COMO INICIAR A VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS

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ENQUALAB-2006 - Congresso e Feira da Qualidade em Metrologia
Rede Metrológica do Estado de São Paulo - REMESP
30de maio a 01de junho de 2006, São Paulo, Brasil
COMO INICIAR A VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS
Andréia de Paula Silva1, Míriam C. Carvalho Alves2
1Laboratório de Ensaios Físico-Químicos em Alimentos, Escola SENAI Mario Amato, São Bernardo do
Campo-SP, Brasil, labalimentos@sp.senai.br
2Environ Científica Ltda., São Bernardo do Campo-SP, Brasil, miriam_coutinho@ig.com.br
Resumo: A validação de métodos analíticos determina o
desempenho característico de um método, partindo-se da
avaliação de parâmetros como exatidão, precisão,
seletividade, linearidade e faixa de trabalho, limites de
detecção e quantificação, variações intra-laboratoriais e
inter-laboratoriais. Este estudo teve como objetivo
demonstrar como avaliar e obter dados preliminares para a
validação de um método titulométrico para determinação de
acidez em água, utilizando-se ensaios de proficiência
baseados nas normas DOQ-CGCRE-008 (INMETRO:
2003), Guia EURACHEM versão Brasileira (QUAM 2002)
e ISO/IEC 17025 (NBR:2001). A validação apresenta
importância fundamental para laboratórios que buscam um
rigoroso programa de Garantia de Qualidade e realizam
periodicamente avaliação de seu desempenho.
Palavras chave: Validação, métodos analíticos.
1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GERAL
Esse trabalho tem por objetivo enfatizar a importância da
validação de métodos análiticos para laboratórios que
desejam a acreditação pelo INMETRO, segundo a norma
NBR ISO/IEC 17025; demonstrando a seqüência de
planejamento e parâmetros necessários à validação.
1.2 OBJETIVO ESPECÍFICO
Exemplificar experimentalmente a avaliação de dados
preliminares para a revalidação de um método titulométrico
de determinação de acidez em água, partindo-se da alteração
de um método normalizado.
2. INTRODUÇÃO
A validação de métodos analíticos comprova através de
evidências objetivas que requisitos para uma determinada
aplicação ou uso específico são atendidos [1]. Pode ser
definida como o processo que confere validade a um método
analítico, instrumento ou equipamento, cujas especificações
são aceitas como corretas, conferindo confiabilidade aos
resultados obtidos. 2,3
Ter validado um resultado significa que o procedimento, que
inclui desde as condições de operação do equipamento até
toda a seqüência analítica, seja aceito como correto. Para
isso, estabelecem-se níveis de exigência que podem definir a
aprovação do produto ou espécie em estudo.
Para tanto, é fundamental que os laboratórios disponham de
meios e critérios objetivos para demonstrar que os métodos
que utilizam conduzem a resultados confiáveis, que
garantam qualidade, idoneidade e credibilidade de seus
produtos e/ou serviços. É importante enfatizar que qualquer
alteração de métodos normalizados implica em revalidar o
método [2].
Ao empregar métodos de ensaios químicos emitidos por
órgão de normalização, organizações reconhecidas na sua
área de atuação ou publicados em livros e/ou periódicos de
grande credibilidade na comunidade científica, o laboratório
precisa demonstrar que tem condições de aplicar de maneira
adequada estes métodos normalizados, dentro das condições
específicas existentes nas suas instalações antes de
implantá-los.
Como os métodos normalizados são métodos validados, não
é necessário realizar o processo completo de validação,
desde que não ocorram alterações significativas dos
mesmos. Entretanto, a conformidade dos métodos
normalizados utilizados deve ser verificada sob condições
reais de uso. É responsabilidade do laboratório verificar se
as características de desempenho prescritas no método
oficial podem ser obtidas.
A validação deve ser efetuada após seleção,
desenvolvimento, e otimização dos métodos. O
procedimento operacional padrão deve ser claro, objetivo e
completo de acordo com a norma ISO 78 -2, e aprovado,
autorizado e revisado pelo grupo de garantia da qualidade da
empresa.
A documentação da validação deve conter ainda,
especificação dos requisitos, características de desempenho
obtidas, critérios de aceitação dos valores obtidos das
características de desempenho em comparação com os
requisitos, e a afirmação da validade dos resultados quanto
ao atendimento das necessidades do problema analítico.
O uso de testes estatísticos adequados (t de Student, Fisher,
Cochran, Grubbs, ANOVA, testes de hipóteses) torna as
decisões menos subjetivas o que faz com que o processo de
validação de métodos analíticos seja mais objetivo, mais
fácil de demonstrar e implementar. 4
9
O planejamento e a execução da validação seguem a
seqüência de trabalho abaixo:
• Definir a aplicação, objetivo e escopo do método;
• Definir os parâmetros de desempenho e critérios de
aceitação;
• Desenvolver um procedimento operacional para validação;
• Definir os experimentos de validação;
• Verificar se as características de desempenho do
equipamento estão compatíveis com o exigido pelo método
em estudo;
• Qualificar os materiais, por exemplo, padrões e reagentes;
• Executar os experimentos preliminares de validação;
• Ajustar os parâmetros do método e/ou critérios de
aceitação, se necessário;
• Executar experimentos completos de validação;
• Preparar um procedimento operacional para execução do
método, na rotina;
• Definir critérios de revalidação (por exemplo, mudanças de
pessoal, condições ambientais, equipamentos, periodicidade,
etc), e
• Definir tipo e freqüência de verificações de controle da
qualidade analítica para a rotina [1-2].
3. PRINCÍPIOS DA VALIDAÇÃO DE MÉTODOS
ANALÍTICOS
Uma forte infra-estrutura internacional de medições está
sendo implementada, para isso há necessidade progressiva
de dados analíticos comparáveis e consistentes, para a
eliminação de barreiras técnicas entre os países. Para atingir
este processo de reconhecimento mútuo em nível
internacional devem ser observados requisitos legais, de
certificação e de acreditação, ou seja, uma vez efetuada a
medição esta é aceita em qualquer país.
As normas internacionais (ISO, USP, FDA, AOAC, NATA,
ASTM) e sistemas da qualidade (Boas práticas de
laboratório; ISO/IEC 17025) requerem a validação de
métodos analíticos e a documentação do trabalho de
validação, para a obtenção de resultados confiáveis e
adequados ao uso pretendido. Portanto existem fortes
razões, legais, técnicas e comerciais, que justificam a
validação de métodos analíticos.
Os métodos analíticos usados para avaliação da qualidade de
produtos, tais como, farmacêuticos, alimentícios,
cosméticos, agro-químicos, estão sujeitos a vários requisitos
legais e normativos. Segundo requisitos da norma 21 CFR
211.194 (a) (2), os métodos de ensaios usados para avaliar a
conformidade destes produtos com especificações
estabelecidas devem atingir padrões adequados de exatidão,
precisão e confiabilidade.
A norma NBR ISO/IEC 17025 especifica o requisito técnico
- "Validação de métodos analíticos". A farmacopéia
americana USP 24 (Seção de Ensaios Gerais <1225>)
apresenta sugestões para a validação de métodos analíticos
oficiais. Apresenta também um sumário das características
de desempenho requeridas para os vários tipos de métodos
de ensaios.
Sendo assim os métodos normalizados são aqueles
desenvolvidos por um organismo de normalização ou outras
organizações, cujos métodos são aceitos pelo setor técnico
em questão,e método não normalizado é aquele
desenvolvido pelo próprio laboratório ou outras partes, ou
adaptado a partir de métodos normalizados e validados [3-
4].
4. DOCUMENTAÇÃO DE MÉTODOS VALIDADOS
Uma vez cumpridas todas as etapas do processo de
validação, é importante documentar os procedimentos de
forma que o método possa ser implementado de maneira
clara e sem ambigüidades. A documentação apropriada
auxilia na aplicação consistente do método, já que, uma vez
implantadoo método, ele será sempre executado conforme
descrito; caso contrário o desempenho real do método não
irá corresponder àquele previsto nos dados de validação.
Documentações que registrem etapas da validação são
necessárias também para fins de avaliação e podem ser
exigidas por razões contratuais ou até mesmo por
organismos regulamentadores.
A sistemática de controle de documentos do laboratório
deve permitir a retirada de circulação dos documentos
obsoletos e emissão de métodos revisados. As alterações
devem ser realizadas somente por pessoas autorizadas. A
Norma NBR ISO/IEC 17025 estabelece requisitos para o
controle de documentos[2-3].
5. PARAMETROS DE VALIDAÇÃO [1-3-5]
Para validar um método faz-se necessária a aplicação dos
parâmetros: Especificidade e Seletividade; Faixa de trabalho
e Faixa linear de trabalho; Linearidade; Sensibilidade;
Limite de detecção; Limite de quantificação; Exatidão e
tendência (bias); Precisão; Robustez; Incerteza de medição.
5.1 Especificidade e Seletividade
É a capacidade que o método possui de medir exatamente
um composto específico independente da matriz da amostra
e de suas impurezas. Para análise qualitativa (teste de
identificação) é necessário demonstrar a capacidade de
seleção do método entre compostos com estruturas
relacionadas que podem estar presentes. Isto deve ser
confirmado pela obtenção de resultados positivos em
amostras contendo o analito, comparativamente com
resultados negativos obtidos com amostras que não contém
o analito, contendo estruturas semelhantes.
A especificidade e a seletividade estão relacionadas ao
evento da detecção. A especificidade refere-se a um método
específico para um único analito e a seletividade refere-se a
um método utilizado para vários analitos com capacidade de
distinção entre eles.
10
5.1.1 Testes de Especificidade
Os testes de especificidade têm como objetivo determinar os
componentes que precisam ser analisados na amostra, para
isso, é necessário definir a matriz, assim com os possíveis
interferentes.
Para análise quantitativa (teor) e análise de impurezas, a
especificidade pode ser determinada pela comparação dos
resultados obtidos de amostras contaminadas com
quantidades apropriadas de impurezas ou amostras não
contaminadas, para demonstrar que o resultado do teste não
é afetado por esses materiais.
5.1.2 Testes de Seletividade
A matriz da amostra pode conter componentes que
interferem no desempenho da medição pelo detector
selecionado, sem causar um sinal visível no teste de
especificidade. Os interferentes podem aumentar ou reduzir
o sinal, e a magnitude do efeito também pode depender da
concentração.
Para fazer o teste de seletividade podem ser utilizados
diversos testes, depende da disponibilidade do analito, da
matriz sem o analito e de amostras de referência nas
concentrações de interesse. Podem ser aplicados os teste F
(Snedecor) de homogeneidade de variâncias e o teste t
(Student) de comparação de médias.
De início, parte-se da hipótese em que a matriz não afeta o
sinal do analito em níveis de concentração elevados ou
acima da faixa. Preparam-se dois grupos de amostras de
teste, um com a matriz e o outro sem a matriz, ambos os
grupos com a concentração do analito idêntica em cada nível
de concentração de interesse.
O número de amostras paralelas em cada nível de
concentração deve ser maior ou igual a 7 (sete) para permitir
o uso adequado dos modelos estatísticos e proporcionar uma
comparação válida.
Com os valores obtidos nos dois grupos de amostras calcula-
se o teste F e compara-se o valor do teste F com o valor do
teste F tabelado. Se o valor do teste F calculado for menor
que o valor do teste F tabelado, a matriz não tem efeito
significativo sobre a precisão do método, caso contrário a
matriz interfere na precisão do método.
O teste t (Student) deve ser calculado e comparado com o
teste t tabelado, caso o valor o calculado seja menor que o
valor do teste t tabelado, a matriz não tem efeito
significativo sobre o ensaio, caso contrário a matriz tem
efeito estatisticamente significante sobre o resultado do
ensaio.
O teste t de Student pode ser utilizado como fator decisivo
caso o teste F calculado tenha um valor maior que o teste F
tabelado, porém o teste t sempre deve ser calculado
independente do resultado do teste F.
5.2 Faixa de Trabalho e Faixa Linear de Trabalho
Em qualquer método quantitativo, existe uma faixa de
concentrações do analito no qual o método pode ser
aplicado. Os primeiros valores da faixa podem ser dos
valores dos limites de detecção e de quantificação e os
últimos dependem do sistema de resposta do equipamento
de medição.
A faixa linear é definida como a faixa de concentrações na
qual a sensibilidade pode ser considerada constante e são
normalmente expressas nas mesmas unidades do resultado
obtido pelo método analítico.
Para escolher a faixa de trabalho procede-se da seguinte
maneira: quando se tem uma amostra específica, a
concentração esperada deve se situar no meio da faixa de
trabalho e quando a concentração do analito é desconhecida
utiliza-se a faixa de trabalho estudada para amostras
diversificadas. Os valores medidos têm que estar dentro da
faixa de trabalho, e os valores medidos próximos ao limite
inferior da faixa de trabalho ter que ser diferente dos brancos
dos métodos.
5.2.1 Métodos para determinação da Faixa de Trabalho
e Faixa Linear
Para determinação da faixa de trabalho e faixa linear pode-
se usar um método com 3 etapas:
1ª etapa: Passar sete ou mais vezes o branco com adição de
concentrações variadas do analito preparados de forma
independente.
Colocar no eixo x as concentrações do analito e no eixo do y
as respostas das medições.
Objetivo: identificar por observação visual, a faixa linear
aproximada e o limite superior e inferior da faixa de
trabalho.
2ª etapa: Passar sete ou mais vezes materiais de referência
(diferentes concentrações), na faixa linear e branco da
amostra com adição de concentrações variadas do analito, na
faixa linear.
Colocar no eixo x as concentrações do analito e no eixo do y
as respostas das medições; Verificar visualmente a
existência de dispersos que possam interferir na regressão;
Calcular o coeficiente de regressão linear; Calcular e fazer o
gráfico dos valores dos resíduos (resíduo é a diferença entre
o valor observado e o valor calculado pela equação da reta
de regressão para cada valor de x); A distribuição aleatória
em torno da linha reta confirma a linearidade; Tendências
sistemáticas indicam a não linearidade.
Objetivo: determinar a faixa de trabalho e confirmar a
linearidade.
3ª. Etapa: Passar sete vezes o branco da amostra com adição
de concentrações variadas do analito, próximas ao LD.
Expressar o LQ como a concentração mais baixa do analito
que pode ser determinada com um nível aceitável de
incerteza.
Objetivo: determinar o Limite de Quantificação (LQ), que
efetivamente forma o limite mais baixo da faixa de trabalho.
5.3 Linearidade
11
É a capacidade de uma metodologia analítica demonstrar
que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à
concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo
especificado.
A linearidade é obtida por padronização interna ou externa e
formulada como expressão matemática (equação da
regressão linear) usada para o cálculo da concentração do
analito a ser determinado na amostra real.
O coeficiente de correlação linear (r) é freqüentemente
usado para indicar a adequabilidade da curva como modelo
matemático. Um valor maior que 0,90 é, usualmente,
requerido. O método pode ser considerado como livre de
tendências (unbiased) se o corredor de confiança da reta de
regressão linear contiver a origem.
5.4 Sensibilidade
Sensibilidade é um parâmetro que demonstra a variação da
resposta em função da concentração do analito. Pode ser
expressa pela inclinaçãoda curva de regressão linear de
calibração, e é determinada simultaneamente aos testes de
linearidade. A sensibilidade depende da natureza do analito
e da técnica de detecção utilizada.
5.5 Limite de Detecção
Limite de detecção é a menor quantidade do analito presente
em uma amostra que pode ser detectada, porém não
necessariamente quantificada, sob as condições
experimentais estabelecidas.
No caso de métodos não instrumentais (CCD, titulação,
comparação de cor), esta determinação pode ser feita
visualmente, onde o limite de detecção é o menor valor de
concentração capaz de produzir o efeito esperado (mudança
de cor, turvação, etc). E no caso de métodos instrumentais
(CLAE, CG, absorção atômica), a estimativa do limite de
detecção pode ser feita com base na relação de 3 vezes o
ruído da linha de base.
5.5.1. Determinação de Limite de Detecção (LD)
Para determinação do LD analisam-se 7 ou mais amostras
em branco e calcula-se o LD = x + ts onde x é a média dos
valores das amostras em branco e s é o desvio padrão das
amostras em branco. A média e o desvio padrão são
dependentes da matriz e é válido somente quando os valores
das amostras em branco apresentarem um desvio padrão
diferente de zero.
Pode ser determinado também analisando-se sete ou mais
amostras em branco com a adição da menor concentração
aceitável do analito e calcula-se LD = 0 + ts onde: s = desvio
padrão das amostras em branco com adição. A “menor
concentração aceitável” é aquela tida como a concentração
mais baixa para a qual um grau aceitável de incerteza pode
ser alcançado.
5.6 Limite de Quantificação
É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode
ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as
condições experimentais estabelecidas. Onde o limite de
quantificação é estabelecido por meio da análise de soluções
contendo concentrações decrescentes do analito até o menor
nível determinável com precisão e exatidão aceitáveis.
O Limite de Quantificação refere-se à concentração do
analito correspondente ao valor da média das amostras em
branco mais 5, 6 ou 10 desvios padrão ou pode corresponder
ao padrão de calibração de menor concentração descontando
o branco.
5.6.1 Determinação do Limite de Quantificação (LQ)
Para determinação do LQ analisa sete vezes a amostra em
branco e calcula LQ = X + 5s ou LQ = X + 6s ou LQ = X +
10s, onde X = Média dos valores dos brancos e s = Desvio
padrão dos brancos, onde a obtenção do branco verdadeiro
pode ser difícil.
Ou pode ser determinado analisando-se sete brancos com
adição de concentrações variadas do analito, próximas ao
LD. Que para cálculos pode-se:
ƒ Medir, uma vez cada 7 replicatas independentes a cada
nível de concentração;
ƒ Calcular o desvio padrão “s” do valor do analito, para
cada concentração;
ƒ Fazer o gráfico “s” versus concentração e atribuir um
valor para o LQ, por inspeção;
ƒ Expressar o LQ como a concentração mais baixa do
analito que pode ser determinada com um nível
aceitável de incerteza.
Onde o LQ faz parte do estudo para determinação da faixa
de trabalho.
5.7 Exatidão e Tendência (Bias)
A exatidão de um método analítico é verificada quando são
obtidos resultados muito próximos em relação ao valor
verdadeiro, a exatidão é calculada como porcentagem de
recuperação da quantidade conhecida do analito adicionado
à amostra, ou como a diferença porcentual entre as médias e
o valor verdadeiro aceito, acrescida dos intervalos de
confiança.
A exatidão do método deve ser determinada após o
estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da
especificidade do mesmo, sendo verificada a partir de, no
mínimo, 9 (nove) determinações contemplando o intervalo
linear do procedimento, ou seja, 3 (três) concentrações,
baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas cada.
A tendência implica numa combinação de componentes de
erros aleatórios e sistemáticos, onde a determinação da
tendência total com relação aos valores de referência
apropriados é importante no estabelecimento da
rastreabilidade aos padrões reconhecidos. A tendência pode
ser expressa como recuperação analítica (valor observado /
valor esperado). A tendência deve ser corrigida ou
demonstrada ser desprezível, mas em ambos os casos, a
incerteza associada com a determinação da tendência
12
permanece como um componente essencial da incerteza
global.
Os processos normalmente utilizados para avaliar a exatidão
de um método são, dentre outros: uso de materiais de
referência, participação em comparações interlaboratoriais e
realização de ensaios de recuperação.
5.7.1 Materiais de referência certificados (MRC)
Os materiais de referência certificados são utilizados no
processo de validação de um método de ensaio para avaliar
o desempenho do laboratório, por isso o fornecimento de
MRC é realizado por organismos reconhecidos e confiáveis,
como por exemplo, NIST, LGC, dentre outros.
Na avaliação da exatidão utilizando um material de
referência, os valores médios obtidos pelo laboratório e o
desvio padrão de uma série de ensaios em replicata, devem
ser comparados com os valores certificados do material de
referência, para esta comparação podem ser utilizados:
ƒ Erro relativo (ER);
ƒ Teste de hipóteses;
ƒ Índice z (z Score);
ƒ Erro normalizado;
5.7.2 Comparações interlaboratoriais
Busca mostrar o desempenho do laboratório em; estabelecer
a eficácia e a comparabilidade de novos métodos de ensaio
ou de medição; monitorar métodos estabelecidos e
determinar as características de desempenho de um método,
geralmente conhecido como processos colaborativos que é
uma forma de ensaio para avaliar o desempenho de um
método nas condições normais de trabalho em vários
laboratórios, através de ensaio de amostras homogêneas
preparadas cuidadosamente.
5.7.3 Comparação de métodos
Tem como objetivo estudar o grau de proximidade dos
resultados obtidos pelos diferentes métodos de ensaio
comparando os resultados obtidos utilizando um método
interno e um método de referência, que busca avaliar a
exatidão do método interno relativamente ao de referência.
5.8 Precisão
A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados
obtidos em uma série de medidas de uma amostragem
múltipla de uma mesma amostra, onde as duas formas mais
comuns de expressá-la são por meio de repetitividade e
reprodutividade expressa pelo desvio padrão.
A precisão é geralmente expressa como desvio padrão ou
desvio padrão relativo. Ambas repetitividade e
reprodutibilidade são geralmente dependentes da
concentração do analito e, deste modo, devem ser
determinadas para um diferente número de concentrações;
em casos relevantes, a relação entre precisão e concentração
do analito deve ser estabelecida. Neste caso o desvio padrão
relativo pode ser mais útil, pois foi normalizado com base na
concentração e deste modo ele é praticamente constante ao
longo da faixa de interesse, contanto que esta não seja muito
extensa.
5.8.1 Repetitividade
Repetitividade é a precisão intra-corrida, ou seja o grau de
concordância entre os resultados de medições sucessivas,
efetuadas sob as mesmas condições de medição. Todas as
medições com o mesmo procedimento; mesmo analista;
mesma instrumentação, dentro de um curto período de
tempo.
A repetitividade pode ser expressa quantitativamente em
termos da característica da dispersão dos resultados e pode
ser determinada por meio da análise de padrões, material de
referência ou adição ao branco de várias concentrações da
faixa de trabalho.
A partir do desvio padrão dos resultados dos ensaios sob
condição de repetitividade, calcula-se o limite de
repetitividade “r” que capacita o analista a decidir se a
diferença entre análises duplicatas de uma amostra é
significante para um nível de confiança de 95%.
5.8.2 Reprodutibilidade
Reprodutibilidade é a precisão interlaboratorial, ou seja, o
grau de concordância entre os resultadosobtidos em
laboratórios diferentes como em estudos colaborativos.
Embora a reprodutibilidade não seja um componente de
validação de método executado por um único laboratório, é
considerada importante quando um laboratório busca a
verificação do desempenho dos seus métodos em relação
aos dados de validação obtidos através de comparação
interlaboratorial. A partir do desvio padrão obtido sob
condições de reprodutibilidade é possível calcular o limite
de reprodutibilidade “R”, o qual permite ao analista decidir
se a diferença entre os valores da duplicata das amostras
analisadas sob condições de reprodutibilidade é significante.
5.8.3 Precisão intermediária
Precisão intermediária é a precisão intercorridas, ou seja,
refere-se à concordância entre os resultados do mesmo
laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas
diferentes e/ou equipamentos diferentes. Para a
determinação da precisão intermediária recomenda-se um
mínimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes.
Existem vários métodos para determinação e controle desse
parâmetro de qualidade, como por exemplo, por meio de
gráfico de controle de amplitude, que poderão ser aplicados
para replicatas de amostra e para padrões estáveis ao longo
do tempo.
Um método simplificado para estimar a precisão
intermediária baseia-se na execução de:
• uma mesma amostra;
• amostras supostamente idênticas;
• padrões.
13
5.8.4 Comparação da precisão entre métodos
A precisão de um método analítico pode ser expressa como
o desvio padrão ou desvio padrão relativo de uma série de
medidas. Quando se pretende avaliar se dois métodos (A e
B) têm diferenças significativas entre si, em termos de
precisão, pode-se recorrer ao teste F. Este se baseia no
cálculo da razão entre as variâncias dos dois métodos (Fcal =
SA²/SB²), colocando-se a maior no numerador, de modo que
a razão seja maior ou igual a um. Em seguida, compara-se
este valor obtido com o valor tabelado de F. Se Fcalculado ≤
Ftabelado, os dois métodos não apresentam diferenças
significativas entre si, relativamente às suas precisões.
5.8.5 Recuperação
A recuperação do analito pode ser estimada pela análise de
amostras adicionadas com quantidades conhecidas do
mesmo (spike). As amostras podem ser adicionadas com o
analito em pelo menos três diferentes concentrações.
A limitação deste procedimento é a de que o analito
adicionado não está necessariamente na mesma forma que
apresente na amostra. A presença de analitos adicionados
em uma forma mais facilmente detectável pode ocasionar
avaliações excessivamente otimistas da recuperação.
5.8.6 Método de determinação de Repetitividade e
Reprodutibilidade
Analisar 7 Padrões, materiais de referência ou amostras de
branco fortificadas a várias concentrações ao longo da faixa
de trabalho.
ƒ Com mesmo analista, equipamento, laboratório, em um
período curto de tempo. Determinar o desvio-padrão (s)
da repetitividade de cada concentração;
ƒ Analistas e equipamentos diferentes, mesmo
laboratório, período estendido (precisão intermediária).
Determinar o desvio-padrão da reprodutibilidade
intralaboratorial de cada concentração.
ƒ Analistas, equipamentos e laboratórios diferentes,
período estendido. Determinar o desvio-padrão da
reprodutibilidade interlaboratorial de cada
concentração.
5.9 Robustez
A robustez de um método de ensaio mede a sensibilidade
que este apresenta face a pequenas variações. Um método
diz-se robusto se revelar praticamente insensível a pequenas
variações que possam ocorrer quando esse está sendo
executado.
Para determinar a robustez de um método de ensaio, pode-se
recorrer ao teste de Youden. Trata-se de um teste que
permite não só avaliar a robustez do método, como também
ordenar a influência de cada uma das variações nos
resultados finais, indicando qual o tipo de influência de cada
uma dessas variações. Convém salientar que quanto maior
for à robustez de um método, maior será a confiança desse
relacionamento à sua precisão.
5.10. Incerteza de Medição
Os estudos de validação e o seu acompanhamento que deve
ser feito de acordo com a rotina do laboratório, produzem
dados de desempenho global do método e fatores de
influência individuais que podem ser aplicados à estimativa
da incerteza associada aos resultados do método em rotina.
Através desses dados é possível calcular as variações
sofridas pelo método e determinar a incerteza, ou seja,
quanto o meu resultado vai variar para mais ou para menos
numa determinada faixa de trabalho com uma determinada
matriz.
Após essa etapa, o método pode ser considerado validado e
passar para o processo de acreditação, onde todos os
parâmetros da validação serão avaliados pelo órgão
certificador responsável. A manutenção da validação do
método também será analisada através do uso de padrões de
verificação e de participação em estudos interlaboratoriais
[1-3-5].
6. PARTE EXPERIMENTAL
Para exemplificar o processo de validação, foram aplicadas
algumas alterações no método 2310 do Standard Methods
for the Examination of Water and Wastewater titulométrico
para determinação de acidez em água, conforme abaixo:
ƒ Uso exclusivo do indicador fenolftaleína 1% (m v-1);
ƒ Extensão da faixa de trabalho (de 50 a 1000 mg de
CaCO3 L-1);
ƒ Acondicionamento da amostra com ácido sulfúrico
0,02N.
A revalidação do método é necessária para verificar se as
alterações feitas não modificam o desempenho do método.
A validação desse método foi feita para a matriz de água
potável, visando restringir os estudos sobre o efeito da
matriz.
Como em toda a validação, foram adotados alguns critérios
para melhor compreensão e efetuação dos cálculos,
deixando claro que esse trabalho visa indicar um caminho e
não uma regra para a validação de métodos de ensaio
químico.
Durante os cálculos a constante k que é um fator de
cobertura, ou seja, fator de confiança; é igual a 2, o que
significa que o nível de confiança é de 95%. Este fator de
95% é o mais utilizado em laboratórios químicos e
metrológicos, porém em outros tipos de laboratório esse
fator pode ser alterado de acordo com o nível de confiança
que se deseja alcançar.
Outro fator que deve ser definido é a temperatura do
ambiente onde serão realizadas as análises. No caso deste
trabalho, adotou-se 22°C + 2°C; esse valor não é casual, foi
escolhido devido calibração do material volumétrico a 20°C
e, por esse motivo, a temperatura ambiente foi mantida na
faixa de 20 a 24°C onde a variação da densidade da água e
da dilatação do vidro são considerados constantes [3].
14
Acidez R2 = 1
0,00
200,00
400,00
600,00
800,00
1000,00
1200,00
0 200 400 600 800 1000 1200
Conc e nt r a ç õe s do Ana l i t o
7. PRINCÍPIO DO MÉTODO [8]
A acidez da água esta diretamente relacionada aos íons de
hidrogênio presentes na amostra, como resultado da
dissociação ou hidrólise de solutos e a sua capacidade de
reação com uma solução padrão de uma base forte
adicionada á amostra. O valor da acidez depende do valor de
pH adotado como ponto final ou do indicador utilizado, o
valor encontrado pode variar significativamente de acordo
com o valor de pH utilizado na determinação como ponto
final.
A acidez é a medição de uma propriedade agregada à água
que pode ser interpretada de em termos específicos onde a
composição da amostra é conhecida. Minerais fortemente
ácidos, ácidos fracos como o carbônico e o acético, e sais
hidrolisados como sulfatos de ferro ou alumínio também
contribuem para a determinação de acidez segundo este
método. Essa determinação pode refletir a qualidade da
água.
7.1 Reagentes e Materiais:
Os materiais e os reagentes utilizados para a realização dos
ensaios são controlados e obedecem aos critérios
estabelecidos pelo método de análise, assim como as
soluções requeridas por ele.
7.2 Determinação de Acidez da Água
Pipetou-se 100mL de amostraou padrão e transferiu-se para
um erlenmeyer de 250mL, adicionou-se 5mL de solução de
ácido sulfúrico 0,02N e 5 gotas de peróxido de hidrogênio
30% (v.v-1), aqueceu-se por 5 minutos.
Resfriou-se até a temperatura ambiente e adicionou-se 5
gotas da solução de fenolftaleína 1% (m v-1), titulando-se
com a solução de hidróxido de sódio 0,1N até o ponto final
indicado pela coloração rosa (primeiro tom de rosa). Efetuar
a prova em branco com água tipo I [8].
Determinação de acidez
Acidez mg CaCO3 .L-1 = [( A x B ) – ( C x D )] x 50000
 mL de amostra
Onde:
A= Volume gasto de hidróxido de sódio 0,1N (mL);
B= Normalidade real do hidróxido de sódio 0,1N;
C= Volume adicionado de ácido sulfúrico 0,02N (mL);
D= Normalidade real do ácido sulfúrico 0,02N.
7.3 Valores Experimentais:
Tabela 1: Média dos resultados obtidos utilizando-se a faixa
estendida "com a matriz".
Conc. em mg CaCO3.L-1
Conc. em mg de CaCO3 .L-1
(média dos valores)
Branco 1,52
50 49,39
100 100,83
150 149,42
200 200,15
250 250,88
Conc. em mg CaCO3.L-1
Conc. em mg de CaCO3 .L-1
(média dos valores)
300 299,47
350 349,48
400 400,92
450 449,51
500 501,67
550 550,26
600 600,27
650 651,72
700 700,30
750 750,32
800 801,04
850 850,35
900 901,07
950 952,52
1000 999,68
Continuação da tabela 1.
Faixa de Trabalho e Faixa de Linearidade
Figura 1: Curva linear, utilizando os valores médios das
concentrações encontradas a partir das médias das concentrações
dos padrões analisados com a "matriz" descontando o branco.
Equação da linha de tendência da curva:
y = ax + b
Onde:
y = Resposta medida (absorbância, altura ou área do pico,
etc.);
x = Concentração;
a = Inclinação da curva de calibração = sensibilidade;
b = interseção com o eixo y, quando x = 0.
A equação da reta (equação de regressão) do gráfico
elaborado com as médias dos resultados obtidos foi: y =
1,0008x + 0,1218; e o coeficiente de correlação linear,
também chamado de R² foi igual a 1.
15
Tabela 2: Parâmetros para avaliação da sensibilidade
Conc. em mg de
CaCO3 .L-1 (média
dos valores) xmedido
Valores
calculados
xcalculado
Resíduo
R=A-B sr tcalculado
1,52 1,40 0,12 1,31
49,39 49,23 0,16 1,72
100,83 100,63 0,20 2,16
149,42 149,18 0,24 2,57
200,15 199,87 0,28 3,00
250,88 250,56 0,32 3,44
299,47 299,11 0,36 3,85
349,48 349,08 0,40 4,28
400,92 400,48 0,44 4,71
449,51 449,03 0,48 5,13
501,67 501,15 0,52 5,57
550,26 549,70 0,56 5,99
600,27 599,67 0,60 6,41
651,72 651,08 0,64 6,85
700,30 699,62 0,68 7,27
750,32 749,60 0,72 7,69
801,04 800,28 0,76 8,12
850,35 849,55 0,80 8,54
901,07 900,23 0,84 8,98
952,52 951,64 0,88 9,42
999,68 998,76 0,92
0,25
9,82
Cálculo dos desvios de linearidade(t):
tcalculado = resíduo Onde:
 sr n resíduo = xmedido - xcalculado
 sr = desvio padrão dos resíduos;
 n = numero de pontos.
Sensibilidade:
S = dx Onde:
 dc S = sensibilidade;
 a = inclinação da curva de calibração;
S=a dx = variação da resposta;
 dc = variação da concentração.
 Logo: a = 1,0008 ∴ S = 1,0008
Tabela 3: Parâmetros para avaliação do limite de detecção
Concentração real do Branco mg
CaCO3.L-1
X t (95%) s LD
0,09 5,09 0,09 0,09 5,09 0,09 0,09 1,52 2,447 2,04 6,51
Limite de Detecção (LD):
LD = X + ts
Onde:
X = média dos valores dos brancos;
t = valor da abscissa t (Student) para (1- α) x 95% nível de
confiança;
s = desvio padrão dos brancos (para s = 0).
Tabela 4: Parâmetros para avaliação do limite de
quantificação
Concentração real do Branco mg CaCO3.L-1 X s LQ
0,09 5,09 0,09 0,09 5,09 0,09 0,09 1,52 2,04 21,92
Limite de Quantificação (LQ):
 Onde:
LQ = X + 10s X = média dos valores dos brancos;
 s = desvio padrão dos brancos.
8. CONCLUSÃO
Analisando-se os aspectos abordados neste trabalho,
evidencia-se a importância da validação da metodologia
analítica aplicada em laboratório, uma vez que assegura-se a
confiabilidade dos resultados obtidos, delegando qualidade
aos produtos e/ou serviços prestados, além de
reconhecimento comercial.
Na parte experimental, observou-se que as alterações
aplicadas no método normalizado não influenciaram seu
desempenho em relação a parâmetros, tais como linearidade,
seletividade, especificidade, faixa de trabalho, limite de
detecção, limite de quantificação e sensibilidade, os quais
são dados preliminares para iniciar o processo de
revalidação.
Partindo-se da avaliação dos parâmetros acima, a etapa
seguinte seria testar os demais parâmetros, que são:
robustez, repetitividade, reprodutibilidade, precisão
intermediária, comparação com outros métodos e
recuperação e etc, prosseguindo ao estudo do cálculo de
incerteza e, por fim, a acreditação do método.
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] NBR ISO/IEC 17025:2001. Requisitos Gerais para a
Competência de Laboratórios de Calibração e de
Ensaios. ABNT. RJ. Brasil.
[2] LEITE, Flávio - Validação em Análise Química -
Editora Átomo, 1996.
[3] Guia EURACHEM. Primeira Edição do Guia
EURACHEM/ CITAC, 2ª ed.,2000. Determinando a
Incerteza na Medição Analítica. QUAM 2002. Versão
Brasileira.
[4] BARROS,C & HIRATA,Y, 2002. Apostila do Curso
Estimativa da Incerteza nas Medições Laboratoriais -
Rev.02 - Outubro/ 2002. CPTI.São Paulo. SP.
[5] COSTA NETO, Pedro Luiz de Oliveira - Estatística - 2ª
edição, editora Edgard Blücher Ltda., 2002.
[6] KELLY, William D. - Basic Statistics for Laboratories -
Ed. Van Nostrand Reynolds, 1991.
[7] ISO/ IEC 17025:1999. General Requirements for the
Competence of Testing and Calibration Laboratories.
1999. International Organization for Standardization.
ISO, Geneva. Switzerland.
[8] Método 2310-Acidity - Standard Methods for the
Examination of Water and Wastewater -20Th Edition,
1998.