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Transcrição de Aula – Família Enterobacteriaceae 
 
Como eu falei para vocês, a família Enterobacteriaceae é caracterizada por 3 provas bioquímicas: a redução de nitrato a nitrito, a fermentação da glicose, e a ausência de Citocromo oxidase. A citocromo oxidase está ausente porque eles são anaeróbios facultativos, e a utilização de lactose é feita para diferencias gêneros da mesma família. 
Citocromo Oxidase 
Eu falei para vocês que para que a prova do Citocromo oxidase dê positiva, é necessário que haja um tipo específico de Citocromo, que é o Citocromo A3. Esse tipo de Citocromo produz uma Citocromo oxidase específica com poder de oxidação alto, que é justamente a diferença dos outros que são negativos. Não é por ser negativo que o microorganismo não tenha sistema Citocromo. Muitos dos m icroorganismos têm a cadeia de citocromos, mas só aqueles que são Citocromo oxidase positivos na bancada é que tem a cadeia complexa, grande, formado pelo Citocromo A3, que é responsável pela síntese da enzima c apaz de transformar o cloridrato de parafenilenodiamino, incolor, em azul de indofenol, na cor azul. Essa reação é específica entre o reagente e o Citocromo A3. O sistema citocromo está presente em TODOS o s micro-organismo que são aeróbios, então quando eu falo de bactérias gram-negativas não fermentadoras, que não faz parte da família são aeróbias. Elas têm sistema Citocromo? Tem, mas nem todas têm esse Sistema Citocromo complexo, com várias etapas, formado inclusive pela proteína Citocromo A3. Então há uma diferenciação entre as espécies. Por exemplo: Pseudomonas é positivo, Acinetobacter é negativo. Ambas são aeróbias, ambas têm sistema Citocromo, mas Pseudomonas tem o sistema Citocromo mais complexo. Não é por que o teste não deu positivo que você vai dizer que aquele micro-organismo não tem Citocromo. Na família Enterobacteriaceae eu estou tratando de microrganismos que crescem m ais facilmente na presença de oxigênio, por isso que eles são anaeróbios facultativos. O sistema Citocromo dessa família não é um sistema Citocromo complexo, que tem o Citocromo A3, por isso na bancada toda prova para Citocromo oxidase vai ser negativa.
Para realizar essa prova você pode impregnar um Swab c om a solução de Cloreto de parafenilenodiamina à 0,5%. Ele é incolor, e a reação é instantânea, ou seja, no momento que tocar na colônia ele vira para azul marinho, quando positivo, indicando a formação do Azul de Indofenol; se não mudar de cor, significa que a reação é negativa e o swab c ontinua incolor. Essa reação pode ser através de fitas impregnadas com a substância também; o método varia, mas o princípio é o mesmo.
Essa é a reaç ão química que ocorre na redução nitrito à nitrato. Ocorre a formação do Ácido nitroso (íon nitrito) que reage com o Ácido Sulfanílico formando o Ácido Sulfanílico Diazotado, ou seja, com a presença de dois nitrogênios. A ligação entre nitrogênio, seja ela tripla, dupla ou simples, confere a coloração vermelha.
Continuando, o Ácido Sulfanílico Diazotado vai reagir com a α-naftilamina formando um composto que tem uma dupla ligação entre nitrogênios, ou seja, continua vermelho. Na prim eira reação, quando coloca as duas gotinhas do Ácido Sulfanílico, a gente não vê 
a coloração vermelha. Ela acont ece imediatamente, mas a visualização da cor v ermelha só é possível quando colocamos também duas gotinhas de α-naftilamina. Quando a coloração vermelha não aparece depois de adicionado os reagentes, é fei ta a contraprova, colocado o pó de zinco, que vai reduzir o nitrato a nitrito. Isso, no final de tudo, vai dar origem à um composto diferente do que é formado quando a reação é positiva, mas de coloração vermelha também. É por isso que é dito como reação negativa, porquê quem reduziu o nitrato e gerou a cor vermelha foi a adição do Zinco, não a enzima. Se, mesmo com a adição de zinco o meio não ficar vermelho, significa que o m icro-organismo produz sim a enzima respo nsável pela coloração, porém em baixas concentrações. Existem bactérias que não produzem a enzima, e mesmo com a adição de zinco não há a viragem do tubo; isso porquê há o utras enzimas que reduzem tudo até N2 gasoso, que sai do meio, o que deixa claro que esse teste é específico para avaliar a formação do nitrito. Retomando: para saber se a bactéria reduz o nitrato à nitrito, é necessário incubar as bactérias em m eio líquido (caldo) apropriado, ou seja, com fonte de carbono (glicose) e fonte de nitrogênio (NaNO3 ou KNO3). 
 
Fermentação da Lactose 
Agora eu começo a falar da penetração da lactose no interior da célula bacteriana. Para isso é necessário que a bactéria tenha uma permease específica, que é a β-galactosídeo permease, que bombeia a lactose para dentro da célula bacteriana. Quando, no teste, são consideradas fermentadores tardios de lactose, significa dizer que esses micro-organismos têm pouca quantidade dessa permease, e aí é preciso de um tempo maior para que haja essa penetração. Presente no citoplasma, está a enzima β-galactosidase que v ai quebrar a molécula de lactose, que é um dissacarídeo, em glicose e galactose. Dependendo do mic ro-organismo, essas moléculas v ão tom ar vário s rumos. No nosso caso, na fam ília Enterobacteriaceae, ela v ai pegar a v ia de Em bden-Meyerhof-Parnas, que é uma via fermentativa. Isso não quer dizer que se eu est iver trabalhando com Pseudomonas, ela vai deix ar de ut ilizar a lactose. Ela vai deixar entrar, vai quebrar, tudo direitinho, mas vai usar o utra via, uma via oxidativa. Se eu tiver trabalhando com outros micro-organismo diferentes, que fazem o ciclo misto por exemplo, eles vão formar o 6-fosfogluconato a partir de um intermediário metabólico da v ia de Entner-Doudoroff e da via das Pentoses Fosfato, onde todos vão ter que ser fosforilados, isso para que a célula reconheça como uma molécula energética e possa ser internalizada e utilizada como 
fonte de energia. Os L actose-negativos que fazem parte da família Enterobacteriaceae são meio seletivo para Gram-negativos cuja única fonte de carbono é a Lactose. Na com posição desse meio de cultura está o Vermelho neutro, indicador de pH que fica ros a-choque quando há a acidificação do MacConkey pela fermentação da lactose. 
 
Descarboxilases 
As descarboxilases trabalham no sequestro do grupo carboxila. Se vocês prestarem atenção na l isina, quando é removido o grupo carboxila, pela lisina-descarboxilase, é formado o CO2 e um composto diamino que tem caráter alcalino. Ent ão, para cada um dos aminoácidos empregados na prova bioquímica, há uma descarboxilase específica e uma diamina também específica. A lisina vai dar origem à cadaverina através da lisina-descarboxilase, a or nitina vai dar origem à putrescina através da ornitina-descarboxilase, isso sempre com a produção de gás carbônico A arginina é um pouquinho diferente da Ornit ina e da Lisina. No caso da arginina, primeiro vai haver uma hidrólise, removendo um grupamento amino através da argina-dihidrolase, aí ocorre a produção da or nitina e da ornitina forma a putrescina. Como é que a gente sabe que houve a remoção do grupo carboxila? Através de um indicador, o Púrpura de Bromocresol. Se o teste for positivo, significa que o micro-organismotem a descarboxilase, o que levou à form ação da diamina que tem caráter alcalino. No meio para essa prova bioquím ica há como única fo nte de carbono a glicose e como única fonte de nitrogênio o aminoácido específico (Lisina, ornitina ou arginina) e nele você inocula a bactéria. É necessário que você tenha um indicador de pH para saber se houv e ou não a produção das diaminas, que nesse caso é o púrpura de bromoc resol, e uma atmosfera de anaerobiose que é 
promovida pela adição de ó leo mineral o u parafina no t ubo após a inoculação. A ut ilização da glicose vai gerar uma diminuição do pH, o pH neutraliza e alcaliniza à m edida em que as diaminas v ão sendo produzidas a partir da descarboxilação dos aminoácidos. Se o tubo estiver positivo, ele ficará na co r púrpura; se o t ubo est iver negativo, ele es tará na cor amarela. Uma coisa interessante é que es sas descarboxilases têm como pH ótimo o pH ácido, por isso é interessante a bactéria usar primeiro a glicose, baixar o pH, para ela começar a descarboxilação. Mesmo que a bactéria já tenha biossintetizado a enzima, ela só começará a atuar quando o pH ficar bem ácido, m ais ou menos quando a glicose já estiver quase toda consumida. 
Para toda prova bioquímica é necessário que a colônia utilizada est eja isolada e metabolicamente ativa. Se você não tiver as colônias isoladas, cada teste pode dar resultados totalmente diferentes por utilizar colônias de gêneros e espécies diferentes, e no final de tudo, quando for cruzar todos o s testes realizados, não chegar à conclusão alguma. E metabolicamente ativa está relacionada a uma cultura nova, entre 18h e 24h. 
 
Prova do Citrato 
Quando eu falo que uma bactéria assimila lactose, isso pode ser pela v ia oxidativa ou fermentativa. Agora quando eu digo que ferme nta, é por uma v ia anaeróbia, ou anaeróbia facultativa. Então existem diferenças de metabolismo, nem todos que assimilam, fermentam, certo? Quando os pesquisadores começaram a idealizar pesquisas a fim de determinar que determinado organismo assimila determinada fonte de carbono ou de nitrogênio, ele faz o teste com várias fontes de carbono ou de nitrogênio. Numa dessas pesquisas, eles descobriram que na família Enterobacteriaceae, existe um grupo que utiliza citrato de sódio como única fonte de carbono. Então, quando eu falo que as simila o citrato de sódio como única fonte de carbono, vocês têm que entender que jamais vai ter outra fonte de carbono. A gente sabe que o citrato de sódio está no ciclo de Krebs (ciclo oxidativo) e a que o ciclo de Krebs depende de oxigênio. A gente sabe tam bém que esses micro-organismos da Família Enterobacteriaceae são anaeróbios facultativos e é po r isso que alguns deles utilizam citrato de s ódio como única fonte de carbono. Toda fonte de carbono v ai gerar um metabólito intermediário que v ai baixar o pH, ou seja, v ai acidificar o meio. Teoricamente, se eu colocasse única e exclusivamente citrato de sódio como fonte de carbono e semeasse o micro-organismo lá dentro, sem a fonte de nitrogênio para neutralizar (essa fonte, quando utilizada tende a alcalinizar o m eio), era de se esperar que o m icro-organismo assimilasse. Eu colocaria um indicador de pH e ele ir ia aparecer no indicador c om ácido. Nessa prova, o pesquisador juntou o citrato de sódio com ÚNICA fo nte de carbono e o fosfato de amônio como ÚNICA fonte de nitrogênio. O citrato é o sal do ácido cítrico; o ácido cítrico é um ácido fraco, sua acidez fica próxima da neutralidade. O mesmo micro-organismo que utiliza o citrato de sódio como única fonte de carbono, utiliza o fosfato de amônio liberando amônia no m eio. Isso faz com que o fosfato de amônio neutralize o meio, em primeira fase, e na segunda fas e ele continua metabolizando o composto, o que alcaliniza o pH do meio. É por isso que nessa prova bioquímica é utilizado o Azul de bromot imol, porque ele, quando em ambiente neutro, é verde; quando em ambiente ácido, é amarelo; e quando em ambiente alcalino, é azul. Então vamos supor que você esteja com um isolado no meio MacConkey, e vai fazer a prov a do citrato. Se a prova for positiva, o meio v ia ficar azul. Isso quer dizer que ele utiliza o citrato como única fonte de carbono? Sim, mas concomitantemente, os mesmos micro-organismos que ut ilizam o citrato de sódio como única fo nte de c arbono, utilizam o fosfato de amônio como única fonte de nitrogênio. No tubo positivo você v ai o bservar o cresc imento dos microorganismos e vai observar também a coloração do meio, que deverá ser azul. Você nunca vai fazer o meio citrato de sódio com peptonas ou com extrato de leveduras, que são fontes de nitrogênio em outras provas bioquímicas, v ocê sempre vai utilizar na prova do citrato, a lém do citrato de sódio, o fosfato de amônio.
Dentro da Família Enterobacteriaceae, ex istem bactérias que são citrato-positivos ecitrato-negativos. Os c itrato-positivos pertencem à t ribo Klebsielleae e inclui 5 gê neros: 
Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Pantoea. A prova do citrato geralmente é feita em tubo de ensaio tamponado e inclinado. Ele é inclinado para que o oxigênio dissolvido na parte 
média e inferior do t ubo pos sa acelerar o processo de biossíntese da amônia. O microorganismo vai utilizar esse oxigênio na produção de enzim as que v ão degradar o fosfato de amônio, liberando amônia. Na literatura diz que m esmo que o micro-organismo cresça de forma precária você considere como positivo, porque para v irar a co loração é preciso que ele cresça com quantidade e qualidade bioquímica necessário para que haja uma metabolização desse citrato e desse fosfato de amônio que caracterize como uma prova positiva; daí mesmo que você olhe e veja um crescimento bem fraquinho, você coloca como citrato-positivo e uma interrogação. Numa classificação microbiana, ninguém pode se ligar à uma prova bioquímica apenas, é o conjunto das provas bioquímicas que vai nos dar subsídios para a c lassificação. Não é só uma prova do citrato, ou prova da uréase que vai dizer qual é o micro-organismo, é necessário que junte essas provas para que haja a classificação. Porque alguns livros têm ácido pirúvico e out ros têm piruvato? Geralmente quando estão em solução aquosa, a forma ácida não é estável, daí, e m sistemas biológicos, tendem a se ligar com sódio ou potássio e formar o sal, que é a forma mais estável (piruvato).
Urease
Aqui você tem a ureia que é uma diamina do ácido carboxílico. Há a hidrólise, forma-se a amônia e carbonato, e se ligam e formam o carbonato de amônio. Isso faz com que o pH se eleve, sendo demonstrado pela viragem do indicador de pH Vermelho de Fenol, que em pH ácido é amarelo; em pH neutro é laranja; e em pH alc alino é rosa. Existem microorganismo que em 3 horas já mostram uma Ureia positiva, extremamente rápido. O metabolismo proteico, para esse grupo de bactér ias é dependente do oxigênio, por isso o meio ureia é feito inclinado no tubo. Quanto mais inclinado, mas rápida vai ser a metabolização da proteína. Um tubo positivo comum é dado em 24h. Ex iste um grupo que não estána família veja em 24 h o tubo totalmente amarelo, m as veja uma coloração est ranha no pico do meio, você incuba mais um pouco e depois olha. Se virou mais um pouco, considera positivo. 
Produção de gás sulfídrico
Aqui vocês a produção de gás sulfídrico, onde podem ser utilizadas duas fontes para a 
formação do gás s ulfídrico: a cisteína e o tiossulfato de sódio. Se eles utilizam, independentemente da fonte, vão produzir o ácido sulfúrico que precipita pela presença de um metal pesado, formando uma coloração escura.
Indol
Aqui você tem a produção de indol. O triptofano, aminoácido, t em uma cadeia alifática 
e tem um grupamento aromático. Quando acontece a quebra do triptofano, pela enzima 
triptofanase, s erão produzidos o piruvato, que vai para o Ciclo de Krebs; o grupamento amino, que vai para a produção de aminoácidos; e o indol, que é o grupo a romático do triptofano, que não vai ser utilizado pela bactéria. Esse indol, como é menos denso que a água, vai ficar na superfície do tubo. Para visualizar a presença do indol, é preciso usar um reativo, o paradiaminobenzaldeido, mais c onhecido como Reativo de Kovac. Ele reage c om o Indol, dando um composto quinoidal de coloração avermelhada apenas na superfície do tubo. Essa prova bioquímica é vista no meio SIM.
ONPG	
Quando eu falei da fermentação da lactose eu esqueci de falar dessa molécula. Essa 
molécula é denominada por Ortonitrofenilgalactosídeo. Aí, se v ocês pensarem lact ose, vocês têm que fazer um link entre lactose e ONPG. Nas bactérias que são fermentadoras tardias da lactose, geralmente ficamos em dúv ida, porque todas as leituras são feitas com 18-24h, não pode passar disso. Se pudesse passar, não precisaria do ONPG, porque esses micro-organismos que difundem lentamente a permeasse iria parecer como lactose-positiva, mas isso não acontece por conta do tempo de leitura. Quando temos dúvida, é utilizada uma contraprova para es ses micro-organismo l actose-tardios, que é a utilização de uma mo lécula que é semelhante, que pode ser quebrada pela beta-galactosidase, est á no interior da bactéria e vai me dar o composto colorido, que é o que percebemos v isualmente no tes te. A gente usa essa molécula sintética porque essa bactéria tem a galactosídeo-permease, que é mais sensível ao ONPG do que a própria lactose. Então, mesmo que ela tenha pouca permease, ela internaliza o ONPG e esse ONPG vai se encontrar, obviamente, c om a beta-galactosidase, porque já houve uma mensagem para o genoma bacteriano para a biossíntese dessa enzima, ela vai quebrar e vai liberar uma molécula Ortonitrofenil, que é colorida, amarela. Quando é feito esse teste, é preciso criar uma atmosfera de CO2, que é fei ta adicionando o óleo mineral para facilitar a passagem ou a biossíntese das enzimas desses micro-organismos que são tardios. 
Fermentação da glicose
No m etabolismo da glicose, há a fo rmação do piruvato, metabólito intermediário. A partir desse metabólito, o micro-organismo vai escolher entre dois caminhos: ou vai pela v ia do butilenoglicol, o u vai pela via da fermentação ácido-mista. Se for pela via do butilenoglicol, ele vai formar o acetil metil carbinol, também chamado acetoína. A partir dessa acetoína são formados compostos diacetilados que vão se conjugar e reagir com a creatina, c om o α-naftol e com o ox igênio em um ambiente alcalino, proporcionado pe lo KOH 10%. Isso vai formar uma coloração vermelha. Dependendo do genoma bacteriano, ele pode seguir para a outra via, a da fermentação ácido-mista. Ele não faz as duas vias. Ou faz um a ou faz o utra. Tudo depende do genoma. Nessa v ia, o que v ai me mos trar positivo é o Vermelho de Me tila e não o Voges-Proskauer. Isso quer dizer o que? Que o m icro-organismo degradou a glicose, produziu m uitos ácidos, ácidos-mistos (Ácido Acético, Ácido L ático), e esses ácidos baixam o pH do me io para em torno de 4, e isso é visualizado através do indicador Vermelho de Metila. Quando você calcula o meio, o caldo é VM/VP, o u seja, Vermelho de M etila/Voges-Prakauer porque não sabemos qual a via que o micro-organismo vai utilizar. O s seguintes gêneros são VP positivos: espécies de Klebsiella, espécies de Enterobacter, espécies de Hafnia, es pécies de Pantoea, espécies de Serratia.
Reações de Desaminação
As reações de desaminação podem acontecer em qualquer que seja o aminoácido. Se há um aminoácido e o m icro-organismo tem uma desam inase, ele pode quebrar esse aminoácido e pegar o grupamento amônio. Aqui no Brasil utiliza-se muito o teste com Fenilalanina Desam inase. Essa enzima vai provocar uma desaminação, hav endo a form ação de um composto ácido, o ácido fenilpirúvico (se no teste fo r utilizado o t riptofano, o ácido formado é o ácido indolpirúvico). Esse ácido v ai reagir com o cloreto férrico a 10%, que v ai dar uma coloração esverdeada instantaneamente a partir da primeira gota adicionada. O cloreto férrico marca a presença des se ácido produzido. Essa prova é interessante para identificar a tribo Proteae, formada por Proteus, Morganella e Providencia. É feita a técnica de esgotamento em t ubo, ou seja, inoculação em profundidade (picada) e estrias na superfície inclinada.
Prova de motilidade
A téc nica é feita com inoculação em profundidade. Se a bactéria possuir flagelos funcionais, ela vai se mover no sentido das paredes dos tubos, proporcionando uma turvação do meio semissólido apenas na região do mov imento. O cloreto de trifenil t etrazólio auxilia na visualização da motilidade bacteriana por que ele deixa o meio róseo apenas na região onde há atividade celular por ser um indicador ox idante-redutor. Ent ão se houver uma região rósea mais “grossa” do que a da inoculação em profundidade, significa que houve sim uma movimentação daquelas bactérias. 
TSI 
Nesse meio estão presentes os 3 açúcares (lactose, glicose e a sacarose), o ferro, e o Tiossulfato de Sódio. Um pesquisador foi mais inteligente e aboliu a sacarose desse meio porque ela não vai fazer muita diferença, e aí criou-se o m eio de Kligler. Com o Tiossulfato de Sódio a gente consegue ver a formação de Gás Sulfídrico. No m eio SIM a gente t ambém pode ver a fo rmação do Gás Sulfídrico, portanto, nunca poderá haver a formação de Gás Sulfídrico no SIM e não no TSI e vice-versa. Para fazer ambos os t estes você v ai tocar com a Alça em Agulha em uma colônia e fazer a inoculação em ambos os testes, se não puder tocar na mesma colônia, que toque numa c olônia com características iguais, para que você não pegue c olônias diferentes. Você vai procurar nesse meio a formação também de Gás Carbônico a partir da fermentação dos açúcares. No TSI, para a formação do Gás Sulfídrico é necessário que haja um substrato que tenha enxofre na sua com posição, que nesse caso é utilizado o Tios sulfato de Sódio. No TSI também há um indicador de pH, para saber se o meio alcalinizou, ou acidificou, que é o Vermelho de Fenol; quando ácido fica amarelo, quando alcalino fica rosa e quando neutro fica vermelho-tijolo. O ferro que há no meio TSI é para sabermos que houve a produção do Gás Sulfídrico, pois ele é precipitado na forma de sulfeto de ferro (o Gás Sulfídricovai precipitar na presença de um s al de metal pesado). Não ex iste isso de que em cima está a glicose, embaixo está a sacarose e no meio a lactose, porque isso vem tudo misturado. O meio, quando comprado, ele vem em pó com todo o conteúdo misturado, a única coisa a ser feita é a hidratação do pó seguindo as recomendações do fabricante, po rtanto, não tem como um açúcar ficar em cima e outro em baixo, o u qualquer outro composto desse ou de qualquer outro meio. Q uando você for dist ribuir o meio nos tubos, você terá que inclinar o t ubo de modo que a base sem inclinação tenha 2 cm, porque a leitura do TSI é feita através da base e do pico. Se tiv er menos que isso você terá sempre uma reação alcalina/alcalina, po rque você vai ter uma área de contato com oxigênio e isso vai estimular a biossíntese de enzimas que vão degradar a peptona que tem no meio de cultura. Essas peptonas v ão gerar aminas e essas aminas v ão ter caráter alcalino, então elas vão aumentar o pH e o vermelho de fenol no pH alcalino v ai ter a cor rosa. Então, se não t iver a base que serve para leitura do TSI, não v ai ter leitura. A base tem que ser realment e generosa, pois há micro-organismos que alcalinizam tanto a s uperfície que acabam passando para a base do tubo. Então, a inoculação vai s er em profundidade s em encostar no fundo do t ubo, volta na mesma posição para não mas carar a motilidade das bactérias, e faz o zig-zag com a ponta na alça na área inclinada. Então, novamente, a leitura do TSI é feita com a Base e com o Pico, por isso haverá diferentes tipos de leitura conforme o micro-organismo: 
1) Base Ácida/Pico Ácido, c om produção de Gás carbônico e sem produção de Gás Sulfídrico: Escherichia, Klebsiella, Ent erobacter. Eu falei a vocês que o oxigênio pode acelerar a biossíntese de enzimas que degradam as peptonas em aminas que alcalinizam o meio, e nesse c aso a base é ácida e o pico é ácido. Então eu vou pensar que ele produziu muito ácido, muito mesmo, que fez com que a alcalinização promovida pela degradação das peptonas fosse encoberta pela acidificação do m eio promovida pela fermentação da lacto se, sacar ose e glicose como fontes de c arbono. Não é que não haja a degradação das peptonas, o que houve é que no meio há muito mais acidez pela fermentação do que basicidade pela presença de aminas. A leitura é feita com 24 h. Al ém do ácido, é perceptivo a formação de bolhas, que as vezes é tão forte que quebra o meio e parte sobe no tubo de ensaio, ou tira o tampão do tubo. 
2) Base Ácida/Pico Alcalino, com produção de Gás Carbônico e c om produção de Gás Sulfídrico: Salmonella, Proteus, Citrobacter. Nesse caso, o micro-organismo utiliza apenas a glicose, diminuindo a quantidade de ácido produzido a partir da fermentação, e o ácido formado só é visto na região em anaerobiose, onde tem menos o xigênio disponível, ou seja, na base do tubo. Como ele p roduz menos ácido, essa pouc a quantidade não vai ser suficiente para neutralizar o pico que vai ficar alcalino. Nesse caso o tubo fica com duas colorações: em baixo fica amarelo (acidez) e em c ima fica rosa (basicidade). Q uando comparamos o Gás Carbônico produzido nesse tubo em relação com o do tubo anterior, a gente percebe que é bem menos, mas aqui ainda é perceptível um as bolhas no meio de cultura. Com a produção de Gás Sulfídrico, há a reação com o ferro e ele precipita, tornando o meio escuro. Como eu vou saber que a base é ácida, se o meio está todo escuro? Porque o Gás Sulfídrico tem caráter ácido. Nesse tipo, o lugar onde fez as estrias pode ficar enegrecido, mas o pico vai continuar sendo alcalino. 
3) Base Ác ida/Pico Alcalino, com pouquíssima produção de Gás Ca rbônico e sem produção de Gás Sulfídrico: Shigella, Providencia, Serratia, E. coli anaerogênica. 
4) Base Alcalino/Pico Alcalino, c om produção não visível de Gás Carbônico e sem produção de Gás Sulfídrico: Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Xantomonas. Esses micro-organismos não fazem parte da família Enterobacteriaceae não porque não utilizam os substratos presentes no TSI, é porque utilizam de forma diferente. Nesse teste é observada a fermentação e a formação de ácidos a partir da fermentação, porém esses micro-organismos são oxidantes das fontes de carbono. Eles produzem ácidos, porém ácidos fracos, e mesmo que sejam ácidos form ados a partir dos 3 açúcares presentes, a quantidade e a qualidade bioquímica desses ácidos não são suficientes para v irar o meio; eles serão facilmente neutralizados pelas aminas derivadas das peptonas que se difundem pelo meio. Por serem oxidantes, elas não crescem bem no fundo do tubo, por isso o cuidado para não ino cular até o fundo mesmo do tubo, porque aí essas bactérias não crescem. De ssa forma, o tubo inteiro ficará na cor rosa (basicidade). Obtendo-se esse resultado, o analista já sabe que essa bactéria é Gram-negativa não-fermentadora. 
5) Base Ácida/Pico Ácido, com produção de Gás carbônico e com produção de Gás Sulfídrico: Citrobacter freundii. A única espéc ie que tem essas características no TSI. 
 O meio TSI é um meio que conjuga várias provas, analisando utilização de várias fontes de carbono, analisando fonte de enxofre com o bservação do Gás Sulfídrico, e pelo TSI já pode ir separando os micro-organismos. A motilidade já separa a Klebsiella da Enterobacter, por exemplo. Outros testes podem dar iguais e a leitura do TSI v ai lhe dizer com qual micro-organismo você está lidando, então é uma prova muito importante na prática clínica.
Meio Lisina-Ferro-Ágar 
É muito utilizado para identificação de Salmonella e Shigella. Esse meio também é inclinado porque nele contém aminoácido e o metabol ismo proteico é dependente de oxigênio. ELA NÃO FALOU MAIS NADA, NEM EXPLICOU AS INTERPRETAÇÕES.
Reações-chaves que devem ser lembradas:
Reação positiva para sulfeto de Hidrogênio: Edwardsiella tarda, Espécies de Salmonella, Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis.
Reação positiva de Voges-Proskauer: Espécies de Klebsiella, Espécies de Enterobacter, Espécies de Hafnia, Espécies de Pantoea, Espécies de Serratia. 
Reação positiva para a desaminação da fenilalanina: Espécies de Proteus, Espécies de Providencia, Espécies de Morganella.
Reação positiva para a motilidade: Espécies de Shigella, Espécie de Yersinia, Espécies de Proteus, Espécies de Salmonella, etc. 
Se os micro-organismos compartilham de provas idênticas, você vai diferencia-los de acordo com o local de que foi coletado, se urocultura, coprocultura, etc.
Depois de tanta prova bioquímica voc ês ficam pensando em como começar a identificar o micro-organismo. No laboratório vai chegar o espécime, que pode ser um escarro, pode ser uma secreção de ferida, um swab da garganta. E aí vocês farão da seguinte forma: SEMPRE quando você não sabe de nada, v ocê vai fazer o isolamento e concomitantemente você vai fazer uma coloração de Gr am. Nessa coloração de Gram você vai visualizar célula, muco, células epiteliais, mas t ambém células fagocitárias. Então daí vocês v ão s aber se são cocos, se são bacilos, e se são Gram positivos ou Gram Negativos para guiar o pensamento de vocês emrelação aos meios de isolamento. Então primeiro vocês vão fazer o semeio em um meio onde cresce tudo, que é o ágar sangue ou ágar chocolate, dependendo do local que esteja trabalhando. Porque as neisserias crescem melhor no ágar chocolate do que no ágar sangue? O ágar chocolate é feito com hemácias lisadas à 4 5-50 °C (mais do que isso desnatura as proteínas, o s angue c oagula, as bactérias não crescem e botam a culpa nos antibióticos que nem sabe o paciente está tomando) e ex istem mic ro-organismos que não tem hemolisinas suficientes para quebrar as hemácias e utilizar a hemoglobina, que é muito boa para as bactérias por conter proteínas e o ferro que é importantíssimo, principalmente para as bactérias patogênicas na produção de toxinas. Nesses dois meios crescem tudo, inclusive os contaminantes do laboratório, por isso muito cuidado ao fazer os semeios. No ágar chocolate você nunca vai poder fazer a identificação de hemolisinas, que são importantes na identificação dos Streptococcus, justamente por que as hem ácias já estão lisadas. Então, retomando, vocês vão fazer o semeio em um desses m eios para o crescimento geral, e vai fazer também o sem eio em um meio selet ivo para Gram negativo que podem ser EMB, MacConkey ou Hoektoen (fermentação). Se o médico mandar na solicitação do exame a pesquisa de um micro-organismo específico, aí você já parte para as condições que permitem o crescimento daquele micro-organismo, porque você só quer saber se tem daquela bactéria ou não, aí faz um ágar sangue ou cho colate específico para aquele micro-organismo. Voltando, se o micro-organismo crescer nesse meio seletivo para Gram negativo, significa que aquela bactéria é uma Gram negativa, aí na microscopia você observou que eram cocos, por exemplo, você já sabe que é Neisseria, já que é o único coco Gram negativo, mas tem que diferenciar as espécies, e você vai t er uma ideia dependendo da or igem do espécime que você rec ebeu, se é um LCR, ou se é uma secreção vaginal, etc. Isso é um exemplo.
 Viu que a bactéria cresceu em EMB, MacConkey ou Hoektoen, aí você vai em busca dos t estes bioquímicos de identificação bacteriana: TSI, SIM, Citrato, Ureia, Fenilalanina Desaminase, as Desc arboxilases principalmente a lisina que diferencia bem os gêneros (Ela estava sem slide e não lembra se são só es ses, eu acho que não po r que ficou faltando os Nitritos e VP/VM). Com essas provas a gente c onsegue diferenciar bem gêneros e es pécies. Quando você que ir mais adiante dentro de um mesmo gênero e você não tem a espécie ainda, pode fazer as outras descarboxilases (ornitina e arginina). Então, recapitulando, é importante o Gram, é importante você selecionar, porque se tiver muitos micro-organismos, uma população mista você não vai conseguir saber quem é quem, ou vai acontecer de você pegar um contaminante achando que é o patógeno. Quando um paciente está com uma infecção, o que v ai aparecer em maior quantidade é o pat ógeno e não o contaminante. E também tem que prestar atenção para o que for colocar no laudo, e colocar algo que não tem nada a ver com aquela rotina.
Tribo Edwardsielleae, Gênero Edwardsiella, Espécie Edwardsiella tarda
Para o homem ela não é tão im portante como uma Salmonella, Proteus, mas se for uma pessoa que trabalha com animais de sangue frio, ela é importante porquê ele pode estar com uma lesão e a bactéria que é da m icrobiota normal do animal passar para o hom em. O nosso corpo é um poço de substratos, então essa bactéria cresce, coloniza, e tem poder patogênico. Elas têm como característica bioquímica a produção de Gás Sulfídrico não fermenta lactose e é indol positivo. Por não fermentar lactose, você pode isolar no MacConkey e as estrias ficarem iguais às da Salmonella/Shigella, colônias incolores. Aí você já tem a produção de Gás Sulfídrico, vai achando que é Salmonella e semeia no Ágar SS, mas já caracteriza e libera como Salmonella. Isso prejudica o tratamento? Não, pois os medicamentos destinados à Família Enterobacteriaceae eles são próximos, salvo às bactérias multidroga-resistentes, como Klebsiella pneumoniae, E. coli produtora de carbapenemases, mas de uma forma geral não prejudicaria, mas voc ê estaria fazendo um trabalho errado. Por ser indol positivo, você diferenciaria a Edwardsiella da Salmonella, por isso aqueles 6 t ubos de provas bioquímicas são extremamente importantes. Se fizer o Gram, o isolamento e os 6 tubos, vocês fazem miséria, identifica quase tudo! 
Patogenicidade: Infecções do trato gastrintestinal, abscesso e feridas associadas a traumas ou acidentes em ambientes aquáticos. Geralme nte só produzem essas infecções em áreas e organismos imunodeprimidos. 
Se apresentam, no me io com tiossulfato de sódio e sal de metal pesado, em colônias com centro escurecido, indicando a produção de Gás Sulfídrico e sua precipitação. Nesse meio também teri a que ter uma como única fonte de carbono a lactose, para a gente afirmar que ela não fermenta a lactose. 
Tribo Citrobactereae 
É composto pelo gênero Citrobacter e 11 espécies. As espécies associadas às infecções são Citrobacter freundii e Citrobacter koseri. Elas são isoladas de diferentes sítios de infec ções: enquanto o Citrobacter freundii é isolado em t odos o s sítios corpóreos exceto fezes, o Citrobacter koseri é isolado nas fezes, abcessos cerebrais, tratos urinário e respiratório e meningite; ela tem um poder patogênico muito mais exacerbado do que o Citrobacter freundii. O Citrobacter freundii precisa ter um paciente muito imunodeprimido para se instalar e colonizar. O Citrobacter freundii tem como característica bioquímica a produção de Gás Sulfídrico, que o diferencia das outras citrobactérias, e a principal diferença entre Citrobacter e Salmonella é a ausência da lisina desc arboxilase e hidrólise do ONPG, o que significa que são fermentadores tardios de lactose, diferentemente da Salmonella que não tem a β-galactosidase, portanto, não utilizam lactose de maneira nenhuma. 
Tribo Klebsielleae 
Nessa tribo há 5 gêneros: Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, S erratia, Pantoea. O gênero Klebsiella foi descrito pela primeira vez por Edwin Klebs. Uma coisa interessante para quando for fazer a c oleta, é o bservar a cor do escarro: se ele t iver secreções na cor vermelho-tijolo, já fique atento eu po de ser K. p neumoniae, que recebeu es se nome po r t er sido isolado pela primeira vez em indivíduos com pneumonia. Quando isolada, essa espécie aparece como colônias mucoides bem grandes devido aos exopolissacarídeos, mol écula que liga um micro-organismo ao outro produzindo o biofilme. Em indivíduos em antibioticoterapia, essa produção de e xopolissacarídeos é dim inuída, e aí, no isolamento, pode parecer como colô nias menores e bem menos mucoides. A K. pneumoniae é a espécie tipo (? ) por que epidemiologicamente falando, a maior parte dos isolados do gênero Kl ebsiella, é da espécie K. pneumoniae. Elas São encontradas na natureza, e no TGI de humanos e animais, por isso que ela está envolvida no grupo c oliformes. Elas f ermentam lactose, tanto é no que Ágar MacConkey as estrias ficam cor-de-rosa, mas essa fermentação de lactose é uma fermentação comedida, até porque ela não segue a via da produção dos ácidos mistos. 
É importante frisar que nem todas as cepas de Klebsiella são mucoides. Mais importante ai nda é lembrar que o Enterobacter também tem essas características de colônias grandes e mucoides. A diferenciação entre esses dois gênero s pode ser feita através da prova de motilidade. O gênero Enterobacter é positivo para motilidade, diferentemente do gênero Klebsiella. Outras características do g ênero Kl ebsiella: negativo para ornitina descarboxilase, exceto a espécie K. ornithinolytica; indol negativo; lisina descarboxilase po sitiva; e hidrolisam lentamente a ureia. 
A K. pneumoniae est á de 1 a 6 % nos seres humanos normais, nas vias aéreas superiores e no t rato gastrintestinal. É encontrada também em pacientes imunodeprimidos, diabéticos, com doença pulmonar crônica, alcoolismo, e também em doenças agudas como a pneumonia. De 0,5 a 5% pneumonias primárias são devido a Klebsiella pneumoniae que é caracterizada por uma necrose extensa, hemorragia, es carro espesso, m ucoide e de coloração vermelha. A grande maioria das pneumonias primárias são causadas por Str eptococcus pneumoniae e outros micro-organismos. Nas infecções extrapulmonares, são encontradas em meningites, enterites, infecções urinárias e septicemias. De pendendo de onde ela venha, ela pode ter poder patogênico maior ou menor. 
 
 A K. rhrinoscleromatis causa esclerose dos se ios paranasais, infecção da mucosa respiratória (orofaringe, do nariz, e dos seios paranasais), em sinusites. 
A K. oxytoca é a segunda em epidemiologia. Ela está mais voltada para patologias agrárias, pois ela acomete os pés de arroz. Se o paciente é um lavrador que tem contato direto com es se tipo de planta, pode se contaminar e dependendo do estado imunológico, pode se infectar. Tem patologia semelhante a K pneumoniae, é menos frequente e são naturalmente resistentes à ampicilina e carbenicilina. 
A Klebsiella planticola pode acometer seres humanos, mas a frequência é muito baixa. É muito mais relacionada às plantas. Tem perfil semelhante às out ras Klebsiellas, exceto para o indol que pode ser variável conforme a cepa e assimilação de m etahidroxibenzoato e etanolamina. Na França 8,3% das Klebsiellas isoladas são de infecções nosocomiais, e no Japão 18,5% são isoladas de fezes, urina, vias respiratórias, sangue e cateteres.
 A K. ozaenae está associada à rinite atrófic a, infecções purulentas das membranas da mucosa nasal e é encontrada nas fezes e no sangue. 
 A Klebsiella Ornithinolytica foi descrita pela primeira ve z em 1989. Era um grupo dentro K. oxyt oca que descarboxilam a ornitina. Elas são L isina Descarboxilase, Ornitina Descarboxilase e indol positivas, características semelhantes ao Enterobacter. Geralmente são isoladas da garganta, escarro, urina, sangue, pus e fezes e principalmente de alimentos. 
Aí você tem o plasmídeo que codifica beta-lactamase de amplo espectro EBLS, gerando as KPCs. Isso não fica restrito apenas a esse grupo, esse plasmídeo está em outros gêneros, como a E. coli. 
Gênero Enterobacter 
Este grupo possui 16 espécies, sendo 4 não patogênicas para o homem: E. intermedius E. dissolvens, E. nimipressuralis, E. pyrinus. As mais importantes na clínica são E. aer ogenes E. cloaceae. Essas duas espécies aparecem muito nas infecções de vias urinárias. Então quando for feito o exame de urina, em homens, é mais comum. Nas mulheres, é mais comum a infecção por E. coli, devido à prox imidade anatômica entre a vagina e o ânus. Elas também estão associadas às infecções oportunistas em trato respiratório, septicemias e feridas. Bioquimicamente falando, são s emelhantes às Klebsiellas, exceto pela mot ilidade (Kleb siella é negativo para motilidade e Enterobacter é positivo). 
Enterobacter sakazaki é semelhante à E. cloaceae e E. aerogenes, porém possui pigmento amarelo após incubação a 25 °C. Essa b actéria causa me ningite e tem poder patogênico altíssimo. Está envolvida em septicemias e é altamente virulenta. Seu habitat não é o TGI e sim o ambiente. 
Enterobacter gergoviae também es tá envolvida nas infecções uri nárias e d o trato respiratório, sendo isolada de sangue, secreções e urina. Bioquimicamente é semelhante a E. aerogenes e xceto para as provas de descarboxilação de lisina, ornitina, urease positivas e fermentação de ado nitol, inositol, sorbitol negativas. ELA DI SSSE PARA GENTE FAZER UMA TABELA REL ACIONANDO AS PRINCIPAIS BACTÉRIAS E OS SÍTIOS DE INFECÇÃO (URINÁRIO, RESPIRATÓRIO, SEPTICEMIAS, ETC). 
E. cancer ogenus = Enterobacter taylorae é gente etiológico de infecções urinárias, do trato res piratório, osteomielite e tem como característica macroscópica no meio Mac Conkey o centro da colônia púrpuro. 
 São três provas para separar os Enterobacter: des carboxilases, uréase e o pigmento amarelo. Se você se deparar com um TSI alcalino/ácido, sem produção de gás sulfídrico, aí já sabe que não é produtor de gás carbônico. Aí vocês vão fazer a uréase e fica atento na cor. É amarela, aí já é E. sakazaki. A prev alência é de E. aerogenes ou de E. cloaceae. Aí vocês vão fazer as descarboxilases, e notem pela tabela que o perfil é diferente. Só a Ornitina descarboxilase que é positiva para todas essas do quadro. É bem fácil. Se for amarelo: E. sakazaki. Se fo r LDC pos itivo: E. aerogenes ou E. gergoviae. Aí fazendo a uréase, já separa as espécies. Com 3 testes vocês já conseguem distinguir: TSI, LDC e Urease. 
Gênero Pantoea
 Se lembram de quando eu falei da reação Nitrato/Nitrito que a única que não reduzia nitrato à nitrito er a a Pantoea aglomerans. Então, s ó pela redução de nitrato à nitrito, j á desconfia porque no geral pode achar que nem é da família Enterobacteriaceae. Ela é bem rara de aparecer. Entre as características bioquímicas importantes estão a negatividade para todas as descarboxilases, o que já diferencia do Enterobacter. 
Gênero Hafnia 
Pantoea e Hafnia pode aparecer algum dia na vida de vocês, são raras, mas acontece. Hafnia alvei é a única espécie do gênero, sendo anteriormente denominada Enterobacter hafniae. A característica bioquímica mais importante é que não produz ácido a partir de lactose ou sacarose, por isso o TSI é alcalino/ácido. Ele é agente etiológico de gastrenterites agudas, abscessos, infecções urinárias. Algumas cepas possuem um gene eaeA que codifica uma proteína associada à v irulência e a adesão às células epiteliais. Ele adere, coloniza e invade. Para isolar esse micro-organismo, você vai atrás de sangue, porque causa bacterem ia e septicemia. Fezes e ponta de cateter não v ão mostrar nada sobre eles. Então vo cês procurarão em sangue e em LCR t ambém, porque também est á associada à meningite. Ela fo i isolada em associação com E. coli enteropatogênica, ou seja, ela precisa da presença da E. coli enteropatogênica para crescer em meio de cultura. Às vezes, como a E. coli enteropatogênica é muito agressiva, quando faz o semeio, já coloca a culpa da infecção nela, mas não sabe que a Hafnia alvei estava associada a ela, por isso é muito importante o isolamento e to dos os testes bioquímicos.
 
Gênero Serratia 
Têm de dois tipos: Serratiamar cescens e S erratia liquefaciens. Características morfológicas e bioquímicas: possuem três enzimas: lipase, gelatinase, DNAse. Esta característica a separa de Hafnia. No meio MacConkey, se formar co lônias verm elhas, você observa de onde veio a coleta (sangue ou LCR) e desconfia de Serratia marcescens. Voc ê faz todos os outros testes para confirmar, m as v ocê observa a co loração dela. Se ela tiver cor vermelha, você meio que já sabe que é a Serratia marcescens. Se você fez todos os testes e bateu c om o gênero Serratia, a primeira coisa que você v ai fazer é o meio DNAse, que é muito importante na diferenciação de Staphylococcus aureus.
Serratia liquefaciens, além de liquefazer gelatinas, ela t em o utras proteases que degradam ésteres. Tudo o que voc ê colocar, ela t em uma enzima es pecífica para hidrolisar. Fermenta L-arabinose. É formada po r diversas espécies separadas som ente por técnicas de biologia molecular.
Tribo Proteae
 Fazem parte dessa tribo três gêneros: Morganella, Proteus e Providencia. Uma diferença é o gás sulfídrico, outra diferença é o Indol. Pelos 6 tubos já consegue separar cada gênero.
O gênero Proteus possui 4 espécies: Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Proteus penner, Proteus myxofaciens. O Proteus myxofaciens, epidemiologicamente falando é raro e é o único Proteus que não é positivo para Gás Sulfídrico. 
 Diferenças entre o Proteus mirabilis e o Proteus vulgaris:
 P. mirabilis – Isolado de infecções urinárias, Indol-negativo, é sensível à Cefalosporina. 
P. vulgaris – Micro-organismo oportunista, Indol-positivo, é resistente à Cefalosporina. 
Gênero Morganella 
Têm c omo espécie tipo a Morganella morganii. Ela é dividida ainda em 2 subespécies, a M. morganii morganii, incapaz de fermentar trealose; e a M. morganii sibonii capaz de fermentar trealose. Isso na clínica não tem grande importância, 1 porque não se faz trealose em laboratório de análises clínicas e 2 porque essa diferenciação de subespécie não interfere no tratamento. Patogenicidade: Infecções urinárias, feridas, meningites. 
Gênero Providencia 
Esse gênero é composto por 5 espécies: Providencia alcalifaciens, P rovidencia stuartii, Providencia rettgeri, Providencia rustigianii, Providencia heimbache. A Providencia alcalifaciens, como o nome já diz, gosta de ambientes alcalinos. To das desaminam a fenilalanina e somente a P. r ettgeri hidrolisa a ureia, Todas as espécies podem ser recuperadas das fezes, mas só Providencia alcalifaciens pode ser associada a doenças diarreicas. 
Tribo Yersineae 
Participa dessa tribo o gênero Yersinia, c omposto por 3 espécies importantes: Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Yer sinia pseudotuberculosis. A patogenicidade delas, a doença em si, são muito parecidas. A Yersinia pseudotuberculosis traz características muito parecidas com a tuberculose; a Yersinia enterocolitica traz características muito parecidas com as diarreias provocadas pela S almonella, Shigella, Vibrio. No meio MacConkey, por não ser da microbiota intestinal, crescem inibidas, como pequenas colônias, porque no MacConkey tem sais biliares e i nibidores de crescimento de outras bactérias. São cocobacilos. No TSI, deixa o meio amarelo a alaranjado, não tem pico alcalino base ácida, não existe isso, é tudo amarelo com esse alaranjado porque não aci dificam muito o meio. Se você descobrir a origem da espécie, você coloca a 25 °C para o teste de motilidade porque elas não são móveis a 37 °C. Você isola a Y. pestis, que é o agente etiológico da peste bubônica, que é positiva para motilidade a 27 °C.
Enterobacteriaceae, e que são tardios para a m etabolização da ureia, en tão mesmo que voc