MANUAL DE ANÁLISES LABORATORIO LEITE E DERIVADOS

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MANUAL DE ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS
DE LEITE E DERIVADOS 
	
	
PROGRAMA DE AUTOCONTROLE (8)
	Código: PAC - 8 P
	
	
	Pág.:
	
	MANUAL DE ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS E MICROBIOLÓGICAS
	Revisão: 00
	
	Leite e derivados
	Data: 
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NORMAS DE CONDUTA E SEGURANÇA EM LABORATÓRIO DE FÍSICO QUÍMICA
São fundamentais para o trabalho em laboratório: critério, planejamento, conhecimento, calma, atenção;
Use uniforme completo: jaleco, blusa e calça. 
Ao realizar análises com ácidos utilizar luvas e óculos de segurança;
Não comer, beber, ou fumar no laboratório. Evitar o uso de lentes de contato;
Manter coberto quaisquer ferimentos, particularmente nas mãos e rosto;
Leia sempre as instruções recomendadas para cada procedimento analítico e respeite rigorosamente as precauções recomendadas;
Consulte pessoas capacitadas em caso de qualquer acidente, imprevisto, duvida ou anormalidade;
A bancada de trabalho deve ser mantida limpa e organizada;
Não debruçar sobre a as mesas e bancadas de trabalho e manter os utensílios na posição correta, mesmo em repouso;
Ler com atenção o rótulo das substancias a serem usadas e rotular todas as amostras, reagentes, soluções, vidrarias, etc;
Para fazer uma marca temporária, use lápis de marcar vidro ou caneta de retroprojetor, que são mais práticos que os rótulos colados ou feitos com o lápis de ponta de diamante, esses de caráter mais permanente;
Nunca tente identificar substancias pela textura, sabor, ou odor. Sendo perigosos: a degustação, a inalação, a ingestão de droga ou reagentes, o contato com as mãos. Quando for testar uma substancia pelo odor, desloque com a mão para a sua direção os vapores quer se desprendem do frasco, o cuidado de conferir se não se trata de uma substancia tóxica. Aspire devagar;
Nunca pipete com a boca os reagentes químicos;
Mantenha a cabeça e os vestuários afastados de chamas;
Dedique especial atenção a qualquer método que necessite de aquecimento prolongado ou desenvolva grade quantidade de energia;
Qualquer peça de vidro quente deverá ser esfriada a temperatura ambiente;
Não aquecer sistemas completamente fechados para evitar explosões;
Antes de realizara análise de queijo no butirômetro, vista-se com os equipamentos de proteção individual recomentados;
Coloque a rolha no butirômetro firmemente com uma das mãos com a outra introduza o tubo no orifício, tirando a rolha e o tubo em sentidos opostos. Adicione o ácido sulfúrico com muito cuidado. Em caso de derramamentos ao chão, limpe rapidamente com papel toalha e em seguida lave com água potável. Para remover a rolha umedeça o vidro com um pouco de água, e se a borracha estiver presa ao vidro não force, corte-a;
Se uma rolha de vidro esmerilhado aderir ao gargalo do frasco, bata nela levemente contra a superfície de baixo para cima; dependendo da substância um leve aquecimento ao redor do gargalo pode funcionar;
Não devolva sobras de reagentes e soluções ao frasco de origem para não contaminar o seu conteúdo, mesmo sedo recomendado para resíduos de rinçagem. O correto é despejar cuidadosamente, no frasco apropriado aproximadamente a quantidade necessária (com economia) e, em seguida retire o volume desejado;
Ao termino do uso de uma solução ou reagente nunca se esqueça de recolocar a tampa, para evitar a contaminação ou evaporação da substância;
Ao final do trabalho lave todo material utilizado com solução detergente;
Jogue todos os sólidos e pedaços de papel num frasco ou cesta para isso destinado, inclusive fósforos, papel filtro, cacos de vidro, ou qualquer sólido ainda que ligeiramente solúvel;
Dilua soluções residuais com bastante água corrente ao despejá-las na pia. Quando muito corrosivas ou tóxicas essas soluções não devem ser despejadas na mesma, e sim estocadas em recipientes apropriados para posterior recuperação ou eliminação;
Antes de retirar-se do laboratório, verifique se não há torneiras (água ou gás abertas) apague as luzes, desligue os equipamentos, e lave as mãos;
As pisetas devem ser identificadas com substância que contem;
A espátula é recomendada normalmente para quebrar sólidos endurecidos nos frascos, além da coleta de reagentes. O uso de bastão de vidro limita-se a transferência de líquidos e agitação, não sendo recomendado para quebra de reagentes endurecidos;
Ao fazer a medições de ácidos, álcalis e substâncias tóxicas ou corrosivas, usar pipetadores apropriados;
Substâncias tóxicas e voláteis devem ser manipuladas em capela de exaustão de boa triagem ou em local de boa ventilação;
Ao diluir o ácido, adiciona-lo lentamente à água, sobre agitação leve, e nunca ao contrário;
Os extintores de incêndio, caixas de primeiros socorros e deve ser colocado em local visível e de fácil acesso.
ANÁLISES DE RECEPÇÃO DO LEITE
ESPECIFICAÇÃO DE RECEPÇÃO DO LEITE CRU 
	CONTROLE
	LIMITES
	AVALIAÇÃO
	Temperatura
	Máximo de 7°C
	O leite pode não ser recebido
	Alizarol 72 °GL
	Estável
	O leite não é recebido
	Acidez °D
	14 a 18°D
	O leite não é recebido
	Densidade 15/15°C
	1,028 a 1,034
	O leite pode não ser recebido
	EST-Extrato Seco Total
	Mínimo de 11,40% (m/m)
	O leite pode não ser recebido
	ESD- Extrato Seco Desengordurado
	Mínimo de 8,4% (m/m)
	O leite pode não ser recebido
	Redutase
	> 90 minutos
	O leite pode não ser recebido
	Índice Crioscópio
	– 0,530°H a – 0,550°H
	O leite não é recebido
	Proteína
	Mínimo de 2,9 % (m/m)
	O leite pode não ser recebido
	Lactose
	Mínimo de 4,30% (m/m)
	O leite pode não ser recebido
	Gordura
	Mínimo de 3,0% (m/m)
	O leite pode não ser recebido
	Reconstituintes de densidade (sacarose, cloretos e amido)
	Negativo
	O leite não é recebido
	Neutralizantes da acidez (bicarbonato de sódio)
	Negativo
	O leite não é recebido
	Inibidores do crescimento microbiano
	Negativo
	O leite não é recebido
	Resíduos de Antibióticos
	Negativo
	O leite não é recebido
	Cor
	Líquido branco opalescente homogêneo
	O leite pode não ser recebido
	Odor
	Isento de odores estranhos
	O leite pode não ser recebido
ANÁLISES REALIZADAS PELA REDE BRASILEIRA DE LABORATÓRIOS DE CONTROLE DA QUALIDADE DO LEITE (RBQL):
Contagem total de Bactérias (CTB) - Mensal;
Contagem de Células Somáticas (CCS) - Mensal;
Teor de componentes do leite (gordura, ácidos graxos livres, proteína, caseína, lactose, sólidos totais e extrato seco desengordurado) – Mensal;
Nitrogênio Ureico – Mensal;
Crioscopia – Mensal.
COLETA DE AMOSTRAS NO CAMINHÃO TANQUE
Fundamento da análise
Orientar a coleta de amostras de leite cru para a execução das análises de recepção.
Materiais
Agitador de inox;
Concha coletora;
Frascos para acondicionamento da amostra.
Procedimento-diário
Com o auxílio do agitador, agitar o leite de cima para baixo até que fique aparentemente homogêneo. Recolher uma amostra, de cada boca do caminhão, com auxílio da concha coletora e transferi-la para os frascos plásticos.
MÉTODO DE ANÁLISES DE RECEPÇÃO DO LEITE CRU
Temperatura
Imediatamente após a coleta inserir no leite um termômetro digital ou de mercúrio. Esperar até que temperatura estabilize.
Prova do Alizarol
Fundamento da análise
A solução de alizarol é a mistura de álcool e alizarina, sendo este último um indicador de pH.
Neste teste, assim como na prova do álcool, o álcool presente na formulação do alizarol avalia a estabilidade das micelas de caseína. Já a alizarina, estima o pH da amostra através do desenvolvimento da cor amarela/marrom em pH baixo (ácido), e da cor violeta/lilás em pH alto (alcalino).
Materiais
Tubos de ensaio;
Pipetas graduadas;
Solução de alizarol - concentração mínima de 72 °GL.
Procedimento – diário.
Misturar partes iguais (2 mL de leite e 2 mL de alizarol) em um tubo de ensaio;
Agitar e observar o aspecto.
Resultado
Coloração violeta: suspeitade fraude com alcalinos;
Coloração róseo salmão com coagulação: leite suspeito de desequilíbrio salino;
Coloração róseo salmão sem coagulação: leite normal; 
Coloração amarela com coagulação: leite ácido.
Acidez Dornic (°D) 
Objetivo da análise
Avaliar, sob o ponto de vista quantitativo, a acidez da amostra, ou seja, o teor de compostos de caráter ácido. O desenvolvimento da acidez do leite deve-se, principalmente, à degradação da lactose em ácido lático pela ação de microrganismos. O resultado obtido na análise é um indicador das condições de higiene e de refrigeração do leite, desde a ordenha até a chegada da matéria-prima à indústria. 
Fundamento da análise
A análise baseia-se na titulação dos compostos de caráter ácido contra uma solução alcalina de concentração conhecida e um indicador de pH: hidróxido de sódio 0,11 mol/L (solução Dornic) em acidímetro Dornic. A utilização do indicador de pH fenolftaleína determina o término da titulação pela viragem para coloração rósea estável por pelo menos 30 segundos.
Materiais
Acidímetro Dornic;
Pipeta volumétrica de 10 mL;
Erlenmeyer de 125 mL;
Solução Dornic (0,11 mol/L);
Solução alcoólica de fenolftaleína a 1% (m/v).
Procedimento-diário
Transferir 10 mL da amostra para o erlenmeyer de 125 mL;
Adicionar 4 a 5 gotas da solução de fenolftaleína a 1% (m/v);
Titular com solução Dornic até o aparecimento de coloração rósea persistente por aproximadamente 30 segundos.
Resultado
Leitura do volume da solução Dornic é equivalente à acidez da amostra, devendo estar entre 14°D a 18°D.
Densidade 15/15°C
Objetivo: 
Verificar a relação massa (g) / volume (L) do leite. A densidade da amostra, em uma determinada temperatura, é dependente de sua composição centesimal. A análise auxilia na descoberta de fraudes, principalmente pela adição de água.
Fundamento da análise
A imersão de um densímetro de massa constante, o termolactodensímetro, provocará deslocamento de uma quantidade de amostra que será, em massa, igual a do densímetro utilizado e, em volume, proporcional à densidade da amostra. Esse deslocamento fará o líquido alcançar um valor na escala graduada. O instrumento é provido de termômetro, permitindo a leitura simultânea da temperatura.
Materiais
Proveta de 250 mL;
Termolactodensímetro recentemente aferido;
Papel toalha.
Procedimento-diário
Transferir para a proveta, evitando formação de espuma, um volume de leite compatível com o frasco;
Introduzir cuidadosamente o termolactodensímetro e deixar flutuar sem que encoste na parede da proveta; 
Deixar em repouso por uma a dois minutos e fazer a leitura da densidade na parte mais alta do menisco;
Observar a temperatura, e correlacionar temperatura da amostra e valor de densidade na tabela de conversão, para obter a densidade correspondente a 15 °C.
Resultados 
Após a leitura na escala do densímetro, aplicação do fator de correção e conversão para valor a 15°C, quando for o caso, o resultado será expresso como densidade a 15°C em g/mL dividindo-se o valor obtido por 1000.
Observações
Sempre que possível, fazer a leitura da densidade a 15°C;
Não deverão ser feitas leituras de densidade em amostras com temperatura inferior a 10°c ou superior a 20°C;
Em lugar de se utilizar a tabela de correção, pode-se fazer a correção para 15°C acrescentando à leitura 0,0002 para cada grau acima de 15°C ou subtraindo 0,0002 para cada grau abaixo.
EST-Extrato Seco Total - (Disco de Ackermann)
Fundamento da análise
A utilização de instrumento ou fórmulas apropriados permite determinar o teor de extrato seco total e do teor de gordura, por meio dos valores de densidade anteriormente aferidos com o termolactodensímetro.
Materiais
Disco calculador de Ackerman. 
Procedimento
Fazer coincidir as graduações dos círculos interno médio, correspondentes à densidade corrigida e à porcentagem de gordura;
A posição da seta indicará, no círculo externo, a porcentagem (m/m) de extrato seco total.
ESD- Extrato Seco Desengordurado
Obtém-se a porcentagem de extrato seco desengordurado, subtraindo-se da porcentagem de gordura da amostra, conforme a seguinte fórmula, ou pela medição em aparelho Ekomilk.:
%ESD = %EST - % G
Redutase
Fundamento da análise:
Esta prova é baseada na redução do corante azul de metileno, que funciona como receptor de íons H+ resultantes da ação de consumo do oxigênio. O tempo de redução é inversamente proporcional ao número de bactérias redutoras presente na amostra, ou seja, quanto maior a contaminação do leite mais rapidamente a solução irá descolorir.
Materiais
Pipeta volumétrica esterilizada;
Tubo de ensaio esterilizado;
Reagente azul de metileno;
Banho-maria 35°C a 37°C.
Procedimento
Adicionar ao tubo de ensaio 1 mL da solução de azul de metileno e 10 mL da amostra de leite cru. Tampar o tubo, homogeneizar e incubar numa temperatura de 35-37 °C. Realizar a leitura quando o leite estiver descorado. Amostras com tempo de redução menor que 1,5 horas são consideradas em desacordo com a legislação.
Índice Crioscópio
Objetivo da análise 
Avaliar a temperatura de congelamento do leite. Esta temperatura depende da concentração de sólidos solúveis da amostra. O método é útil também para verificar a presença de água no leite ou sólidos adicionados de forma intencional.
Fundamento da análise
O super-congelamento de uma amostra de leite, a uma temperatura apropriada, e a aplicação de uma agitação mecânica ocasionam um rápido aumento da temperatura até um patamar que corresponde ao ponto de congelamento da amostra.
Materiais
Crioscópio eletrônico;
Pipeta graduada de 5 mL;
Tubos de crioscopia;
Soluções padrão para calibração;
Solução anti-congelante.
Procedimento
Seguir rigorosamente as recomendações do fabricante quanto à instalação, à calibração, à operação, à manutenção e as verificações do Crioscópio.
Seguir as instruções para conservação das soluções de verificação e de calibração do equipamento, bem como para a solução refrigerante;
Realizar calibração com os padrões na mesma temperatura das amostras;
Transferir o volume recomendado (usualmente 2,5 mL) da amostra para o tubo de crioscopia e e inseri-lo no aparelho.
Abaixar o cabeçote e aguardar até a informação do PC no display do equipamento.
Limpar cuidadosamente, após cada leitura, o sensor e o agitador, com água e secar delicadamente com papel absorvente fino.
Resultado
Verificar o valor indicado pelo Crioscópio.
Proteínas
Fundamento da análise
Determinar o percentual de proteínas através da medição em aparelho Ekomilk Total.
Materiais
Frasco de leite apropriado para o aparelho Ekomilk;
Aparelho Ekomilk analisador de leite ultrassônico portátil.
Procedimento
Encher o frasco de leite, colocar na posição correta no aparelho e apertar o botão de leitura;
Após 40 segundos, o aparelho disponibilizará automaticamente os dados em tela e impressos.
Lactose
Objetivo da análise
Determinar o percentual de lactose através da medição em aparelho Ekomilk Total.
Materiais
Frasco para leite apropriado ao aparelho Ekomilk;
Aparelho Ekomilk.
Procedimento
Encher o frasco de leite, colocar na posição correta no aparelho e apertar o botão de leitura;
Após 40 segundos, o aparelho disponibilizará automaticamente os dados em tela e impressos.
 pH
Objetivo
Aferir o pH da amostra, para avaliar o grau de fermentação do leite. 
Fundamento da análise
Determinar o pH do leite através da medição em aparelho Ekomilk Total. 
Materiais
Frasco para leite apropriado ao aparelho Ekomilk;
Aparelho Ekomilk.
Procedimento
Encher o frasco de leite, colocar na posição correta no aparelho e apertar o botão de leitura;
Após 40 segundos, o aparelho disponibilizará automaticamente os dados em tela e impressos.
Gordura
Objetivo da análise
Verificar o teor de gordura do leite para o pagamento pela qualidade.
Método do Butirômetro
Fundamento da análise
Baseia-se na separação e quantificação da gordura por meio do tratamento da amostra com ácido sulfúrico e álcool isoamílico. O ácido dissolveas proteínas que se encontram ligada à gordura, diminuindo a viscosidade do meio, aumentando a densidade da fase aquosa e fundindo a gordura, devido à liberação de calor proveniente da reação, o que favorece a separação da gordura pelo extrator (álcool isoamílico). A leitura é feita na escala graduada do butirômetro, após centrifugação e imersão em banho-maria. 
Materiais
Ácido sulfúrico d (20°C) = 1.820 g/L a 1.825 g/L;
Álcool isoamílico d (20°C) = 810 g/L;
Butirômetro de Gerber;
Centrífuga de Gerber;
Pipeta graduada, capacidade 1 mL, ou pipetador automático, especial para o álcool;
Pipeta graduada, capacidade 10 mL, ou pipetador automático, especial para ácido;
Pipeta volumétrica, capacidade 11 mL.
Procedimento-diário
Adicionar a um butirômetro 10 mL da solução de ácido sulfúrico;
Transferir 11 mL de leite (garantir a uniformidade da amostra) para o butirômetro, lentamente e pela parede deste, para evitar sua mistura com o ácido;
Acrescentar 1 mL de álcool isoamílico;
Limpar as bordas do butirômetro com papel de filtro e fechar com rolha apropriada;
Envolver o butirômetro em um pano, colocando o bulbo maior na palma da mão, de forma tal que o dedo polegar exerça pressão sobre a tampa, impedindo sua projeção;
Agitar o butirômetro, de modo a promover a mistura completa dos líquidos no interior do aparelho, tomando precauções para evitar acidentes, e mantendo o polegar sobre a tampa;
Centrifugar durante 5 minutos, de 1.000 a 1.200 rpm, e transferir para banho-maria a 65 °C, por 5 minutos;
 Repetir as operações de centrifugação e de aquecimento.
Resultado 
Método Ekomilk
Objetivo
Verificar o teor de gordura do leite.
Fundamento da análise
Determinar o teor de gordura no leite através da medição direta em aparelho Ekomilk Total. Mede-se a transmitância de luz através de uma suspensão de glóbulos de gordura (depende do número de glóbulos). 
Materiais
Frasco para leite apropriado ao aparelho Ekomilk;
Aparelho Ekomilk.
Procedimento
Encher o frasco de leite, colocar na posição correta no aparelho e apertar o botão de leitura;
Após 40 segundos, o aparelho disponibilizará automaticamente os dados em tela e impressos.
Reconstituintes de densidade (amido, cloretos e açúcar) - Uma linha por semana
Amido
Fundamento da análise
O teste verifica o desenvolvimento de coloração azulada após aquecimento e adição de solução de iodo/iodeto de potássio (lugol) à amostra, em presença de amido. O aquecimento promove a abertura da cadeia helicoidal da molécula do amido, permitindo a adsorção do iodo, com o desenvolvimento da coloração característica.
Materiais
Bico de Bunsen;
Pipeta graduada de 10 mL;
Tubo de ensaio de 50 mL;
Conta-gotas;
Solução de Lugol;
Pinça para tubos de ensaio;
Estante para tubos de ensaio;
Banho-maria.
Procedimento-diário
Transferir 10 mL de leite para o tubo de ensaio;
Aquecer até ebulição em banho-maria e deixar por 5 minutos;
Esfriar em água corrente;
Adicionar 2 gotas de solução de Lugol;
Observar a coloração produzida.
Resultado
Positivo- coloração azul: presença de amido.
Cloretos (sal)
Fundamento da análise
Baseia-se na reação do nitrato de prata com os cloretos, em presença de cromato de potássio como indicador.
Quando o teor de cloretos é normal, a quantidade de nitrato de prata adicionada é excessiva, reagindo com indicador para produção de coloração marrom. Por outro lado, quando o teor de cloretos é elevado, haverá maior consumo de nitrato de prata, diminuindo a intensidade da coloração marrom. A reação deve dissolver-se em pH ajustado.
Materiais
Pipeta graduada de 1 mL;
Pipeta graduada de 5 mL;
Pipeta graduada de 10 mL;
Tubo de ensaio de 20 x 200 mm;
Solução de nitrato de prata 0,1 mol/L;
Solução de cromato de potássio 5% (m/v).
Procedimento
Em tubo de ensaio colocar 10 mL de leite;
Adicionar 0,5 mL de solução de cromato de potássio 5 % e 4,5 mL de solução de nitrato de prata 0,1 mol/L;
Agitar.
Resultado
Positivo - coloração amarelada: presença de cloretos em quantidades superiores à faixa normal;
Coloração tijolo: teor normal de cloretos (0,08 a 0,1%).
Sacarose
Fundamento da análise
A presença de açúcar é detectada pela reação de caramelização deste em meio fortemente ácido. O mecanismo desta reação inicia-se pela desidratação do açúcar redutor provocando a quebra de ligações glicosídicas da sacarose, abertura do anel hemiacetálico, formação de novas ligações glicosídicas. É o hidroximetilfurfural, HMF, precursor da cor. O resultado positivo apresenta coloração avermelhada, o resultado negativo apresenta coloração marrom claro.
Materiais
Tudo de ensaio de 50 mL;
Balança analítica;
Banho-maria;
Becker de 50 mL;
Pipeta graduada 1 mL;
Ácido clorídrico;
Resorcina.
Procedimento
Transferir 15 mL de leite para um tubo de ensaio de 50 mL. Adicionar 1 mL de ácido clorídrico e 0,1 g de resorcina. Agitar e aquecer em banho-maria por 5 minutos. 
Resultado
Positivo: coloração avermelhada.
Negativo: coloração marrom claro.
Neutralizantes da acidez (bicarbonato de sódio e outros alcalinos) – Uma linha por semana
Fundamento da análise
A presença de alcalinizantes na amostra é revelada pela ação do ácido rosólico usado como indicador.
Material
Álcool etílico p.a. neutralizado;
Solução de ácido rosólico (C19H14O3) a 2 % (m/v) em álcool etílico neutralizado;
Pipetas graduadas de 5 e 10 mL;
Tubo de ensaio.
Procedimento
Em tubo de ensaio, colocar 5 mL de leite e adicionar 10 mL de álcool etílico neutralizado, agitar e
adicionar 2 gotas de solução de ácido rosólico a 2 %. Fazer um branco com álcool etílico e solução de
ácido rosólico a 2 % e comparar as cores.
4. Resultado
Positivo: coloração vermelho-carmim
Inibidores do crescimento microbiano – Uma linha por semana
Peróxido de hidrogênio
Fundamento da análise: 
A detecção de peróxido de hidrogênio no leite se dá pela formação de coloração salmão em presença de guaiacol. A enzima peroxidase (natural do leite), degrada o peróxido de hidrogênio, oxidando o indicador a tetraguaiacol, responsável pela coloração característica. O teste apresenta melhor desempenho em amostras de leite cru, pois a enzima encontra-se em sua forma ativa.
Materiais
Guaiacol 1% (v/v) alcoólico;
Tubo de ensaio;
Pipeta graduada, capacidade 1 ml;
Pipeta graduada, capacidade 5 ml;
Suporte para tubos de ensaio.
Procedimento
Misturar no tubo de ensaio 5 ml de leite cru com 0,5 mL de guaiacol 1% (v/v);
Agitar.
Resultado
Coloração salmão: presença de peróxido de hidrogênio.
Formol-Método oficial
Fundamento da análise
O formaldeído aquecido com ácido cromotrópico em presença de ácido sulfúrico, origina um produto de condensação que oxidado posteriormente transforma-se em um composto p-quinoidal de coloração violeta.
Materiais
Banho-maria;
Bico de Bunsen ou placa aquecedora;
Balão de Kjeldahl de 500 mL;
Condensador de Liebig;
Erlenmeyer de 125 mL;
Pipeta graduada de 5 mL;
Provetas de 25 e 200 mL;
Tubo de ensaio de 25 mL;
Ácido fosfórico (H3PO4) p.a.;
Solução de ácido cromotrópico sal dissódico dihidratado (C10H6Na2O8S2.2 H2O) a 0,5 % (m/v) em solução de ácido sulfúrico (H2SO4) a 72 % (v/v);
Tubo de ensaio;
Pipeta graduada, capacidade 1 ml;
Pipeta graduada, capacidade 2 ml;
Suporte para tubos de ensaio;
Bico de Bunsen;
Garra de madeira para tubo de ensaio.
Procedimento
Medir 100 mL de leite homogeneizado e passar para balão de destilação juntamente com
100 a 150 mL de água. Acidificar com 2 mL de ácido fosfórico p.a. Destilar lentamente recolhendo cerca de 50 mL de destilado;
Em tubo de ensaio colocar 5 mL de solução de ácido cromotrópico a 0,5 % e 1 mL de destilado;
Colocar em banho-maria durante 15 minutos;
Agitar e submeter à ebulição.
Resultado
Coloração violácea: presença de formol.
Formol-método não oficial 
Fundamento da análise
Materiais
Tubo de ensaio de 20 mL;
Suporte para tubos;
Banho-maria
Procedimento
Adicionar ao tudo de ensaio 5 mL de leite, 1 mL de percloreto de ferro 2% e 2 mL de ácido sulfúrico 50 %;
Deixar em banho-mariaaté a Ebulição.
Resultado
Positivo: coloração roxa;
Negativo: coloração amarela.
Sanitizantes (cloro e hipocloritos) 
Fundamento da análise 
Fundamenta-se na formação do iodo livre a partir do iodeto de potássio, pela ação do cloro livre ou hipoclorito.
Materiais
Banho-maria;
Pipetas graduadas de 1,0 1 1,5 mL;
Tubo de ensaio de 20 x 200 mm;
Solução de ácido acético (CH3COOH) (1+2) ou solução de ácido cloridríco (HCl) (1+2);
Solução de amido (C6H10O5)n a 1 % (m/v);
Solução de iodeto de potássio (KI) a 7,5 % (m/v).
Procedimento
Em um tubo de ensaio mistura-se 5 mL de leite com 0,5 mL de solução de iodeto de potássio a 7,5% e agita-se. O aparecimento de coloração amarela indica a presença de cloro livre. Se não houver mudança na coloração, pesquisase a presença de hipocloritos adicionando ao mesmo tubo 4 mL de solução de ácido acético ou ácido clorídrico, colocando em banho-maria a 80°C por 10 minutos, e posteriormente esfriando em água corrente. O aparecimento de coloração amarela indica a presença de hipocloritos.
Resíduos de Antibióticos
Objetivo
Twinsensor (Cap-Lab.) é um teste baseado em receptores no formato de tira reativa para detecção rápida e simultânea de antibióticos β-lactâmicos e tetraciclinas em amostras de leite.
Fundamento da análise
Monitoramento rápido de leite: 6 minutos de tempo total (testing time) para a detecção de
β-lactâmicos e tetraciclinas.
Procedimento
Adicionar 200µl de leite no microtubo e misturar até obter uma amostra homogênea;
Incubar 3 minutos a 40ºC;
Submergir a tira reativa no microtubo;
Continuar incubando durante 3 minutos a 40ºC;
Visualizar as linhas coloridas que surgem na tira. 
Resultado
Coloração fraca da fita: positivo;
Sem coloração da fita: muito positivo.
Faixa de atuação
Penincilina 
	Substância 
	Limites de Detecção ppb (µg/L)
	Penicilina G
	3 – 4
	Ampicilina
	3 – 4
	Amoxilina
	3 – 4
	Oxacilina
	12 – 18
	Cloraxilina
	6 – 8
	Dicloxacilina
	6 – 8
	Nafcilina
	30 – 50
Cefalosporinas
	Substância
	Limites de Detecção ppb (µg/L)
	Cefacetrile
	30 – 40
	Cefalexina
	> 750
	Cefapirina
	6 – 8
	Cefalonium
	3 – 5
	Cafazolina
	18 – 22
	Cefaperazone
	3 – 4
	Cefquinome
	20 – 30
	Ceftiofur
	– 15
Tetraciclinas
	Substância 
	Limites de Detecção ppb (µg/L)
	Chlorotetraciclina
	62 – 75
	Doxiciclina
	25 – 50
	Oxitetraciclina
	60 – 80
	Tetraciclinas
	– 100
Cor e odor
Objetivo
Verificar se a cor e odor do leite estão alterados. 
Fundamento da análise
Através da visão e olfato o analista de laboratório verifica a qualidade sensorial do leite cru. 
Resultado
Cor branca opaca e odor suave.
PADRÕES E ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DOS PRODUTOS ACABADOS
Leite pasteurizado integral homogeneizado
Acidez (14 a 18°D):
Objetivo da análise
Avaliar, sob o ponto de vista quantitativo, a acidez da amostra, ou seja, o teor de compostos de caráter ácido. O desenvolvimento da acidez do leite, deve-se, principalmente, à degradação da lactose em ácido lático, pela ação de microrganismos. O resultado obtido na análise é um indicador das condições de higiene e de refrigeração do leite, desde a ordenha até a chegada da matéria-prima à indústria. 
Fundamento da análise
A análise baseia-se na titulação dos compostos de caráter ácido contra uma solução alcalina de concentração conhecida: hidróxido de sódio 0,11 mol/L (solução Dornic) em acidímetro Dornic. A utilização do indicador de pH fenolftaleína determina o término da titulação pela viragem para coloração rósea estável por pelo menos 30 segundos.
Materiais
Acidímetro Dornic;
Pipeta volumétrica de 10 mL;
Erlenmeyer de 125 mL;
Solução Dornic (0,11 mol/L);
Solução alcoólica de fenolftaleína a 1% (m/v);
Procedimento-diário
Transferir 10 mL da amostra para o erlenmeyer de 125 mL;
Adicionar 4 a 5 gotas da solução de fenolftaleína a 1% (m/v);
Titular com solução Dornic até o aparecimento de coloração rósea persistente por aproximadamente 30 segundos;
Resultado
Leitura do volume da solução Dornic é equivalente a acidez da amostra.
pH (6,6), densidade (1028 a 1034), ESD (8,4), EST (mínimo 11,40%), proteína (mínimo 2,9%), lactose () e gordura (mínimo 3,0 %): Ekomilk;
Objetivo
Aferir o pH, densidade, ESD, proteína, lactose e gordura do produto acabado para que os processos estejam padronizados.
Fundamento da análise
Determinar pH, densidade, ESD, proteína, lactose e gordura do produto acabado através da medição em aparelho Ekomilk Total. 
Materiais
Frasco para leite apropriado ao aparelho Ekomilk;
Aparelho Ekomilk.
Procedimento
Encher o frasco de leite, colocar na posição correta no aparelho e apertar o botão de leitura;
Após 40 segundos, o aparelho disponibilizará automaticamente os dados em tela e impressos.
Crioscopia (máximo -0,530): Crioscópio;
Objetivo da análise 
Avaliar a temperatura de congelamento do leite, que depende da concentração de sólidos solúveis da amostra. 
Fundamento da análise
O super congelamento de uma amostra de leite, a uma temperatura apropriada, e a aplicação de uma agitação mecânica ocasionam um rápido aumento da temperatura até um patamar que corresponde ao ponto de congelamento da amostra.
Materiais
Crioscópio eletrônico;
Pipeta graduada de 5 mL;
Tubos de crioscopia;
Soluções padrão para calibração;
Solução anticongelante.
Procedimento
Seguir rigorosamente as recomendações do fabricante quanto à instalação, à calibração, à operação, à manutenção e as verificações do Crioscópio.
Seguir as instruções para conservação das soluções de verificação e de calibração do equipamento, bem como para a solução refrigerante;
Realizar calibração com os padrões na mesma temperatura das amostras;
Transferir o volume recomendado (usualmente 2,5 mL) da amostra para o tubo de crioscopia e e inseri-lo no aparelho.
Abaixar o cabeçote e aguardar até a informação do PC no display do equipamento.
Limpar cuidadosamente, após cada leitura, o sensor e o agitador, com água e secar delicadamente com papel absorvente fino.
Resultado
Verificar o valor indicado pelo Crioscópio.
Gordura (3%): Ekomilk e Butirômetro;
Objetivo da análise
Verificar o teor de gordura do leite para o controle da padronização do processo.
Método do Butirômetro
Fundamento da análise
Baseia-se na separação e quantificação da gordura por meio do tratamento da amostra com ácido sulfúrico e álcool isoamílico. O ácido dissolve as proteínas que se encontram ligada à gordura, diminuindo a viscosidade do meio, aumentando a densidade da fase aquosa e fundindo a gordura, devido à liberação de calor proveniente da reação, o que favorece a separação da gordura pelo extrator (álcool isoamílico). A leitura é feita na escala graduada do butirômetro, após centrifugação e imersão em banho-maria. 
Materiais
Ácido sulfúrico d (20°C) = 1.820 g/L a 1.825 g/L;
Álcool isoamílico d (20°C) = 810 g/L;
Butirômetro de Gerber;
Centrífuga de Gerber;
Pipeta graduada, capacidade 1 mL, ou pipetador automático, especial para o álcool;
Pipeta graduada, capacidade 10 mL, ou pipetador automático, especial para ácido;
Pipeta volumétrica, capacidade 11 mL.
Procedimento
Adicionar a um butirômetro 10 mL da solução de ácido sulfúrico;
Transferir 11 mL de leite (garantir a uniformidade da amostra) para o butirômetro, lentamente e pela parede deste, para evitar sua mistura com o ácido;
Acrescentar 1 mL de álcool isoamílico;
Limpar as bordas do butirômetro com papel de filtro e fechar com rolha apropriada;
Envolver o butirômetro em um pano, colocando o bulbo maior na palma da mão, de forma tal que o dedo polegar exerça pressão sobre a tampa, impedindo sua projeção;
Agitar o butirômetro, de modo a promover a mistura completa dos líquidos no interior do aparelho, tomando precauções para evitar acidentes, e mantendo o polegar sobre a tampa;
Centrifugar durante 5 minutos, de 1.000 a 1.200 rpm, e transferir para banho-maria a 65 °C, por 5 minutos;Repetir as operações de centrifugação e de aquecimento.
Resultado 
Método Ekomilk
Fundamento da análise
Determinar o teor de gordura no leite através da medição direta em aparelho Ekomilk Total. Mede-se a transmitância de luz através de uma suspensão de glóbulos de gordura (depende do número de glóbulos). 
Materiais
Frasco para leite apropriado ao aparelho Ekomilk;
Aparelho Ekomilk.
Procedimento
Encher o frasco de leite, colocar na posição correta no aparelho e apertar o botão de leitura;
Após 40 segundos, o aparelho disponibilizará automaticamente os dados em tela e impressos.
Sabor, odor e cor (suave):
Experimentar e cheirar o produto.
Peroxidase (+):
Objetivo 
Verificar a ocorrência do super aquecimento pela sobrevivência da enzima peroxidase.
Materiais
Tira para reação peroxidase no leite;
Bécker.
Procedimento
Adicionar ao Becker 20 ml de leite e colocar a tira teste;
Aguardar 2 a 3 minutos.
Resultado
Coloração salmão: +
Coloração branca: -
Desenvolvimento de cor amarela: Pasteurização Ineficiente (enzima ativa);
Não desenvolvimento e cor: Pasteurização Eficiente (enzima inativa).
Fosfatase (-)
Objetivo 
Verificar a eficiência da pasteurização pela inativação da enzima fosfatase.
Materiais
Tira para reação fosfatase no leite;
Bécker.
Procedimento
Adicionar ao Becker 20 ml de leite e colocar a tira teste;
Aguardar 2 a 3 minutos.
Resultado
Coloração amarelo: +
Coloração branca: -
Desenvolvimento de cor amarela: Pasteurização Ineficiente (enzima ativa);
Não desenvolvimento e cor: Pasteurização Eficiente (enzima inativa).
Alizarol (estabilidade alizarol 72%)
Fundamento da análise
A solução de alizarol é a mistura de álcool e alizarina, sendo este último um indicador de pH.
Neste teste, assim como na prova do álcool, o álcool presente na formulação do alizarol avalia a estabilidade das micelas de caseína. Já a alizarina, estima o pH da amostra através do desenvolvimento da cor amarela/marrom em pH baixo (ácido), e da cor violeta/lilás em pH alto (alcalino).
Materiais
Tubos de ensaio;
Pipetas graduadas;
Solução de alizarol - concentração mínima de 72 °GL.
Procedimento-diário
Misturar partes iguais (2 mL de leite e 2 mL de alizarol) em um tubo de ensaio;
Agitar e observar o aspecto.
Resultado
Coloração róseo salmão sem coagulação: leite normal; 
Coloração amarela com coagulação: leite ácido.
Shelf life: sabor (suave a ácido), odor (suave a ácido) e cor (branco opaco);
Experimentar o produto.
Leite esterilizado longa vida homogeneizado integral e desnatado
Acidez: 14 a 18°D – idem ao método de análise do leite pasteurizado;
Alizarol (estável ao alizarol 72%): alizarina – idem ao método de análise do leite pasteurizado;
Crioscopia (máximo -0,530): Crioscópio – idem ao método de análise do leite pasteurizado;
Densidade (1028 a 1034), pH (6,60), gordura (mínimo 3,0 % integral e mínimo 0,5 % desnatado), ESD (8,4), proteína (mínimo 2,9%), e lactose: Ekomilk – idem ao método de análise do leite pasteurizado;
Sensoriais: aspecto (líquido), cor (branca), odor e sabor (característicos, sem sabores nem odores estranhos) – idem ao método de análise do leite pasteurizado;
Shelf life: aspecto (líquido), cor (branca), odor e sabor (característicos, sem sabores nem odores estranhos) e acidez – idem ao método de análise do leite pasteurizado.
Bebida láctea achocolatada esterilizada;
Análises sensoriais: consistência (líquida com diferentes graus de viscosidade, segundo sua composição), cor (de acordo com o(s) ingrediente(s) alimentício(s) e/ou corante(s) adicionado(s)), odor e sabor (de acordo com o(s) ingrediente(s) alimentício(s) e/ou substância(s) aromatizante(s)/saborizante (s) adicionados) – idem ao método de análise do leite pasteurizado.
Bebida láctea fermentada sabor coco, morango e salada de frutas;
pH (4,5 a 4,7): pH metro
Fundamento da análise
Verificar o grau de fermentação no produto.
Procedimento
Imergir o pHmetro no produto;
Esperar a estabilização do pH;
Ler o resultado diretamente no aparelho.
Acidez da coalhada (60 a 65°D): titulação com solução Dornic – método de análise idem ao leite pasteurizado;
Shelf life: consistência (líquida com diferentes graus de viscosidade, segundo sua composição), cor (de acordo com o(s) ingrediente(s) alimentício(s) e/ou corante(s) adicionado(s)), odor e sabor (de acordo com o(s) ingrediente(s) alimentício(s) e/ou substância(s) aromatizante(s)/saborizante (s) adicionados) – método de análise idem ao leite pasteurizado.
Queijo Minas Frescal;
Gordura (25,00 a 44,9%): Butirômetro
Objetivo
Verificar o teor de gordura para manter a padronização do produto.
Materiais
Butirômetro de Gerber para queijo;
Balança analítica;
Ácido sulfúrico;
Álcool isoamílico;
Água morna destilada.
Procedimento
Pesar 3 gramas da amostra no recipiente do butirômetro;
Encaixar o recipiente contendo o queijo no butirômetro;
Adicionar 5 mL de água morna destilada;
Tampar o butirômetro e agitar;
Adicionar o ácido sulfúrico na medida do recipiente;
Adicionar o álcool isoamílico na medida do recipiente;
Preencher com água destilada até a última marca do butirômetro;
Colocar na centrifuga;
Centrifugar por 5 minutos;
Fazer a leitura no menisco do butirômetro.
pH (6,3 a 6,6): pHmetro – idem ao método da bebida láctea;
Umidade (> 55%): Medidor IV;
Seguir as instruções do fabricante do aparelho.
Sensoriais: consistência (macia), textura (com ou sem olhaduras mecânicas), cor (esbranquiçada), sabor (suave ou levemente ácido), odor (suave, característico);
Shelf life: consistência (branda, macia, compacta), textura (com ou sem olhaduras mecânicas), cor (esbranquiçada a marelada), sabor (suave ou ácido), odor (suave, característico ou ácido).
Queijo mussarela
Sensoriais: consistência (semi suave a suave), textura (fibrosa, elástica e fechada), cor (branco a amarelado), odor (láctico) e sabor (láctico);
pH (5,0 a 5,3): pHmetro – idem o método da bebida láctea;
Umidade (máximo 60%): medidor UV;
Gordura (mínimo 35,00%): Butirômetro – idem ao método do queijo Minas Fescal;
Shelf life: sabor (suave a levemente ácido), cor (branco a amarelado) e odor (característico).
Demais análises físico-químicas
Correção da salmoura
Teor de sal 
Materiais
Proveta de 250 mL;
Areômetro de Baumè;
Termômetro com escala de 0-100°C, intervalo de graduação de 1°C.
Procedimento
Transferir para a proveta de 250 mL, aproximadamente 250 mL da amostra previamente filtrada em algodão e à temperatura de 20°C, exatamente;
Introduzir cuidadosamente o areômetro de Baumè;
Após estabilização, anotar a leitura em °Bè;
Calcular o percentual (m/v) de cloreto de sódio por meio da fórmula abaixo:
% NaCl = °Bè/0,9
Exemplo: Padrão Ideal: 20 – 25% NaCl
Leitura: 14% NaCl
Deficiência de NaCl: 6%
100 L salmoura ----------------------- 6 kg NaCl
1000 L salmoura ----------------------- X
X= 60 kg NaCl a adicionar
pH
O pH da salmoura deve ser mantido próximo ao valor do pH do queijo. No caso do queijo mussarela, a salmoura o pH deve ser mantido entre 5,2 a 5,5. O ajuste é feito com ácido clorídrico - HCl no caso de salmoura nova e com hidróxido de sódio - NaOH em salmoura usada. Salmoura nova tem o pH alto, podendo ser corrigido com uma solução de ácido clorídrico até pH 5,3 – 5,5. 
Acidez
Materiais
Hidróxido de sódio 1/9 N ou 0,111mol/L (Dornic);
Fenolftaleína 1% (m/v);;
Erlenmeyer de capacidade de 125 mL;
Pipeta volumétrica de capacidade de 10 mL;
Acidímetro Dornic.
Procedimento
Transferir para o erlenmeyer de 125 mL, com auxilio de pipeta volumétrica de 10 mL, 10 mL de salmoura previamente filtrada em algodão;
Adicionar 3 – 5gotas de fenolftaleína 1%;
Titular com solução Dornic até viragem detectável pelo aparecimento e discreta coloração rósea;
Anotar o volume gasto;
Cada 1°D corresponde a 0,01% (m/v) de acidez expressa como ácido lático;
Cada 1°D corresponde a 0,1g de ácido lático;
Acidez Padrão Ideal: 20°D;
Para correção da acidez utiliza-se o Hidróxido de Sódio (NaOH) que apresenta um peso molecularde 40 g e reage mol a mol com o ácido lático, de peso molecular igual a 90g;
Exemplo de cálculo de salmoura 35°D: 35°D – 20°D = 15°D a reduzir em cada litro;
Calculando a quantidade de Ácido Lático em Excesso:
1°D ---------- 0,1g ác. Lático ----------- 1L
15°D ------------------- X ------------------------ 1000 L
X = 1500g de Ác. Lático
Calculando a Quantidade de NaOH a Adicionar:
40g NaOH ----------------- 90g Ác. Lático
 X -------------------- 1500g Ác. Lático
X = 666,66g de NaOH a Adicionar
MANUAL DE ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS DE LEITE E DERIVADOS – LATICÍNIOS EXCELEITE
Referência
Resolução-RDC n° 12, de 02 de janeiro de 2001;
Instrução Normativa n° 62, de 29 de dezembro de 2011;
Normas de conduta em laboratório de microbiologia
As amostras devem ser identificadas antes de serem analisadas;
Amostras de contraprova devem ser mantidas até que se tenham todos os resultados das análises efetuadas. As contraprovas devem ficar armazenadas conforme as condições recomendadas, na embalagem original e inviolada;
Manter as portas e janelas do laboratório fechadas, a fim de evitar correntes de ar;
Trabalhar somente com material esterilizado (vidrarias, utensílios, meios de cultura, diluentes etc.);
Limpar e desinfetar as bancadas antes e após o trabalho com álcool 70%;
O material utilizado nas análises microbiológicas deve ser esterilizado com produto químico, por exemplo cloro a 1% (10 mL em 1 litro), antes da lavagem, especialmente as placas de petri;
Temperaturas de estufas, banhos e geladeiras devem ser controladas diariamente;
A pesagem e o preparo de amostras são pontos críticos de controle do processo analítico, portanto o local deve estar higienizado antes do início da pesagem;
Devem ser realizados controles da contaminação de ambiente, dos diluentes, meios de cultura e vidrarias utilizadas (placas de petri);
O analista deve, antes do inicio dos trabalhos, realizar a assepsia de mãos e antebraços;
O uniforme utilizado na realização das analises microbiológicas deve ser usado exclusivamente na área analítica;
As balanças devem ser calibradas periodicamente, conforme procedimento específico do laboratório;
Operações de pesagem e inoculação devem ser realizadas perto da chama do bico de Bunsen, no caso de uso de bancada, ou em fluxo laminar para tal atividade.
Descontaminação e descarte de resíduos
Material Novo
Toda a vidraria nova deve passar por um tratamento de limpeza, pois podem estar presentes esporos resistentes provenientes do material de embalagem; As vidrarias devem ser mergulhadas em água com sabão, esfregadas e enxaguadas com água corrente e por último água destilada.
Tampas de plástico ou borracha, tubos de roscas ou outros frascos, devem passar por um tratamento para a remoção de resíduos tóxicos: Mergulhar em água destilada, autoclavar a 121°C/15 minutos e enxaguar com água destilada. 
Material Contaminado
Todo o material contaminado, incluindo os meios de cultura onde foi submetido o crescimento microbiano e demais utensílios que tenham entrado em contato com os microrganismos, principalmente os patógenos, devem ser submetidos à esterilização em autoclave a 121 °C por 20 minutos, observando os seguintes cuidados: Afrouxar as tampas de todos os frascos com tampa de rosca; Adicionar água ou solução detergente aos estojos de descarte de pipetas, para amolecer os resíduos e facilitar a posterior remoção; Após passar por este processo de esterilização, os resíduos contidos nas vidrarias ou em outros materiais podem ser descartados.
 Obs.: • Pode-se também proceder a descontaminação dos materiais em estufa à temperatura de 170 – 180 °C por um tempo de 1 - 2 horas. • Porém deve-se levar em consideração o seguinte critério: Nem todos os tipos de materiais podem ser esterilizados em estufa. Vidrarias volumétricas ao serem submetidas ao calor dilatam e podem sofrer alterações significativas nas medidas de volume; Materiais de borrachas, plásticos, etc, não podem ser submetidos à temperaturas muito elevadas por longos períodos. 
Material não contaminado
Materiais utilizados nas análises microbiológicas que não entram em contato com as culturas de microrganismos passam diretamente para a etapa de lavagem, descartando esta etapa de descontaminação.
Lavagem
Remover todo o material contaminado nos frascos e utensílios; 
Mergulhar todo o material em solução detergente e deixar de molho, depende do grau de aderência do material a ser removido. Deve-se fazer um pré lavagem para retirar o excesso de material orgânico nas bacias de lavagem; Os tubos de Durhan devem ser colocados de molho em frascos separados, resistentes ao calor, e submetidos à ação do vapor fluente por 15 minutos para a remoção dos resíduos de meio de cultura. 
Com o auxílio de escovas e esponjas, esfregar os frascos e demais utensílios; 
Enxaguar todo o material em água corrente. Enxaguar em seguida com água destilada, pelo menos uma vez. 
Após a etapa de lavagem, as vidrarias e demais utensílios passam para a etapa de secagem. Esta etapa é geralmente realizada em estufa ou em forno próprio para a secagem de materiais à temperatura de 100 °C por aproximadamente 1 a 2 horas, ou secagem natural.
 
Esterilização de materiais e vidrarias
Todo o material de laboratório vazio (placas, pipetas, tubos de ensaio, frascos, pinças, tesouras, etc) após a etapa de acondicionamento devem ser esterilizados em autoclave (calor úmido) ou estufa (calor seco). 
A esterilização pode ocorrer por agentes físicos (calor, radiações, filtrações) ou químicos (óxido de etileno, beta propiolactona, glutaraldeido, formaldeído e peróxido de hidrogênio).
Para se esterilizar é necessário submeter o material ao calor durante um determinado tempo, destruindo todas as bactérias e seus esporos bem como os vírus e os fungos. As técnicas de esterilização mais utilizadas são:
Calor seco: realizada em estufa de esterilização. O calor atua sobre os microrganismos provocando a oxidação dos constituintes celulares orgânicos e a desnaturação de proteínas. Este tipo de esterilização faz com que o calor penetre nas substâncias de uma forma mais lenta que o calor úmido. E, por isso, exige temperaturas mais elevadas e tempos maiores para que seja eficaz, por exemplo, 170°c/60 minutos ou 120°C/12 horas. Os utensílios e vidrarias devem ser embrulhados em papel alumínio ou papel apropriado antes de esterilizar.
Calor úmido: o processo mais utilizado nesse sistema é a autoclavagem, realizada em equipamento conhecido como autoclave. Também provoca desnaturação das proteínas das células microbianas. A água influencia a destruição das membranas e enzimas pois induz a destruição das ligações de hidrogênio, o que torna esse processo mais eficaz e diminui o tempo de exposição.
A autoclavagem promove a exposição do material ao vapor de água sob pressão a 121°C durante 15 minutos. A eficácia da autoclavagem deverá ser validada. Um dos métodos de validação é o indicador químico que muda de cor consoante à temperatura (por exemplo, fitas de verificação de eficiência de autoclavagem).
Acondicionamento de vidrarias e utensílios
Os materiais com meios de cultura, diluentes e reagentes devem ser preparados, acondicionados e esterilizados seguindo as orientações geralmente contidas nos rótulos de embalagens ou no manual próprio de preparo de reagentes e meios de culturas.
Placas de Petri: devem ser acondicionadas em estojos porta placas de alumínio ou aço inoxidável, em grupos de mesma dimensão, ou embrulhadas em papel Kraft em grupos de até dez placas;
Pipetas: Preencher o bocal com algodão e acondicionar em estojos porta pipetas de alumínio ou aço inoxidável, em grupos de mesmo volume com as pontas para baixo, na extremidade oposta à tampa do estojo. Proteger o fundo dos estojos com um chumaço de algodão ou gaze para evitar danos nas pontas das pipetas. Pode-se também embrulhar as pipetas em grupo em papel Kraft, lembrando-se de identificar a extremidade do embrulho que deve ser abertano momento da análise, e anotar externamente o volume da pipeta;
Tubos de ensaio vazios: tampar com tampão de algodão ou de gaze, ou ainda com as respectivas tampas no caso dos tubos rosqueáveis. Acondicionar em grupos de 4 a 6 tubos de mesmo tamanho e volume, embrulhar com papel Kraft e vedar com fita crepe especial. 
Frascos de homogeneização e outros frascos vazios tampados com tampão de algodão, gaze ou tampa própria: Cobrir a tampa ou o tampão com papel Kraft;
Espátulas, pinças, tesouras e demais utensílios: embrulhar individualmente com papel Kraft, lembrando-se de identificar a extremidade do embrulho que deve ser aberta no momento da análise.
Colheita de amostras
Deve-se proceder a colheita de amostras dos alimentos em suas embalagens originais não violadas, observando a quantidade mínima de 200 g ou 200 mL por unidade amostral. No caso de investigação de Doenças Transmitidas por Alimentos devem ser colhidas as sobras dos alimentos efetivamente consumidos pelo(s) afetado(s). 
No caso de alimentos comercialmente estéreis, cada unidade da amostra indicativa deve ser composta de no mínimo 3 (três) unidades do mesmo lote, para fins analíticos.
As amostras colhidas para fins de análise de controle e fiscal devem atender aos procedimentos administrativos estabelecidos em legislação específica. A amostra deve ser enviada ao laboratório, resfriadas a 4°C, devidamente identificada e em condições adequadas para análise, especificando as seguintes informações: a data, a hora da colheita, a temperatura (quando pertinente) no momento da colheita e transporte, o motivo da colheita, a finalidade e o tipo de análise, as condições da mesma no ponto da colheita e outros dados que possam auxiliar as atividades analíticas.
Diluentes e preparo de diluições
Introdução
Toda solução salina peptonada ou água destilada devem ser acondicionadas em tubos (com 9 mL) e auto clavadas.
Diluição é o procedimento de adição de uma substância a outra para reduzir a concentração de uma das substâncias. 
O uso mais comum da palavra diluição ocorre no sentido de que "tantas partes de um material estão sendo diluídas em um número total de partes do produto final (diluente + material)". "Uma diluição é uma expressão de concentração ou proporção, não de volume". "Diluição indica a quantidade relativa de substâncias em uma solução". Em "frases de diluição", o menor número sempre se refere ao número de partes da substância que está sendo diluída, enquanto que o maior número sempre se refere ao número de partes que constitui a solução final. Exemplo: Frase de Diluição: "Fazer uma diluição 1 para 10 de leite em solução salina peptonada ". Esta frase poderia ser escrita de outras formas, com o mesmo significado: • "Fazer uma diluição 1 em 10, de leite em solução salina peptonada". "Fazer uma diluição 1 para 10, de leite com solução salina peptonada". • "Fazer uma diluição 1/10, de leite com solução salina peptonada". • "Fazer uma diluição 1:10, de leite usando solução salina peptonada". • "Fazer uma diluição de 1 parte de leite e 9 partes de solução salina peptonada".
Diluições decimais e decimais seriadas
Diluições decimais são diluições em que a quantidade de substância a ser diluída corresponde à unidade, ou múltiplos da unidade e o volume final da solução diluída é igual a 10 ou múltiplo de 10 (diluições de base 10). 
Diluições decimais seriadas são diluições decimais preparadas em série e que possuem um fator de diluição único e igual a 10. Exemplo: Preparar diluições decimais de uma cultura bacteriana em fase estacionária até 10-3: a) Preparar uma diluição 1:10 da cultura em fase estacionária em solução salina peptonada, isto é, misturar 1 mL da cultura em fase estacionária com 9 mL de solução salina peptonada (10-1). b) A partir da diluição 1:10 preparada conforme item 1 deste exemplo, após homogeneização em agitador de tubos, tomar 1 mL e misturar com 9 mL de solução salina peptonada, de forma a obter a diluição 1:100 da cultura em fase estacionária (10-2). c) A partir da diluição 1:100 preparada conforme item 2 deste exemplo, após homogeneização em agitador de tubos, tomar 1 mL e misturar com 9 mL de solução salina peptonada, de forma a obter a diluição 1:1000 da cultura em fase estacionária (10-3).
Diluições de alimentos para a realização de análises microbiológicas
Em microbiologia de alimentos, comumente são utilizadas diluições decimais da amostra, adotando-se rotineiramente dois critérios: massa por unidade de volume (m/v) e volume por unidade de volume (v/v). 
Para a obtenção de uma diluição de base 10, homogeneizam-se porções da amostra com volume de diluente necessário para completar o volume correspondente a 10 vezes o volume (ou peso) da amostra. Assim, a diluição 1:10 (10^-1) de uma amostra de leite pasteurizado pode ser obtida homogeneizando: 1 mL de leite + 9 mL de diluente, ou 10 mL de leite + 90 mL de diluente, ou – 20 mL de leite + 180 mL de diluente, ou – 25 mL de leite + 225 mL de diluente, e assim por diante.
Sempre que necessário inocular amostras líquidas sem diluir em meios de cultura, considera-se que a amostra se encontra na diluição 10^0.
 Para produtos sólidos há a necessidade de pesar a amostra. Normalmente utilizam-se alíquotas de 10 ou 25 gramas de alimentos sólidos. Dez ou vinte e cinco gramas de alimento não correspondem necessariamente a 10 ou 25 mL de alimento. O volume vai variar com a densidade e temperatura do alimento em análise. 
Alimentos sólidos, em pó ou pastosos sempre terão que sofrer diluição antes do início da análise, usando-se o critério massa por unidade de volume (m/v). Normalmente a diluição inicial de amostras sólidas, em pó ou pastosas, utilizada para análises microbiológicas é 1:10. Antes do início do procedimento de diluição é fundamental que a amostra seja bem homogeneizada (produtos líquidos em pó e pastosos) ou que a alíquota para análise, obtida de produtos sólidos, seja tomada de vários pontos de forma a representar realmente a amostra. Segue figura demonstrativa:
Diluições a utilizar x intervalo de precisão e repetibilidade
Caberá ao analista estabelecer diluições que possibilitem a contagem de colônias nesses intervalos de precisão. Dessa forma, para alimentos com expectativa de crescimento bacteriano baixo, devido ao seu processo de fabricação e de conservação, as inoculações deverão ser efetuadas a partir da diluição inicial 100 (10^2) para líquidos ou 10-1 para sólidos ou pastosos, com no mínimo, duas diluições sucessivas. Por outro lado, para alimentos que se desconhece o número aproximado de microrganismos existentes, as diluições a serem preparadas deverão garantir condições de realização das contagens. Usualmente, nesses casos, utilizam-se as diluições 10-1 a 10-6.
Preparo dos meios de cultura
Pesar ao redor de uma chama a quantidade do meio de cultura desidratado indicado no rótulo do frasco; 
Medir a quantidade de água destilada indicada no rótulo, em uma proveta;
Em um balão ou Erlenmeyer volumétricos, dissolver o pó em 100 ml de água destilada;
Deixar descansar por 10 min., para que ocorra a hidratação do pó, facilitando a dissolução;
Aquecer o meio, numa chapa aquecedora ou no forno micro-ondas, até que ocorra a total dissolução do meio de cultura;
Esterilizar em autoclave o meio de cultura. Apenas o meio VRB não deverá ser autoclavado;
Efetuar o controle de qualidade dos meios de cultura: colocar as placas de Petri com o meio de cultura em uma estufa à temperatura de acordo com o microrganismo que se quer tirar prova. Após 24hs observar se houve o crescimento de alguma colônia. Se houve é porque ocorreu contaminação desse meio e o mesmo não está esterilizado não podendo ser utilizado – deve-se descartá-lo. Se não houve o crescimento de nenhuma colônia é porque o meio está realmente esterilizado, podendo ser utilizado;
Os meios que passaram no teste de esterilização devem ser armazenados na geladeira para posterior uso.
Contagem de colônias
Recomendações gerais 
Sempre utilizar mais de uma placa, seja umaduplicata da mesma diluição, seja duas ou mais diluições diferentes. As contagens deverão ser realizadas imediatamente após o período de incubação das placas.
Na impossibilidade de realizar a contagem imediatamente após o período de incubação, manter as placas sob refrigeração em temperatura de 4ºC a 7ºC por um período não superior a 24 horas. Esse procedimento não deve tornar-se uma prática rotineira.
Para a contagem, selecionar placas que contenham um número de colônias que se encontre dentro do intervalo de precisão e repetibilidade estabelecido pelo método em uso (por exemplo, 10 a 100, 20 a 200 colônias, 25 a 250 colônias, etc). 
As colônias deverão ser contadas com o auxílio de contador de colônias equipado com placa de vidro ou acrílico, com diâmetro compatível com o das placas utilizadas, dividido milimetricamente em quadrantes com 1 cm2 de área e com iluminação artificial uniforme. O contador de colônias deverá ter capacidade para aumento de 1 a 2 vezes, com dispositivo de regulagem de altura para melhor ajuste do foco, podendo ainda dispor de sistema eletrônico ou manual de registro das contagens. O contador de colônias deverá estar localizado em local onde não haja incidência direta de luz sobre a plataforma de apoio da placa, para evitar possíveis enganos na identificação das colônias. Verificar sempre a proporcionalidade dos resultados obtidos nas diluições sucessivas. 
Regras para cálculos e registros
Expressão de resultados de contagem 
No cálculo das contagens, o resultado final será expresso em UFC/g ou mL, levando-se em conta a diluição empregada, da seguinte maneira: 
R = a x 10^b UFC/g ou mL
R = resultado
a = os dois primeiros algarismos significativos, números de 0 a 9
b = expoente (0 a 10), que é a diluição.
UFC = Unidade Formadora de Colônias
 g = grama e mL= mililitro
Exemplos: 
Diluição 10 -2 (1:100) – Média das contagens: 25 UFC – Resultado: 25 x 100 = 2.500 = 2,5 x 10^3 UFC/g ou mL.
Diluição 10 -3 (1:1.000) – Média das contagens: 38 UFC – Resultado: 38 x 1.000 = 38.000 = 3,8 x 10^4 UFC/g ou mL. O resultado final será expresso considerando-se os dois primeiros algarismos representativos, separados por vírgula. Os algarismos subsequentes, quando existirem, deverão ser arredondados e transformados em potência de 10.
Análises microbiológicas dos produtos Exceleite
Contagem de microrganismos mesófilos aeróbios viáveis capazes de causar alteração em produtos esterilizados (BHI)
Objetivo
Estabelecer procedimento para a contagem de microrganismos mesófilos aeróbios viáveis em produtos esterilizados, com exclusão daqueles comprovadamente não patogênicos e não causadores de alterações físicas, químicas e organolépticas do produto.
Detectar a presença de Bacillus sporothermodurans para diferenciá-lo dos demais microrganismos mesófilos aeróbios viáveis.
Aplica-se a amostras de produtos lácteos líquidos, tratados pelo processo UHT.
Materiais
Equipamentos básicos para laboratório de microbiologia;
Ágar cérebro-coração- BHI;
Solução salina peptonada 0,1%;
Placas de petri esterilizadas;
Pipetador automático ou pipeta volumétrica 1 mL ou 2 mL esterilizadas;
Estufa de incubação a 37 °C;
Erlenmeyer;
Tubos de ensaio;
Espátulas;
Álcool 70%;
Estufa 30°C;
Procedimento
Após a pré-incubação, as amostras visualmente inalteradas devem ser agitadas por 25 vezes;
As amostras que apresentarem qualquer alteração não devem ser analisadas. Reportar o resultado como “amostra alterada”, incluindo informações sobre o tipo de alteração observada;
Lavar as mãos;
Desinfetar a bancada do laboratório com álcool 70 %;
Fazer a assepsia das embalagens;
Ligar o bico de Bunsen;
Abrir a embalagem envolta da chama do bico de Bunsen.
Diluir diretamente 1 mL da amostra previamente incubada;
Adicionar uma camada com cerca de 20 mL de BHI a cada placa de cada diluição;
Homogeneizar as placas em formato de 8;
Deixar solidificar;
Inverter e incubar as placas a 52 ± 1°C por 72 horas.
Resultado
Selecionar placas que contenham entre 25 e 250 colônias para a realização da contagem;
Proceder a contagem das colônias e anotar o resultado em UFC/mL;
Quando o crescimento bacteriano é devido a presença de Bacillus sporothermodurans na amostra em análise, será observado na placa de BHI um abundante crescimento de colônias lisas, de forma regular, com coloração entre branca e bege, com diâmetro de 3 mm, facilmente identificada;
O número de UFC/mL de Bacillus sporothermodurans não deverá ser reportado como resultado da contagem de mesófilos aeróbios;
Quando estes microrganismos forem encontrados, fazer constar do campo “OBS” do Certificado Oficial de Análise (COA): “Presença de Bacillus sporothermodurans”.
Somente será reportado o número de unidades formadoras de colônias de outros mesófilos encontrados.
Contagem de microrganismos aeróbio mesófilos 
Fundamento
 O número de microrganismos aeróbios mesófilos encontrados em um alimento indica deficiências nos procedimentos de higienização, controle de temperaturas do processo, higiene durante a elaboração do produto e transporte inadequado. Os microrganismos mesófilos estão relacionados às alterações organolépticas do produto.
Baseia-se na semeadura da amostra ou de suas diluições em ágar padrão para contagem - PCA seguida de incubação em temperatura de 36 ± 1ºC por 48 horas.
Materiais
Equipamentos básicos para laboratório de microbiologia;
Ágar padrão para contagem (PCA);
Solução salina peptonada 0,1%;
Placas de petri esterilizadas;
Pipetador automático ou pipeta volumétrica 1 mL ou 2 mL esterilizadas;
Estufa de incubação a 37 °C;
Erlenmeyer;
Tubos de ensaio
Espátulas;
Álcool 70%;
Estufa 35°C a 37°C;
Procedimentos
Transferir 1 mL das diluições decimais (até 10^-2) selecionadas para placas de Petri esterilizadas;
Adicionar 20 mL de PCA fundido e resfriado a 43-45°C;
Homogeneizar cuidadosamente com movimentos na forma de 8;
Deixar solidificar;
Após a solidificação incubar as placas a 36°C por 48 horas;
Resultado
Selecionar placas que contenham entre 25 e 250 colônias para a realização da contagem;
Proceder a contagem das colônias e anotar o resultado em UFC/g ou mL;
Contagem de bolores e leveduras
Fundamento
Baseia-se na verificação da capacidade desses microrganismos se desenvolverem em meios de cultura com pH próximo a 3,5 e temperatura de incubação de 25± 1°C. A utilização de meios acidificados a pH 3,5 ± 0,1 promove seletivamente o crescimento de fungos, inibindo a maioria das bactérias presentes no alimento.
Materiais
Equipamentos básicos para laboratório de microbiologia;
Ágar batata glicose 2%(PDA);
Solução salina peptonada 0,1%;
L (+) ácido tartárico 10%;
Placas de petri esterilizadas;
Pipetador automático ou pipeta volumétrica 1 mL ou 2 mL esterilizadas;
Erlenmeyer;
Tubos de ensaio;
Espátulas;
Álcool 70%.
Procedimento
Fundir o ágar batata glicose;
Resfriar em banho-maria até 46-48ºC;
Acidificar o meio até pH 3,5 por meio da adição de 1,5 mL de solução de ácido tartárico 10% para cada 100 mL de meio;
Verter dentro das placas 20 mL do meio;
Deixar solidificar em superfície plana;
Identificar as placas;
Antes da utilização, secar as placas semiabertas com o fundo voltado para cima em estufa a 50ºC por aproximadamente 15 minutos, ou em fluxo laminar expondo a superfície pelo tempo necessário para a completa secagem;
Pesar 25 ± 0,2 g ou pipetar 25 ± 0,2 mL da amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras”, deste Manual.
Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 0,1%. Para amostras de doce de leite e de leite condensado, utilizar como diluente solução salina peptonada com 20% de glicose.
A partir da diluição inicial 10-1, efetuar as diluições desejadas, de acordo com o Anexo;
Inocular 0,1 mL das diluições selecionadas sobre a superfície seca de ágar batata glicose 2% acidificado a pH 3,5;
Com o auxílio de alça de Drigalski ou bastão do tipo “hockey”, espalhar o inóculo cuidadosamente por toda a superfíciedo meio, até sua completa absorção;
Utilizar no mínimo duas diluições decimais ou duplicata da mesma diluição;
Nos casos em que a legislação exigir valores menores que 100 UFC/g ou mL, distribuir em duplicata 1 mL da diluição 10-1 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de produtos líquidos poderá ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra o que corresponderá à diluição 10-1;
Incubar as placas, não invertidas, a 25+-1°C por 5 dias.
Resultado
Selecionar placas com 15 a 150 colônias e efetuar a contagem;
Expressar o resultado em UFC/g ou Ml.
Contagem de coliformes totais e coliformes termotolerantes em alimentos
Objetivos e alcance 
Estabelecer procedimento para a contagem de coliformes totais e coliformes termotolerantes em alimentos.
Aplica-se a amostras de matérias-primas e alimentos devendo ser utilizada quando o limite máximo tolerado for igual ou superior a 100 UFC/g ou mL.
Fundamentos
Prova presuntiva: Baseia-se na inoculação das diluições desejadas das amostras sob teste em ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA) e posterior contagem das colônias suspeitas.
O ágar cristal violeta vermelho neutro bile apresenta em sua composição sais biliares e cristal violeta, responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos e vermelho neutro, um indicador de pH que revela a fermentação da lactose pelos microrganismos presentes.
A adição de sobre camada visa a prevenção do crescimento e do espalhamento de colônias na superfície do ágar.
Prova confirmativa para coliformes totais: A confirmação da presença de coliformes totais é feita por meio da inoculação das colônias suspeitas em caldo verde brilhante bile 2% lactose e posterior incubação a 36 ± 1ºC.
A presença de gás nos tubos de Durhan evidencia a fermentação da lactose presente no meio.
O caldo verde brilhante bile 2% lactose apresenta em sua composição bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante) responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos.
Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: A confirmação da presença de coliformes termotolerantes é feita por meio da inoculação das colônias suspeitas em caldo EC e posterior incubação em temperatura seletiva de 45 ± 0,2ºC/24 h, em banho-maria com agitação ou circulação de água. A presença de gás nos tubos de Durhan evidencia a fermentação da lactose presente no meio.
O caldo EC apresenta em sua composição uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante impedindo a sua acidificação.
A seletividade é devido a presença de sais biliares responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos.
Materiais
Equipamentos básicos para laboratório de microbiologia;
Espátulas;
Vidrarias e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;
Ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA);
Caldo verde brilhante bile 2% lactose;
Caldo EC;
Solução salina peptonada 0,1%.Solução salina peptonada 0,1%;
Etanol 70° GL.
Procedimentos
Prova presuntiva:
Pesar 25 ± 0,2 g da amostra triturada ou pipetar 25 ± 0,2 mL da amostra;
Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 0,1%;
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em “stomacher”.
Esta é a diluição 10-1;
Inocular 1 mL de cada diluição desejada em placas de petri esterilizadas;
Adicionar a cada placa cerca de 15 mL de VRBA previamente fundido e mantido a 46°C a 48°C em banho-maria, aplicar a temperatura de 40 °C;
Homogeneizar cuidadosamente e deixar em repouso até total solidificação do meio;
Adicionar sobre cada placa mais 10 mL de VRBA previamente fundido e mantido a 46°C a 48°C em banho-maria;
Deixar solidificar;
Após completa solidificação do meio, incubar as placas em posição invertida em temperatura de 36°C ± 1°C por 18 a 24 horas;
Selecionar placas que contenham entre 15 a 150 colônias;
Contar as colônias que apresentarem morfologia típica de coliformes, ou seja, colônias róseas, com 0,5 a 2 mm de diâmetro, rodeadas ou não por uma zona de precipitação da bile do meio;
Anotar os resultados da contagem;
Submeter 3 a 5 colônias típicas e atípicas e submeter às provas confirmativas;
Prova confirmativa-Coliformes totais:
Selecionar três a cinco colônias típicas e três a cinco colônias atípicas;
Inocular cada uma das colônias típicas e atípicas selecionadas contendo 10 mL de caldo verde brilhante bile 2 % de lactose;
Incuba os tubos 36°C ± 1°C por 24 a 48 h;
Realizar a leitura verificando a presença de coliformes totais pela formação de gás (mínimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescência quando agitado gentilmente;
Anotar o resultado obtido para cada colônia, bem como a diluição utilizada.
Prova confirmativa-Coliformes termotolerantes
Inocular as colônias suspeitas de coliformes termotolerantes em tubos contendo caldo EC;
Incubar os tubos a 45 ± 0,2°C, por 24 a 48 horas em banho-maria com agitação; 
A presença de coliformes termotolerantes é confirmada pela formação de gás (mínimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescência quando agitado gentilmente;
Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluição utilizada;
Observação: As leituras podem ser feitas após 24 horas de incubação, porém, só serão válidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo deverão ser reincubados por mais 24 horas;
Observação: Para alimentos comercializados no MERCOSUL, os resultados de contagem de coliformes totais se referem à determinação “contagem de coliformes a 35ºC” e os resultados da contagem de coliformes termotolerantes correspondem à determinação “coliformes a 45ºC”.
Análise de Swab – Analisar mensalmente as mãos de todos os manipuladores de alimentos e de equipamentos 
Objetivo
Fundamento
Materiais
Tubos de ensaio contendo 9 mL de solução salina peptonada;
Swabs esterilizados;
Chama;
Álcool 70° GL.
Procedimento
Próximo a uma chama, abrir o invólucro contendo o swab, segurando-o sempre pelo cabo sem tocar a ponta que irá proceder à coleta;
Passar a boca do tubo de ensaio
Umedecer a ponta do mesmo em solução salina peptonada 0,1% e retirar o excesso comprimindo a ponta do swab contra as paredes do frasco ou tubo com movimentos giratórios;
Segurar o swab em ângulo de 30º ao colocá-lo em contato com a superfície a ser amostrada;
Esfregar a ponta do swab lentamente e em toda a área determinada. No caso de mãos de manipuladores, esfregar o swab em toda extensão, inclusive unhas e dedos. Em equipamentos, delimitar, com um molde, uma área de 100 cm²;
Repetir esta operação três vezes invertendo os sentidos que o swab percorre, lavando sempre o swab na solução de rinsagem após cada sentido;
Depois de amostrado, retorne o swab no tubo contendo a solução, quebre o cabo do swab e mantenha-o dentro do tubo com a solução salina peptonada;
Depois de identificado, encaminhe para o laboratório em gelo ou outro agente refrigerante entre 1 a 4ºC, tão logo seja possível, preferentemente dentro de 4 horas. As amostras podem ser mantidas sob refrigeração entre 2 a 8ºC por um período não superior a 24 horas antes do plaqueamento;
O resultado deverá ser expresso em UFC/cm². Para mesófilos aeróbios a legislação (OMS) permite até 50 UFC/cm². Para contagem total de microrganismos viáveis (Comunidade Europeia) <= 10 UFC/cm². Já para coliformes totais não há padrão. 
Padrões microbiológicos
 Padrões microbiológicos dos produtos Exceleite
	Grupo de alimentos
	Microrganismo
	Tolerância para amostra indicativa
	Tolerância para amostra representativa 
	
	
	
	N
	C
	M
	M
	Leite pasteurizado
	Contagem Padrão em Placas PCA (mesófilos totais) (UFC/mL). Diluição 1/10 a 1/10.000
	8,0 x 10^4
	5
	2
	4,0 x 10^4
	8,0 x 10^4
	
	Coliformes, UFC/mL (30/35ºC). Diluição direta
	4
	5
	2
	2
	4
	
	Coliformes, NMP/ mL(45ºC). Diluição 10 mL, 1 mL e 0,1 Ml
	4
	5
	1
	1
	2
	Queijo Minas Frescal e de Coalho
	Coliformes, UFC/g (30/35ºC). Diluição 1/10 e 1/100
	1,0 x 10^3
	
	
	
	
	
	Coliformes a 45ºC/g. Diluição 10 mL
	5 x 10^2 a 5x 10^3
	5
	2
	10^3
	5 x 10^3
	
	Mofos e leveduras. Diluição 1/10 e 1/100
	5 x 10^3
	
	
	
	
	Queijo Mussarela
	Coliformes, UFC/mL (30/35ºC). Diluição 1/10 e 1/100
	5,0 x 10^3
	
	
	
	
	
	Coliformes a 45ºC/g. Diluição 10 mL
	1,0 10^3
	5
	2
	5,0 x 10^2
	10^3
	
	Mofos e leveduras. Diluição 1/10 e 1/100
	1,0 x 10^2
	
	
	
	
	Bebida láctea fermentada com adições
	Coliformes a 45ºC/mL. Diluição 10 mL, 1 mL e 0,1 mL
	4
	5
	2
	< 3
	10
	
	Coliformes/mL a 30/35°C. Diluição direta 
	4
	5
	2
	10
	100
	
	Mofos e leveduras. Diluição 1/10 1/100
	1,0 x 10^2
	
	
	
	Mofos e leveduras. Diluição 1/10 1/100
	Leite e bebida láctea esterilizados
	Após 7 dias de incubação a 35-37ºC, de embalagem fechada: Contagem aeróbios mesófilos (UFC/mL) BHI. Diluição direta
	10
	5
	0 
	100
	Sem alteração (não devem existir sinais de alteração das embalagens, nem quaisquer modificações físicas, químicas ou organolépticas do produto, que evidenciem deterioração).
 
Padrões microbiológicos da salmoura e Swabs de superfícies – realizar mensalmente 
	Grupo
	Microrganismo
	Tolerância para amostra indicativa
	Ação corretiva
	Salmoura
	Contagem Padrão em Placas PCA (mesófilos totais) (UFC/mL). Diluição 1/10 a 1/1000
	1 x 10^5
	Tratar a salmoura, por 18 horas, com solução de hipoclorito de sódio 10% à base de 500 mL/1000 L de salmoura. 
	
	Coliformes NMP/100 mL a 30/35°C. Diluição direta
	5,0 x 10^6
	Pasteurizar a salmoura com injeção direta de vapor em tanque inox. 62°C/30 min.
	
	Mofos e leveduras. Diluição direta e 1/10
	5,0 x 10^3
	Pasteurizar a salmoura com injeção direta de vapor em tanque inox. 62°C/30 min.
	Swabs superfícies
	Coliformes/mL a 30/35°C. Diluição direta
	
	Treinar os colaboradores quanto a forma correta de higienização de mãos e equipamentos.
Equipamentos utilizados em microbiologia 
Estufa de mesófilos- Tª 35 a 37°C;
Estufa de termófilos- Tª 55°C;
Estufa de esterilização Tª 137°C;
Autoclave Vertical;
Contador de colônia;
Bico de Bunsen;
Balança Digital;
Forno micro-ondas.
Garantia do correto funcionamento dos equipamentos – Calibração, registro de temperaturas e aferição de termômetros.
Banho-maria: registrar diariamente a temperatura, cuja tolerância não exceda mais ou menos 2°C. A limpeza deve ser realizada quinzenalmente e a desinfecção é feita utilizando-se solução fungicida na água;
Estufas de incubação: registrar diariamente a temperatura que não deve ultrapassar ao limite de tolerância de mais ou menos 1°C. Utilizar termômetros de mercúrio, anotar pelo menos duas vezes ao dia e verificar se o termômetro está aferido e dentro do prazo de validade;
Termômetros: aferir mensalmente;
Autoclave: verificar a eficiência do processo de esterilização a cada ciclo utilizando fitas apropriadas e, trimestralmente por meio de um controle biológico;
Balança: calibrar anualmente.
EKomil: Calibrar a cada 15 dias. Limpeza com água deionizada sempre que o tempo entre análises for maior que 30 minutos. Limpar diariamente com o a solução EKO DAY e fazer limpeza ácida com solução EKO WEEK e manual semanalmente;
Crioscópio: Calibrar semanalmente. Limpar com água deionizada para que não fiquem resíduos de leite nas agulhas;
pHmetro: Calibrar diariamente e limpar com tioureia e pepsina mensalmente. E limpar com agua deionizada e papel toalha sempre que utilizá-lo nas análises.