		 Paula Cristina Perin			RA: 92862	
Docente: Gisele Freitas Gauze
Disciplina: Química Orgânica Experimental I
Turma: 003
Curso: Química Bacharelado
Maringá
25 de maio de 2016
Introdução
1.1 Cromatografia
A cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela está fundamentada no fato das substâncias presentes terem fiferentes propriedades e composições, tendo diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária.[1]
A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por comparação com padrões previamente existentes, para a purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e para a separa- ção dos componentes de uma mistura.[1]
Há diversos métodos cromatográficos que podem ser classificados de diferenrtes maneiras. Porém vamos dar ênfase para um, a cromatografia de camada delgada.
1.2 Cromatografia de Camada Delgada (CCD)
A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica de adsorção líquido–sólido. Neste caso, a separação se dá pela diferença de afinidade dos componentes de uma mistura, a qual deseja separar, pela fase estacionária.[1]
É a mais simples e mais econômica técnica cromatográfica, utilizada geralmente quando se pretende a separação rápida e a identificação visual. Devido a isso, é muito utilizada nas análises de substâncias, no acompanhamento de reações em sínteses, para determinar o número de componentes em uma mistura ou verificar a eficiência de uma separação.[2]
A sílica gel é a fase estacionária mais utilizada, sendo seguida pela alumina, pela terra diatomácea e pela celulose. Para a preparação das placas, faz-se uma suspensão do adsorvente em água, sendo a mesma depositada sobre a placa. Após a deposição, deixa-se a placa secar ao ar. A etapa final da preparação da placa é sua ativação, que ocorre na estufa a uma alta temperatura. Após a aplicação da(s) amostra(s) sobre a placa, a mesma deve ser introduzida numa cuba contendo a fase móvel adequada, como a figura 1.[1]
Imagem 1 – Cuba para cromatografia em camada delgada.
1.3 Fator de Retenção (Rf)
O parâmetro mais importante a ser considerado em CCD é o fator de retenção (Rf ), o qual é a razão entre a distância percorrida pela substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel.[1]
Imagem 2 - 
O valor de fator de retenção é um parâmetro físico de cada composto e pode ser utilizado para sua identificação caso se mantém constante o solvente, fase estacionária, condições ambientais, espessura da camada e a quantidade de amostra aplicada.[3]
1.4 Reveladores
Como a maioria dos compostos orgânicos é incolor, muitas vezes é necessário a utilização de um revelador para que se possa analisar o resultado. Existem dois métodos revelação, podendo ser um processo destrutivo ou não destrutivo. 
Os métodos não destrutivos mais utilizados são a utilização de placas onde a fase estacionária é fluorescente ou iodo. O primeiro visualiza substâncias fluorescentes (placa sem indicador) ou baseia-se na utilização de substâncias fluorescentes misturadas à sílica. O segundo vale-se do fato de que o iodo reage com muitos compostos orgânicos, formando complexos, e levando a formação de manchas amarelas até marrons.
Os processos destrutivos consistem na oxidação dos compostos sobre a placa, pulverizando-os com solução aquosa de um oxidante orgânico e/ou um ácido mineral, e submetendo-se a placa a altas temperaturas por alguns minutos. Os compostos orgânicos oxidados serão revelados na forma mais escura.
1.5 Principais pigmentos em vegetais
Pigmentos são moléculas que absorvem luz de comprimento de onda particular dentro do espectro do visível. A variedade de cores observada nas espécies vegetais é causada pela presença de pigmentos, os quais podem ser encontrados em todas as partes dos vegetais. Os pigmentos vegetais possuem em suas moléculas diferentes grupos funcionais, sendo que estes pigmentos estão agrupados pelo tipo de estrutura básica em: betalaínas, carotenóides, clorofilas, flavonoides, entre outros.[4]
As clorofilas são os pigmentos verdes mais abundantes presentes nas plantas. Existem alguns tipos de clorofilas. A “clorofila a” está presente em todos os organismos que realizam fotossíntese oxigênica. Ja a “clorofila b” está presente em vegetais superiores, algas verdes e algumas bactérias.[5]
Os carotenóides compreendem um grupo de pigmentos responsáveis pela coloração vermelha, amarela e laranja de várias flores, frutos e folhas. Estão divididos em carotenos e xantofilas. Os carotenos mais conhecidos são β-caroteno, de cor amarelo/laranja, que fornece cor as cenouras. Exemplos de xantofila são a zeaxantina, responsável pela coloração amarela dos grãos de milho. [4]
As betalaínas são compostos solúveis em água, que se localizam nos vacúolos das plantas. De maeira geral, elas são identificadas como um antioxidante natural por conta de seu envolvimento na proteção da partícula LDL-Colesterol. A principal fonte dos pigmentos produzidos pelas betalaínas é a beterraba. [6]
Por fim, os flavonóides são pigmentos naturais que atuam na proteção do vegetal contra agentes oxidantes. Em geral, têm origem biossintética e possuem dois anéis aromáticos em sua estrutura, sendo que um deles contém o agrupamento benzoi.[7]
Propriedades físicas e toxicidade
2.1 Hexano
Figura 2.1- Forma estrutural do hexano
Aparência: líquido incolor;
Fórmula química: C6H14;
Massa molar: 86,18 g/mol;
Densidade: 0.6548 g/ml, líquido;
Ponto de fusão (PF): -95 °C;
Ponto de ebulição (PE): 69 °C;
Solubilidade em água: 13 mg/L a 20 °C;
Riscos associados: Líquido inflamável e nocivo. Se a exposição for prolongada, pode causar dor de cabeça, náuseas, tonteiras, perturbações visuais e auditivas, além de excitação.
2.2 Acetona
Figura 2.2- Forma estrutural da acetona
Aparência: Líquido incolor;
Fórmula Química: C3H6O;
Massa Molar: 58,08 g/mol;
Densidade (20ºC): 0,79 g/cm³;
Ponto de fusão (PF): -95 °C;
Ponto de ebulição (PE): 56ºC;
Solubilidade em água: miscível a 20 °C;
Riscos associados: a acetona não é um composto muito tóxico; ela pode, no entanto, irritar e danificar a pele e agredir a mucosa da boca. Os tipos de acidentes mais comuns são por ingestão ou inalação da acetona, mas outros tipos também podem acontecer, como queimaduras por uso inadequado do produto e acidentes por intoxicação, os quais podem levar a inconsciência e morte dependendo da quantidade inalada.
2.3 Sulfato de sódio
Figura 2.3. Forma estrutural do sulfato de sódio
Aparência: Sólido cristalino branco;
Fórmula Química: Na2SO4;
Massa Molar: 142,04 g/mol;
Densidade: 2,70 g/cm3 na forma anidro a 20 °C;
Ponto de fusão (PF): 884ºC na forma anidro;
Solubilidade em água (20ºC): 170 g/L;
Riscos associados: Irritante.
2.4 Clorofórmio 
Figura 2.4 – Forma estrutural do clorofórmio
Aparência: Líquido incolor;
Fórmula Química: CHCl3;
Massa Molar: 119,38 g/mol;
Densidade: 1,48 g/cm³ a 20 °C
Ponto de fusão (PF): -63ºC;
Ponto de ebulição (PE): 61ºC;
Solubilidade em água: 8,0 g/L a 20 °C
Riscos associados: Pode ser fatal se for aspirado ou inalado. Causa irritação à pele, olhos e trato respiratório. Afeta o sistema nervoso central, rins, sistema cardiovascular e fígado. Pode causar câncer dependendo do nível e duração de exposição.
3. Objetivos
O objetivo desta prática é separar os compostos presentes na “Spinacia oleracea”, popularmente conhecida como espinafre, através do método de cromatografia em camada delgada.
4. Procedimento Experimental
4.1 Preparação do extrato
Ao iniciar-se o experimento, folhas de uma planta qualquer foram cortadas em pedaços bem pequenos e, em seguida, colocadas dentro de
um almofariz. Ao mesmo recipiente, foi adicionado, aos poucos, cerca de 30 mL de uma mistura de hexano/acetona (20:10 mL) enquanto as folhas eram maceradas.
Após isso, realizou-se a filtração da planta juntamente com o solvente em um béquer e, em seguida, transferiu-se o filtrado para o funil de separação, adicionando também, 10 mL de água. Agitou-se levemente o funil visando à separação da fase aquosa da fase orgânica. O processo foi repetido mais uma vez, sempre descartando a fase aquosa.
Terminada a filtração, transferiu-se a fase orgânica para um erlenmeyer e acrescentou-se o secante (sulfato de sódio anidro).
A mistura foi introduzida em um balão de fundo redondo, o qual foi acoplado ao sistema evaporador rotativo, para evaporar o solvente.
4.2 Desenvolvimento do cromatograma
Após a evaporação, adicionou-se cerca de 10 mL de clorofórmio ou hexano/acetona (7:3 mL) ao recipiente para dissolver o resíduo e, então, transferiu-se a mistura para pequenos frascos.
Preparou-se uma cuba, utilizando um béquer e um papel filtro. Dentro da mesma, foram colocados aproximadamente 25 mL de clorofórmio e, em seguida, tampou-a com um vidro de relógio.
Aplicou-se, com o auxílio de um capilar, a solução de pigmentos sobre uma placa de sílica. Colocou-se, então, a placa na cuba, evitando que o ponto de aplicação mergulhasse no solvente.
Ao final da corrida, a placa foi retirada e a frente do solvente foi marcada. Deixou-se secar ao ar e observou-se as manchas.
Foi preparada uma nova cuba usando uma mistura de clorofórmio/acetona (25:2,8 mL) como eluente, e o processo foi repetido. 
4.3 Cromatografia da cafeína
Primeiramente, montou-se a cuba da mesma maneira que o experimento anterior, entretanto, o eluente utilizado neste caso foi uma mistura de clorofórmio/metanol (36:4 mL).
Adicionou-se uma pequena quantidade de clorofórmio nos frascos contendo a cafeína padrão e, a cafeína extraída no experimento da aula anterior.
Aplicou-as com um capilar na placa de sílica, sendo que a cafeína experimental foi aplicada em duas concentrações diferentes. Ao término da corrida, removeu-se a placa e utilizou-se o revelador Dragendorff (Bi2(CO3)3, KI, HCl e H2O) e também, iodo, para tornar os compostos visíveis.
5. Resultados e Discussão
5.1 Preparação do extrato
Após os processos de maceração – feita com intuito de que os solventes penetrassem na planta de retirassem os compostos necessários – e filtração, feitos com as folhas da planta, realizou-se a separação das fases orgânica (verde escuro) e aquosa (verde claro), que foi descartada – devido o fato de que a água solubiliza grande parte dos compostos que não são pigmentos – em duplicata, sendo que na segunda vez foi adicionada uma pequena quantidade de NaCl para reduzir a emulsão que havia se formado entre as duas fases no recipiente.
Ao erlenmeyer contendo a fase orgânica, foi adicionado sulfato de sódio anidro (Na2SO4) como agente secante para retirar o excesso de água do meio. Depois, esta solução foi transferida para o mesmo balão de fundo redondo que continha a fase orgânica do grupo que trabalhou com a mesma planta, para que o processo de vaporização do solvente pudesse ser realizado.
5.2 Desenvolvimento do cromatograma
Foi estipulado que dois dos quatro grupos deveriam utilizar clorofórmio como eluente e os outros dois usariam uma mistura de hexano e acetona. 
Houve a aplicação de três pontos sobre a placa de sílica (polar), sendo a primeira em menor concentração, a segunda em concentração intermediária e, a terceira em maior concentração. Além disso, calculou-se o Fator de Retenção (Rf) apenas para o ponto em que a presença dos componentes da planta foi percebida com maior facilidade, facilitando na mensuração da distância percorrida por cada componente.
Através da cromatografia foi possível notar a presença de seis principais pigmentos presentes na planta, os quais estão dispostos na tabela 1 a seguir:
	Tabela 01. Pigmentos identificados no processo de extração
	PIGMENTO
	COR
	B-caroteno
	Amarelo-laranja
	Feoftina a
	Cinza
	Feoftina b
	Cinza claro
	Clorofila a
	Verde-azulado
	Clorofila b
	Verde
	Xantofilas
	Amarelo
5.2.1 Cromatograma com a utilização de clorofórmio como eluente
Ao término da primeira corrida, foi possível observar que a amostra de B-caroteno (mancha alaranjada) interagiu mais com o eluente, percorrendo uma distância maior em relação às demais na placa de sílica. Logo, pode-se dizer que o B-caroteno é o pigmento menos polar (ou mais apolar) dos seis observados.
Em contrapartida, as amostras de xantofilas (mancha amarela) e clorofila a e b (mancha verde) interagiram mais com a fase estacionária, percorrendo menores distâncias na placa. Dessa forma, foi possível inferir que o caráter polar é maior, em ordem decrescente, nos pigmentos de xantofila, clorofila b e clorofila a. 
Os pigmentos de feoftina a e b ficaram posicionados entre a clorofila a e o B-caroteno. Portanto, ambos apresentam caráter polar maior que o B-caroteno e menor que a clorofila a, sendo que a feoftina a é menos polar que a feoftina b, pois percorreu uma distância menor na placa.
Além disso, é válido ressaltar a dificuldade para observar a diferença entre a clorofila a e a clorofila b, como também entre a feoftina a e a feoftina b, em razão de apresentarem coloração semelhante e da interação com a fase estacionária ser próxima, nos dois casos.
Quando se aumentou a polaridade com a adição de clorofórmio e acetona, o meio ficou mais polar, proporcionando às xantofilas, clorofilas a e b e feoftinas a e b uma maior interação com a fase móvel. Dessa forma, estes compostos apresentaram uma melhor distribuição na placa, em comparação com a distribuição obtida na primeira corrida, visto que foi possível diferenciar as clorofilas e as feoftinas. Também foi observado que a influência desta adição foi nula no B-caroteno, pois não se permitiu que o solvente o atingisse. 
Considerando que a distância percorrida pela frente do solvente foi de, aproximadamente, 7,3 cm, calculou-se a distância de cada substância presente na aplicação de maior concentração através do fator de retenção (Rf), cujos dados estão dispostos na tabela 2 abaixo. 
	Tabela 2 – Fator de retenção dos pigmentos observados na cromatografia com eluente clorofórmio.
	PIGMENTOS
	FATOR DE RETENÇÃO (cm)
	B-caroteno
	0,81
	Feoftina a
	0,56
	Feoftina b
	0,51
	Clorofila a
	0,33
	Clorofila b
	0,21
	Xantofilas
	0,12
Comparando a polaridade com o fator de retenção obtido para cada pigmento, foi possível constatar que, quando a fase estacionária tem caráter polar, compostos mais polares ficam mais retidos na placa e apresentam menores valores de Rf, enquanto os menos polares (ou mais apolares) percorrem maiores distâncias e apresentam maiores valores de Rf.
O cromatograma da amostra da planta com a utilização de clorofórmio como fase móvel encontra-se disponível no anexo A.
5.2.2 Cromatograma com a utilização de hexano/acetona como eluente
A mistura de hexano e acetona, assim como o clorofórmio, constitui um eluente polar, portanto, as interações dos componentes da amostra da planta com a mesma foram semelhantes às apresentadas pelo cromatograma do experimento em que foi utilizado clorofórmio como fase móvel.
Além disso, antes de iniciar-se a segunda corrida, a adição de clorofórmio e acetona ao meio também proporcionou uma melhor distribuição dos componentes que haviam interagido pouco com a fase móvel, os quais correspondem às xantofilas, clorofilas a e b e feoftinas a e b. E, analogamente ao resultado do experimento anterior, a influência desta adição foi nula no B-caroteno.
Considerando que a distância percorrida pela frente do solvente foi de cerca de 6,8 cm, calculou-se a distância de cada substância presente na aplicação de maior concentração através do fator de retenção (Rf), cujos dados estão dispostos na tabela 3 abaixo.
	Tabela 2 – Fator de retenção dos pigmentos
observados na cromatografia com eluente hexano/acetona.
	PIGMENTOS
	FATOR DE RETENÇÃO (cm)
	B-caroteno
	0,90
	Feoftina a
	0,53
	Feoftina b
	-
	Clorofila a
	0,44
	Clorofila b
	0,38
	Xantofilas
	0,16
Se comparado com o cromatograma do experimento em que foi utilizado clorofórmio como eluente, pode-se afirmar que a mistura de hexano e acetona constitui um solvente com polaridade que interagiu e separou melhor os componentes das amostras da planta, visto que houve maior facilidade em diferenciar as cores e, também, em observar a separação dos pigmentos. 
No entanto, neste cromatograma não foi possível observar a vigor o pigmento de feoftina b, cuja coloração é cinza claro, enquanto no cromatograma do experimento anterior, ainda que não tenha sido fácil, esta visualização foi possível. Devido a isto, não se determinou o Fator de Retenção para a amostra de feoftina b.
O cromatograma da amostra da planta com a utilização da mistura entre hexano e acetona como fase móvel encontra-se disponível no anexo B.
5.3 Cromatografia da cafeína
Inicialmente, a amostra de cafeína obtida na aula anterior estava sob a forma de um sólido marrom, enquanto a de cafeína pura se encontrava na forma de um sólido esbranquiçado. Quando as duas foram aplicadas na placa de sílica, observou-se que a cafeína pura havia ficado incolor, enquanto a experimental apresentava uma leve coloração amarronzada.
Após a corrida, foi possível notar dificuldade em visualizar os componentes da amostra nas três aplicações, visto que não tinham exibido coloração. Em razão disso, foi necessária a utilização dos reveladores iodo e Dragendorff.
Na presença do revelador iodo, observou-se mudança de coloração apenas nas amostras da cafeína obtida na aula prática anterior. Logo, pode-se dizer que o composto revelou apenas impurezas, pois não houve revelação de cor na amostra pura (padrão). O cromatograma deste caso encontra-se disposto no anexo C.
Em contrapartida, quando o cromatograma foi disposto em uma câmara na presença do revelador Dragendorff, revelou apenas a cafeína pura. O cromatograma deste caso encontra-se disposto no anexo D.
Sendo assim, para a revelação de compostos alcalóides como, por exemplo, a cafeína, é indicada a utilização do revelador Dragendorff.
6. CONCLUSÃO
Com a realização deste experimento, pode-se afirma que através da cromatografia em camada delgada é possível visualizar e identificar alguns pigmentos presente na planta, como o b-caroteno, as feoftinas a e b, as clorofilas a e b e as xantofilas. Assim como foi possível verificar que a utilização de hexano e acetona (9:1) como eluente é mais indicado do que o clorofómio, ja que aqueles tiveram um melhor desempenho na separação e são menos tóxicos. 
Além disso foi possível conferir a utilização da cromatografia em camada delgada para determinar a pureza dos compostos isolados como no caso da cafeína. Como também a necessidade de utilização de reveladores em substâncias incolores.
ANEXO A – CROMATOGRAMA DA PLANTA ANEXO B – CROMATOGRAMA DA PLANTA 
COM CLOROFÓRMIO COM HEXANO/ACETONA
 
ANEXO C – CROMATOGRAMA DA CAFEÍNA ANEXO D – CROMATOGRAMA DA CAFEÍNA 
 NA PRESENÇA DO REVELADOR IODO NA PRESENÇA DO REVELADOR DRAGENDORF