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KIT DIAGNÓSTICO PARA DETECÇÃO ANTICORPOS ANTI ds-DNA NO SORO DE PACIENTES COM LUPUS ERITEMATOSO SISTEMICO
Kit para determinação de autoanticorpos anti-DNA, por metodologia qualitativa de contraimunoeletroforese em amostras de soro humano.
Importância clínica: a pesquisa dos autoanticorpos anti­-DNA de dupla hélice (anti­-dsDNA) é útil para o diagnóstico e monitoramento do lúpus eritematoso sistêmico (LES), principalmente nos pacientes com nefrite lúpica. Os anticorpos anti­DNA são anticorpos marcadores do LES que têm sido pesquisados por meio de IFI, tendo como substrato o hemoflagelado Crithidia luciliae.
Príncipio do método: o método é simples e baseia­se na migração do antígeno em direção ao anticorpo, os quais são colocados em solução paralelamente em meio geleificado. Uma voltagem é aplicada no gel, fazendo com que a migração de antígeno e anticorpo ocorram de maneira mais rápida. Uma linha de precipitação aparece no gel, onde ocorre a formação do complexo antígeno­anticorpo. Além disso, o método pode ser realizado dentro de 1 ou 2 horas.
Conteúdo do kit: este kit é composto por 4 lâminas de vidro, um gabarito de papel, um frasco de tampão TBE 0,5X e um pote de agarose que devem ser mantidos em temperatura ambiente. Acompanha um eppendorf contendo DNA que deve ser mantido em temperatura de -1 à -4. Conteúdo suficiente para 4 análises.
Amostras: soros livres de hemólise, lipemia e contaminação bacteriana. Caso necessário, as amostras podem ser conservadas no freezer a -20ºC, no máximo por 6 semanas, ou entre 2-8ºC por 48 horas. Os soros devem ser usados puros, ou seja, não diluídos. Não se deve usar plasma porque o fibrinogênio pode causar aglutinação inespecífica.
Procedimento
a) Fabricação do gel de agarose 1% para eletroforese
0,3 g de agarose para 30 mL de gel, que deve ser preparado com tampãoTris­Borato­EDTA 1X. 
1. Pesar a agarose.
2. Colocá­la em um erlenmeyer contendo o volume necessário de tampão TBE 1X. 
3. Aquecer no forno de microondas até iniciar a ebulição (aproximadamente 30 segundos em potência média para um gel de 30 mL). 
4. Agitar o frasco e retornar ao forno de microondas por mais alguns segundos.
5. Verter no molde previamente nivelado e colocar os pentes.
6. Após a solidificação, colocar o gel na cuba de eletroforese e cobrir com tampão TBE 1X.
7. Aplicar as amostras de soro e o antígeno e aplicar a corrente.
b) Contraimunoeletroforese
Para consecução da CIE, lâminas de vidro (50 x 75mm) são recobertas com agarose em tampão barbital 0,5M, e, com auxílio de gabarito, faz­se poços de 20μl dispostos verticalmente em quatro colunas com cinco poços. Os soros dos pacientes ou controles são introduzidos no lado catódico da lâmina, a qual é submetida a eletroforese por 30 minutos em câmara contendo solução barbital diluída 1:5 sob uma corrente de intensidade constante de 12mA. Logo após, a lâmina é retirada, os orifícios do lado anódico são preenchidos com 20ml do antígeno e novamente submetida a eletroforese com a mesma intensidade por 15min. Posteriormente, a lâmina é colocada em câmara úmida por uma noite e realizada a leitura por dois observadores independentes. 
Resultado da Leitura
teste positivo: a positividade é revelada por linhas de precipitação.
teste negativo: não aparecerá as linhas de precipitação.
Precauções e advertências: seguir as boas práticas laboratoriais (BPLs), na conservação, manuseio e descarte dos materiais.
Termo de Garantia: O DNA LUP TEST garante a troca deste conjunto diagnóstico, desde que o mesmo esteja dentro do prazo de validade e que seja comprovado por sua assessoria técnica que não houve falhas na execução, manuseio e conservação deste produto. A DNA LUP TEST e seus distribuidores não se responsabilizam por falhas no desempenho do kit sob essas condições.
Bibliografia
1. BURTIS, C. A.; ASHWOOD, E. R.; BRUNS, D. E. TIETZ: Fundamentos de química analítica. .ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2008. 
2. CALLADO, M. R. et al. Utilidade da triagem dos anticorpos anti­dsDNA por quimioluminescência, seguida de confirmação por imunofluorescência indireta. Rev. Bras. Reumatol. vol.53 no.5 São Paulo Sept./Oct. 2013. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0482­50042013000500008>. Acesso em 02 mai. 2016.
Simbologia: