Métodos de Quantificação de Proteínas

Prévia do material em texto

Métodos de Quantificação de Proteínas
QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS UTILIZANDO O QUBIT®
A quantificação de proteína pode ser realizada utilizando-se o Qubit® Protein Assay Kit e o equipamento Qubit® Fluorometer. É utilizado um fluóroforo e um fluorímetro que quantifica a intensidade de fluorescência presente em cada amostra, que é diretamente proporcional à concentração de proteína da amostra.
Diluir as amostras de proteína 20 vezes: 1 µL de proteína total + 19 µL de água Milli-Q.
Preparar a solução de trabalho (Working Solution - WS) que será utilizada na calibração e quantificação. Para cada amostra: 199 µL tampão (vem com o kit) + 1 µL fluoróforo (vem com o kit). O fluoróforo congela na geladeira, portanto, deve ser retirado alguns minutos antes da quantificação. Não esquecer que o equipamento deve sempre ser calibrado antes de qualquer quantificação. A calibração é realizada com os três padrões que vêm junto com o kit (Standard 1 = 0 ng/µL, Standard 2 = 200 ng/µL e Standard 3 = 400 ng/µL). Logo, se você tiver quatro amostras para quantificar, deve preparar WS suficiente para sete amostras.
Dica: se você tiver que quantificar várias amostras, preparar WS para uma reação a mais, para que não falte WS devido a erros de pipetagem ou de calibração da micropipeta.
Preparação dos padrões para a calibração: Standard 1: 190 µL WS + 10 µL Standard 1 Standard 2: 190 µL WS + 10 µL Standard 2 Standard 3: 190 µL WS + 10 µL Standard 3
Preparação das amostras:
Cada amostra: 199 µL WS + 1 µL proteína (diluído 20 X).
Agitar por 5 segundos no vórtex.
Ligar o fluorímetro e selecionar “proteína”. Após calibrar o equipamento, quantificar cada uma das amostras de proteína.
Dica: caso alguma das amostras apresente uma concentração de proteína muito alta ou muito baixa (fora da curva padrão), é possível variar o volume de proteína diluído que se usa na reação. Por exemplo, ao invés de usar 1 µL de proteína diluído 20 X, pode ser utilizado 2, 5 ou 10 µL. Basta informar ao equipamento o volume de proteína utilizado na reação. Tome cuidado ao utilizar volumes maiores de proteína, pois o volume de WS será menor, uma vez que a reação sempre tem volume final de 200 µL. Alternativamente, a solução de proteína pode ser menos diluída (5 ou 10 X), ou mesmo utilizar a solução de proteína não diluída.
QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DE BRADFORD
O método baseia-se na adição de etanol, ácido fosfórico e um corante chamado Azul Brilhante de Coomassie G-250 à solução contendo proteínas. No pH de reação, a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante provoca o deslocamento do equilíbrio do corante da forma aniônica (vermelha) para a forma catiônica (azul), que absorve fortemente em 595 nm.
Método Bradford:
Reagentes
Albumina 1 mg/mL (armazenada a -20 ºC)
Solução de Comassie Blue (armazenada 4 ºC) 0,05 g Comassie (Briliant Blue G)
25 mL de Etanol 95%
50 mL de Ácido ortofosfórico 85% 500 mL de água Milli-Q
Procedimento
Identificar os tubos da curva e das amostras.
Descongelar a albumina em gelo;
Pipetar a Curva padrão de Albumina, em duplicata ou triplicata, conforme os volumes indicados na segunda coluna da tabela 1.
Tabela 1 – Volumes aplicados nos tubos para quantificação de proteína pelo método Bradford.
	Tubos
	Albumina 1mg/mL
	NaOH 1N
	Comassie Blue
	Branco
	-
	50 µL
	2,5 mL
	1
	10 µL
	40 µL
	2,5 mL
	2
	20µL
	30 µL
	2,5 mL
	3
	30 µL
	20 µL
	2,5 mL
	4
	40 µL
	10 µL
	2,5 mL
Dica: dependo das necessidades do experimento, mais pontos de curva podem ser adicionados, ou a curva pode ter maior amplitude. Isto deve ser determinado para cada tipo de amostra.
Pipetar 10 µL das amostras em duplicata ou triplicata nos tubos identificados.
Nos tubos da curva de albumina, pipetar os volumes indicados de NaOH 1 N na terceira coluna da tabela 1, e homogeneizar no vórtex.
Nos tubos de amostras, pipetar 40 µL de NaOH 1 N e homogeneizar no vórtex.
Em todos os tubos, adicionar 2,5 mL de solução de Coomassie Blue, e homogeneizar no vórtex.
Reservar solução por 5 minutos e, posteriormente, fazer a leitura em 595 nm, zerando com o Branco e começando pela Curva.
Cálculo
Calcular o FCP (fator de calibração parcial) de cada ponto da curva:
FCP1 = Q1/A1
Onde: Q = quantidade de proteína adicionada e A = absorbância
Calcular a FCM (fator de calibração médio) = média das FCPs
Estabelecer uma faixa: FCM +10% e -10% ver quais se encaixam. Se algum ponto ficar fora, calcular novo FCM com os que estão dentro da faixa. Calcular a proteína das amostras:
Abs x FCM x 100 (para passar para mL) = mg/mL de proteína Dicas:
Quando dosar um tipo de amostra nova, recomenda-se testar diferentes diluições da mesma para definir qual diluição resulta em absorbâncias que fiquem dentro da curva.
Para uma curva mais precisa, recomenda-se mais pontos por curva.
O presente protocolo recomenda que a quantificação seja feita em duplicata. Porém, realizar a curva e amostras em triplicata ou mesmo quatriplicata dará mais segurança estatística a dosagem de proteínas.
Em caso de amostras com pouca proteína, pode-se fazer uma curva diluída, usando BSA 0,1 mg/mL.
Evitar dosar amostras com excesso de detergentes (> 2%), o que pode levar a interferência no método.
Referências:
BRADFORD, M. Analytical Biochemistry. 72, 248-254, 1976.
QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DE LOWRY
O método de Lowry et al. (1951) é baseado na complexação do cobre em meio alcalino formando uma cuproproteína de cor azul, lido espectrofotometricamente. Os íons cobre, em meio alcalino, reagem com as ligações peptídicas das proteínas, formando um complexo de cor púrpura proporcional à concentração de proteínas presentes na amostra. A albumina bovina é utilizada como padrão.
Método de Lowry:
Reagentes
Albumina 1 mg/mL
Folin 1 N – armazenado na geladeira
Reativo A - Solução de NaOH 0,1 M com Na2CO3 2%.
Reativo B – Partes iguais de B1 (CuSO4 1%) e B2 (tartarato de Na e K 2%):
Dica: Armazenar o reagente B1 em frasco âmbar; e o reagente B2 em frasco plástico.
Reativo C – Partes Reativo Alcalino Cobre:
50 partes do Reativo A para 1 parte do Reativo B. Preparar somente na hora do uso e em frasco âmbar.
Adicionar os reagentes na ordem: A, B1 e B2. Na tabela abaixo, alguns valores padrões para volumes de rotina.
Volume A	Volume B
20 mL	0,4 mL = 200 µL B1 + 200 µL B2
30 mL	0,6 mL = 300 µL B1 + 300 µL B2
40 mL	0,8 mL = 400 µL B1 + 400 µL B2
50 mL	1,0 mL = 500 µL B1 + 500 µL B2
100 mL	2,0 mL = 1.000 µL B1 + 1.000 µL B2
Procedimentos
Identificar os tubos da curva e das amostras.
Descongelar a albumina;
Preparar o Reativo C (quantidade necessária de acordo com o número de amostras e suas duplicatas);
Pipetar a Curva padrão de Albumina.
	
Tubos
	Padrão de
albumina 1mg/
	
Água Milli-Q
	
Q (Cálculo)
	
	mL
	
	
	Branco
	0
	100 µL
	0,00 mg
	1, 1’
	10 µL
	90 µL
	0,01 mg
	2, 2’
	20 µL
	80 µL
	0,02 mg
	3, 3’
	40 µL
	60 µL
	0,04 mg
	4, 4’
	60 µL
	40 µL
	0,06 mg
	5, 5’
	80 µL
	20 µL
	0,08 mg
	6, 6’
	100 µL
	0
	0,10 mg
Pipetar as amostras em duplicatas nos tubos identificados, adicionando em cada um 10 µL da amostra e 90 µL de água.
Adicionar 1 mL do reativo C na curva e nas amostras.
Homogeneizar os tubos no vórtex e após, deixar 10 minutos em repouso.
Adicionar 100 µL de Folin 1 N na curva e nas amostras.
Homogeneizar os tubos no vórtex e manter em ambiente escuro por 20 minutos (a cor é estável por até 2 horas).
Realizar leitura em espectrofotômetro a 650 nm, em cubeta de plástico, lavando-a com água entre diferentes amostras.
Cálculo
Calcular o FCP (fator de calibração parcial) de cada ponto da curva:
FCP1 = Q1/A1
Onde: Q = quantidade de proteína adicionada e A = absorbância Calcular a FCM (fator de calibração médio) = média das FCPs
Estabelecer uma faixa: FCM +10% e -10% ver quais se encaixam. Se algum ponto ficar fora, calcular novo FCM com os que estão dentro da faixa. Calcular aproteína das amostras:
Abs x FCM x 100 (para passar para mL) = mg/mL de proteína Dicas:
Quando dosar um tipo de amostra nova, recomenda-se testar diferentes diluições da mesma para definir qual diluição resulta em absorbâncias que fiquem dentro da curva.
Para uma curva mais precisa, recomenda-se mais pontos por curva.
O presente protocolo recomenda que a quantificação seja feita em duplicata. Porém, realizar a curva e amostras em triplicata ou mesmo quatriplicata dará mais segurança estatística à dosagem de proteínas.
Em caso de amostras com pouca proteína, pode-se fazer uma curva diluída, usando BSA 0,1 mg/mL.
Evitar dosar amostras com excesso de detergentes (> 2 %), o que pode levar à interferência no método.
Referências:
LOWRY, O.H., Rosebrough, N.J., Lewis-Farr, A., Randall, R.J. (1951). Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275.
QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO BCA
Método do ácido bicinconínico (BCA) (Smith et al., 1985):
O método de BCA é um ensaio colorimétrico utilizado para determinar a concentração de proteína em uma determinada amostra, com a sensibilidade variando de 0,5 µg/mL a 1,5 mg/mL. Este ensaio é baseado na detecção de algumas ligações peptídicas entre aminoácidos específicos da seguinte forma:
as ligações peptídicas das proteínas reduzem o Cu2+ presente em um dos reagentes
o ácido bicinconínico liga-se ao cobre reduzido (Cu+), formando uma coloração púrpura que pode ser lida em espectrofotômetro (562 nm).
Curva padrão com albumina bovina (BSA), utilizando a solução de BSA padrão incluída
no kit.
A curva padrão é preparada em eppendorfs, sendo transferido um volume para a
microplaca de 96 poços para quantificação, conforme descrito na tabela abaixo:
	Tubo
	Água (µL)
	BSA Sol (µL)
	Volume usado (µL)*
	[BSA] (µg/mL)
	1
	0
	300 do estoque
	10
	2000
	2
	125
	375 do estoque
	10
	1500
	3
	375
	325 do estoque
	10
	1000
	4
	175
	175 do tubo 2
	10
	750
	5
	325
	325 do tubo 3
	10
	500
	6
	325
	325 do tubo 5
	10
	250
	7
	325
	325 do tubo 6
	10
	125
	8
	400
	0
	10
	0= branco
será coletado para adicionar em cada poço da microplaca
Adicionar 200 µL do mix do reagente de BCA 50:1 (196 µL do reagente A + 4 µL do reagente B).
Incubar 30 min a 37 oC e fazer a leitura em espectrofotômetro (562 nm)
Plotar os dados em Excel e pedir a equação da reta: y = a + bx.
Dica: para uma curva ser considerada boa, o valor de R2 deve ser o mais próximo de 1, sendo satisfatório valores acima de 0,98.
Ensaio:
A uma microplaca de 96 poços adiciona-se 10 µL de amostra e 200 µL do mix do reagente BCA 50:1 (196 µL do reagente A + 4 µL do reagente B).
Dica: preparar o mix do reagente de BCA em um eppendorf ou tubo de ensaio para todas as amostras + um branco. Misturar. Desta forma, a solução será homogênea para todos.
Incubar o ensaio por 30 min a 37 oC
Passado o tempo, realizar a leitura em espectrofotômetro a 562 nm.
Cálculo:
Para leitura em placa de 96 poços: aplicar o valor de absorbância encontrado na equação da reta (para se obter a quantidade de proteína em µg) e multiplicar por 100 (para se obter a quantidade de proteína por mL)
O resultado é a quantidade de proteína de uma determinada amostra em µg/mL.
Referências:
SMITH, P.K., et al. 1985. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry 150:76-85.