Princípios de Centrifugação

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Centrifugação	
  
Biotecnologia	
  
Purificação	
  de	
  moléculas	
  
IBF-­‐020	
  
	
  
Centrifugação 
            
•  Separação de partículas com base em seus tamanhos, formato e 
densidade. 
•  Dependente da viscosidade do meio e da velocidade do rotor. 
 
densidade	
  
Par;cula/molécula	
  	
  
sedimentam	
  
densidade	
   Flutuam	
  
Força	
  centrífuga	
  
•  Acelera	
   a	
   centrifugação	
   pela	
   ação	
   do	
   campo	
  
gravitacional	
  centrífugo!!	
  
	
  
S
ed
im
en
ta
tio
n 
3	
  
Soluble 
protein 
DNA 
RNA 
Centrifugação	
   diferencial	
   para	
   isolamento	
   de	
   frações	
   específicas:	
   organelas,	
  
microvesículas,	
  etc.	
  	
  	
  
Centrifugação 
            
Material Density (g/cm3) 
Microbial cells 1.05 - 1.15 
Mammalian cells 1.04 - 1.10 
Organelles 1.10 - 1.60 
Proteins 1.30 
DNA 1.70 
RNA 2.00 
Princípios da centrifugação 
            F = Mω 2 r 
M: massa da partícula 
r: raio da rotação (cm) (ie 
distância da partícula até o eixo 
da rotação 
ω: velocidade angular média 
(radianos/seg) 
2π rev min-1 
60 
Rev: revolution per minute 
(r.p.m.) 
Quantificação da velocidade             
Vg	
  =	
  d2	
  x	
  (ps-­‐p)	
  g	
  
	
   18µ
Diâmetro	
  da	
  par;cula	
  
Viscosidade	
  do	
  meio	
  
(Densidade	
  da	
  célula	
  –	
  densidade	
  do	
  liquído)	
  
•  Velocidade	
  da	
  sedimentação	
  sob	
  ação	
  da	
  gravidade	
  (g)	
  
•  Na	
   centrifugação:	
   a	
   velocidade	
   da	
   sedimentação	
   sob	
   força	
   motriz/	
   força	
   centrífuga	
   dada	
   a	
  
aplicação	
  da	
  rotação	
  angular	
  
Vc	
  =	
  d	
  (ps-­‐p)	
  ω2r	
  
	
   18µ
•  Auxiliares	
  de	
  sedimentação!!	
  
Adição	
  de	
  eletrolítos	
  ou	
  mudança	
  no	
  pH	
  
agregação	
   Diamêtro	
  da	
  par;cula	
  e	
  da	
  densidade	
  
RCF – força centrífuca relativa 
            
RCF = 1.12 x 10-5 x (rpm)2 x r 
Como	
  os	
  rotores	
  variam	
  de	
  acordo	
  com	
  a	
  empresa,	
  uYlizamos	
  a	
  RCF	
  –	
  Força	
  centrífuga	
  
relaYva	
  para	
  representar	
  a	
  força	
  centrífuga	
  
Exemplo de conversão 
            
Relação Fc x tempo = constante 
            Considere	
  que	
  uma	
  suspensão	
  de	
  bactérias	
  necessita	
  de	
  10	
  minutos	
  de	
  centrifugação,	
  
Fc	
   =	
   4829xg	
   no	
   laboratório	
   em	
   um	
   centrífuga	
   de	
   raio	
   0,1m.	
   Quero	
   ampliar	
   essse	
  
procedimento	
   para	
   a	
   escala	
   industrial,	
   logo	
   quero	
   realizar	
   em	
   uma	
   centrifuga	
   de	
   1	
  
metro	
  de	
  raio	
  na	
  rotação	
  de	
  2000	
  rpm.	
  Quanto	
  tempo	
  demorará	
  o	
  procedimento?	
  	
  
Fcxt	
  =	
  constante	
  	
  
Fc	
  =ω2r	
  
g	
  
	
  ω2	
  	
  =	
  43819,74	
  
Fc	
  =43819,74	
  x	
  1,0	
  
9,8	
  
Fc	
  =4471xg	
  
Fcxt	
  =4471g	
  x	
  t	
  =	
  4829g	
  x	
  10	
  minutos	
  
Tempo	
  =10,8	
  minutos	
  
 2000 2π 
 60 
	
  ω2	
  	
  =	
   rpm 2π 
 60 
2 	
  ω2	
  	
  =	
  
2
Coeficiente de sedimentação 
            
•  Relação	
  quanYtaYva	
  	
  em	
  bqi	
  para	
  descrever	
  o	
  que	
  influencia	
  a	
  taxa	
  de	
  
movimento	
  de	
  uma	
  macromolécula	
  
S	
  é	
  a	
  distância	
  (cm)	
  percorida	
  pela	
  molécula,	
  
durante	
  1	
  segundo,	
  sob	
  o	
  efeito	
  de	
  uma	
  força	
  
de	
   10-­‐2N.kg-­‐1,	
   no	
   solvente	
   água,	
   na	
  
temperatura	
  293K	
  
Significado	
  5sico	
  dessa	
  formula	
  seria:	
  	
  
Coeficiente	
  de	
  fricção	
  da	
  molécula	
  
Par;culas	
  e	
  macromoléculas	
  com	
  diferentes	
  coeficientes	
  de	
  sediemntação	
  
expressos	
  em	
  unidades	
  de	
  Sverberg	
  (S)	
  
•  	
   Os	
   valores	
   do	
   coeficientes	
   S	
   não	
   são	
  
adiYvos!	
  
•  Subunidades	
  dos	
  ribossomos	
  
Tipos de centrífugas 
            
•  	
  Controle	
  de	
  temperatura	
  
•  Presença	
  ou	
  não	
  de	
  vácuo	
  
•  	
  Velocidade	
  máxima	
  de	
  sedimentação	
  
•  	
  Volume	
  da	
  amostra	
  e	
  capacidade	
  dos	
  tubos	
  de	
  centrífuga	
  
Tipos de centrífugas 
            
Microcentrífugas	
  
Centrífuga	
  prepara=va	
  –	
  grande	
  capacidade	
  
Raio	
  pequeno	
  
0,5-­‐1,5	
  cm3	
  =	
  tubos	
  
Máximo	
  10000-­‐15000xg	
  
Valores	
  de	
  raio	
  variáveis	
  
5-­‐250	
  cm3	
  =	
  tubos	
  falcon	
  
Máximo	
  3000-­‐7000xg	
  
Tipos de centrífugas 
            
Ultracentrifugação	
  
Valores	
  de	
  raio	
  variáveis	
  
5-­‐250	
  cm3	
  =	
  tubos	
  específicos	
  
Máximo	
  600000xg	
  
Camêra	
  selada,	
  vácuo	
  e	
  refrigeração	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  resistênca	
  fricional	
  
Vesículas	
  microssomais,	
  ribossomos,	
  vesículas	
  extracelulares	
  
Centrífuga	
  refrigerada–	
  high	
  speed	
  
Valores	
  de	
  raio	
  variáveis	
  
5-­‐250	
  cm3	
  =	
  tubos	
  proprios	
  	
  
Máximo	
  50000xg	
  
Separação	
  de	
  núcleo,	
  mitocôndrias	
  e	
  outras	
  organelas	
  
Extração	
  de	
  macromoléculas:	
  proteínas,	
  ácidos	
  núcleicos	
  
Tipos de rotores de centrífugas 
            
Rotores	
  de	
  ângulos	
  fixos	
  
Curta	
  distância	
  percorrida	
  
Rotores	
  de	
  caçamba	
  
Maior	
  distância	
  percorrida	
  permite	
  melhor	
  
resolução	
  =	
  gradiente	
  de	
  densidade	
  
Centrifugação diferencial 
            
•  Baseada	
  no	
  tamanho	
  da	
  par;cula	
  
•  Preparações	
  parcialmente	
  puras	
  de	
  organelas	
  e	
  macromoléculas	
  
•  	
  Par;culas	
  maiores	
  sedimentam	
  primeiro!	
  
Centrifugação zonal 
            
3	
   proteínas	
   separadas	
   com	
  
base	
   no	
   tamanho,	
   formato	
  
e	
  densidade	
  
•  Rate	
  zonal:	
  gradiente	
  de	
  sacarose	
  =	
  zonas	
  de	
  gradientes	
  separadas	
  ao	
  longo	
  do	
  tubo	
  
•  Migram	
  até	
  o	
  um	
  dado	
  ponto	
  no	
  valor	
  de	
  gradiente	
  do	
  meio	
  	
  
•  Separação/purificação	
  de	
  proteínas	
  e	
  anYcorpos	
  em	
  uma	
  mesma	
  amostra	
  
Centrifugação isopínica 
            
•  Gradiente	
  de	
  densidade	
  do	
  meio	
  
•  Migram	
  até	
  o	
  valor	
  de	
  gradiente	
  do	
  meio	
  com	
  as	
  suas	
  mesmas	
  caracterísYcas	
  
•  Purificação	
  de	
  ácidos	
  núcleicos	
  e	
  de	
  parYculas	
  virais	
  por	
  gardiente	
  de	
  densidade	
  de	
  
CsCl	
  
Densidade	
  
do	
  gradiente	
  
Densidade	
  
do	
  gradiente	
  
Densidade	
  
da	
  par;cula	
  <	
  
<	
  
Gradiente	
  de	
  densidade	
  linear	
  
Centrifugação isopínica 
            
<	
  
hpps://www.youtube.com/watch?v=n-­‐lVxNjfeio	
  
Centrifugação em gradiente de 
densidade 
            
Centrifugação	
  zonal	
   Centrifugação	
  isopínica	
  
Centrifugação	
   Baixa	
   velocidade,	
   interrompida	
   em	
  tempo	
   determinado,	
   não	
   sedimenta	
  
completamente	
  
Taxa	
  de	
  sedimentação	
   Equilíbrio	
  de	
  sedimentação	
  
Sedimenta	
  completamente	
  na	
  posição	
  de	
  
densidadeao	
  do	
  meio	
  
Alta	
  velocidade	
  e	
  longo	
  tempo	
  
Baseia-­‐se	
  na	
  
Aplicação	
   Massas	
  moleculares	
  
Densidades	
  
Densidades