Relatório DNA

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Universidade do Oeste de Santa Catarina- UNOESC- Campus de Videira 
Curso de Graduação em Engenharia Química 
Disciplina Bioquímica Geral Experimental 
Professor Cesar Milton Baratto 
 
 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA DE EXTRAÇÃO DOS ÁCIDOS 
NUCLEÍCOS DA CEBOLA. 
 
 
 
 
 
Acadêmicos: Camila Dani; 
Diogo Pereira e 
Juliana Petry. 
 
 
 
 
Videira, 07 de Outubro de 2014. 
INTRODUÇÃO 
 
Existem apenas dois tipos de ácidos nucléicos que são o 
desoxirribonucleico conhecido como DNA ou ADN e o ribonucleico que é o 
RNA, o DNA que pode ser encontrado nos cromossomos é capaz de se 
duplicar. Todas as informações para a criação de um ser vivo são encontradas 
no DNA, ele que fornece todas as instruções necessárias para as atividades 
celulares e contém todas as informações genéticas da maioria dos seres. Cada 
nucleotídeo é por composto uma pentose (ribose no RNA e a desoxirribose no 
DNA), uma base nitrogenada que podem ser púricas (adenina e guanina) ou 
pirimídicas (citosina, timina e uracila) e um fosfato, sendo a timina exclusiva do 
DNA e a timina do RNA. O DNA é formado por duas cadeias de poli 
nucleotídeos em forma de hélice e ligadas através de pontes de hidrogênio, 
entre as bases nitrogenadas com ligações específicas, ou seja, se em uma 
cadeia há timina, a base oposta à adenina, do mesmo modo, a citosina se liga 
com a guanina, formando-se, portanto, duas moléculas de DNA com a mesma 
sequência de bases. 
Atualmente podemos observar muitos estudos e polêmicas relacionados 
à genética como a clonagem, os alimentos modificados ou transgênicos e até 
mesmo o genoma humano, atualmente presenciamos uma grande evolução da 
genética com técnicas que permitem o isolamento e manuseio do DNA. O 
primeiro passo, para aplicação desse estudo é a obtenção desse material que 
utiliza técnicas parecidas com as que os cientistas utilizavam no inicio de seus 
estudos, o DNA era separado dos outros compostos celulares. Primeiramente 
as células eram fragmentas e o DNA separado do conteúdo lipídico das 
membranas da célula e dos organitos, em seguida é separado das proteínas. 
Este trabalho laboratorial é simples e pode ser realizado na própria 
cozinha com substâncias básicas mostrando de forma simples e caseira como 
podemos obter o DNA para observação e estudo, material o qual os cientistas 
levaram muitos anos para descobrir. O procedimento a seguir é utilizado para 
extrair DNA a partir de cebola, métodos semelhantes são utilizados nas 
extrações de outras fontes, como do sangue, dos tecidos e outros. A extração 
desse material de células eucariontes consta fundamentalmente das seguintes 
etapas: a ruptura das membranas celulares para liberação do material 
genético; o desmembramento dos cromossomos em seus componentes 
básicos (DNA e proteínas) e a separação do DNA dos demais componentes 
celulares. 
Após a extração de DNA, é a análise. A eletroforese consiste na 
separação de moléculas ionizadas, de acordo com suas cargas elétricas e 
pesos moleculares em campo elétrico. Moléculas orgânicas como RNA, DNA e 
proteínas são separadas pela migração destas em um gel durante a aplicação 
de um potencial elétrico. O princípio da eletroforese utilizada para separação 
de DNA, por exemplo, baseia-se na carga total negativa do DNA, conferida 
pelos grupamentos fosfatos. Sendo assim, as moléculas de DNA tendem a 
migrar em direção ao pólo positivo (cátodo).Nesse caso, a agarose é utilizada 
como gel para a eletroforese. A agarose é um polissacarídeo e forma uma rede 
que segura as moléculas durante a migração, dependendo da concentração de 
agarose, tem-se uma diferença no gradiente de separação. Para preparar um 
gel de agarose, faz-se uma mistura entre o pó de agarose e solução tampão, o 
TBE. Após fundir, coloca-se o brometo de etidio que fará com que o DNA ou 
RNA brilhe quando exposto ao UV. 
 
OBJETIVOS 
 
Extrair DNA de cebola de forma simples e utilizando substâncias de uso 
doméstico (detergente para lavar louça, sal de cozinha e álcool). 
Conhecer os princípios básicos envolvidos na extração do material 
genético de células eucariotas (do tecido da cebola). 
Separar os fragmentos de DNA de acordo com seu peso molecular, 
através de sua migração através de uma matriz quando submetidos a um 
campo elétrico. 
 
MATERIAIS E MÉTODOS 
 
1 - Extração de DNA: 
Cebola grande 
Ralador 
Sal de cozinha (NaCl) 
Detergente de lavar louça (líquido 
ou gel) 
Água quente (65°C à 80°C) 
Papel filtro 
Funil 
Gelo 
Álcool gelado 
Dois frascos de vidro (200ml) 
Bastão de vidro 
Recipiente para banho de gelo 
 
2- eletroforese: 
Gel de agarose 
Cuba de eletroforese 
Tampão TBE 
Brometo de etideo 
Amostra de DNA 
 
1- Extração do DNA 
 
Inicialmente foi ralado a cebola com auxílio de um ralador de alumínio, e 
colocada em um Becker de vidro até a marca de 40ml. Preparado em outro 
Becker a solução de 100 ml composta por 80 ml de água quente, 20 ml de 
detergente e uma colher de sopa rasa de sal de cozinha (NaCl) e misturado 
com a solução de cebola e deixando em repouso por 10 minutos. Em seguida 
colocamos o frasco com a solução de cebola em um recipiente com água 
gelada e gelo, para um banho de gelo até que a solução esfrie e apresente um 
aspecto talhado em média 30 minutos. Após a solução fria é filtrada, 
armazenada em frasco limpo e adicionado cuidadosamente pela parede (com o 
frasco em um ângulo de 20° à 40°) álcool gelado, o qual não de mistura com a 
solução do filtrado formando duas fases. Entre as duas fases é possível 
observar a formação de um precipitado de cor esbranquiçada que são os 
ácidos nucleicos. Com auxílio de uma pipeta são sugados os precipitados, ou 
seja, o DNA e o RNA de cebola e colocados em um tubo sendo secado por 
alguns minutos para e vaporação do álcool, centrifugados e reidratados com 
água destilada para a utilização na eletroforese. 
A lise celular libera as moléculas em uma fase aquosa que é separada 
dos restos celulares por centrifugação. As proteínas são removidas da fase 
aquosa por solventes orgânicos (fenol, clorofórmio). O DNA, que permanece na 
fase aquosa, é precipitado com etanol e, posteriormente, purificado e 
suspendido em um local adequado. 
 
 
2- Análise de DNA em eletroforese. 
 
Foram pegos 9µl da amostra de DNA já preparada dissolvido em tampão 
TE e 1µl de tampão de amostra e aplicado no gel para corrida de eletroforese. 
Após a aplicação da amostra, fecha-se a tampa da cuba contendo os 
cabos que permitirão a conexão entre a cuba e a fonte de corrente contínua 
utilizando uma voltagem de 70V por aproximadamente 1 hora e 30 minutos. 
Durante a corrida o DNA sairá do poço, penetrará no gel, migrando em 
direção ao pólo positivo. Com isso os fragmentos serão separados de acordo 
com o tamanho. Os fragmentos menores migram mais rapidamente que os 
fragmentos maiores, pois eles apresentam maior facilidade de atravessar os 
poros da matriz de agarose em direção ao pólo positivo. Enquanto que 
fragmentos de mesmo tamanho migram praticamente juntos. 
 
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
1- Extração do DNA 
 
O detergente dissolve as membranas lipídicas além de desintegrar os 
núcleos e os cromossomos das células da cebola, liberando o DNA. Com a 
ruptura das membranas, o conteúdo celular, incluindo DNA e proteínas, soltam-
se e dispersam-se na solução. Um dos componentes do detergente, o lalril 
sulfato de sódio, desnatura as proteínas, separando-as do DNA cromossômico. 
A adição de cloreto de sódio, proporcionou ao DNA um ambiente 
favorável. O cloreto de sódio contribuicom íons positivos Na+ que neutraliza a 
carga negativa do DNA. Dessa forma, o DNA precipita na solução aquosa. 
O álcool gelado, proporciona uma mistura heterogenia (duas fases), em 
ambiente salino e faz com que as moléculas de DNA se aglutinem, formando 
uma massa filamentosa e esbranquiçada. 
O DNA não se dissolve no álcool, na concentração e na temperatura que 
se usou neste experimento. Pelo fato do DNA ser menos denso que a água e a 
mistura aquosa dos restos celulares, ele se localiza na interface da fase 
alcoólica e aquosa. 
 
 
2- Análise de DNA em eletroforese. 
 
 
Figura 1 - Análise de DNA de cebola em eletroforese. (5º contando da 
esquerda para a direita) 
 
O método mais usual para se visualizar o DNA em gel de agarose é por 
coloração com brometo de etídeo. Esse corante se intercala entre as bases dos 
ácidos nucléicos e, na presença de luz Ultra Violeta fluoresce em vermelho 
alaranjado. A migração do DNA depende da diferença de potencial entre os 
pólos positivo e negativo, bem como do tamanho dos fragmentos dessas 
moléculas, expresso em relação ao número de bases. Quanto maior a 
diferença de potencial, maior a velocidade de migração dessas moléculas, e 
quanto menor o tamanho dos fragmentos maior a velocidade de migração. 
A mobilidade dos fragmentos de DNA é influenciada pela presença do 
brometo de etídeo. O fato desse agente se intercalar entre os pares de bases 
provoca mudanças na conformação e na flexibilidade da molécula de DNA. 
Porém, na análise realizada em nossa amostra, não foi possível 
observar o DNA, este fato pode ter 3 explicações: 
 Contaminação por fenóis, isto pode se expressar pela coloração 
marrom escura do DNA; 
 Contaminação por polissacarídeos, onde a amostra de DNA surge 
com um aspecto gelatinoso e bastante viscoso; 
 DNA degradado, isto ocorre pela contaminação das DNAses, por 
quebra mecânica durante a extração com clorofórmio ou por 
contaminação com RNA. 
No caso, a explicação mais aceita para o nosso caso, é que o DNA 
tenha sido degradado devido ficar muito tempo armazenado para a análise. 
 
CONCLUSÃO 
 
Foi possível extrair o DNA da cebola por um método bastante simples, 
onde várias etapas acabaram com a extração de DNA, onde foi possível ver a 
destruição da parece celulósica que envolve a célula vegetal. O detergente foi 
o responsável pelo rompimento da membrana citoplasmática e o rompimento 
do DNA na solução, assim com a adição do álcool foi possível separar o 
restante DNA. 
A análise em eletroforese, a corrente elétrica, a composição e a força 
iônica do tampão influenciam na migração do DNA. Em uma faixa de baixa 
voltagem, a taxa de migração de fragmentos de DNA linear é proporcional à 
voltagem aplicada. Entretanto, o aumento de voltagem faz com que a 
linearidade seja perdida. Desta forma, os grandes fragmentos de DNA migram 
mais rápido do que os pequenos havendo formação de rastros que refletem a 
má resolução dos fragmentos.