Ensaios de endotoxina bacteriana

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Ensaios de endotoxina bacteriana (Método LAL) e pirogênio in vivo
In vivo foi o primeiro ensaio para determinar substancias que causavam febre. Hoje temos o ensaio in vitro (LAL - Limulus amebocyte lysate).
O que sao pirogênios?
Piro é fogo genio é origem. Substancia que origina fogo (febre).
São substancias orgânicas provenientes de contaminação microbiana responsáveis por muitas reações febris que ocorrem nos pacientes após injeção.
				A produção nao foi feita da maneira correta.
Os pirogênios são provenientes de bactérias vivas ou mortas Gram (-) ou (+), fungos e vírus.
As endotoxinas estão associadas exclusivamente a bactérias Gram (-) tem na parece celular LPS.
Origem dos pirogênios
Ele pode vim da água, matérias primas (o lote da matéria prima vem com as características físicas e químicas), utensílios diversos (vidrarias, metais equipamento), material de embalagem (fracos, ampolas e rolhas), ar ambiente e pessoas (80 a 90% vem das pessoas). Vem de tudo o que envolve o processo por isso as boas praticas de fabricação devem ser feitas da maneira correta.
Sao divididos em Exógenos e Endógenos
Exógenos: origina-se fora do corpo e induzem elevações térmicas quando injetados.
Ex: Bactérias fungos vírus assim como pirogênos nao microbianos como alguns fármacos (esteroides, frações do pasma, muramil dipéptideo)
Endógeno: origina-se dentro do corpo consiste de uma substância homogênea sintetizada por diferentes células do hospedeiro após exposição ao pirogênio exógeno
Ex: Pirogênio granulocitico originado de leucócitos polimorfonucleares. 
O que são endotoxinas ?
São complexos de alto peso molecular associados a membrana externa de bactérias GRAM (-).
A bactéria GRAM (-) não retém o corante cristal violeta conhecido como coloração de GRAM quando descoloridos com um solvente natural. Utiliza-se safranina que as tornam avermelhadas.
Sua principal característica é uma endotoxina denominada LPS. 
	EX: pseudômonas, E coli.
As endotoxinas de bactérias GRAM negativas sao os pirogênios mais temidos nas preparações farmacêuticas.
Composição química da endotoxina na membrana da bactéria GRAM (–) a parte mais interna da molécula é o lipídeo A ligado a um núcleo polissacarídeo central mas externamente estão as cadeias O-especificas.
Atividade biológica da endotoxinas
Muitas atividades biológicas sao atribuídas a unidade lipídeo A da endotoxina como:
-Pirogenicidade
-Toxicidade letal
-Leucopenias seguida de leucocitose
-Alteracao da temperatura
-Queda de pressão
-Calafrios
-Gelificacao do amebócito de Limulus
O lipídeo A é considerado a porção ativa da endotoxina!!!
O mecanismo de indução de febre envolve a fagocitose do lipídeo A sendo produzido pirogenio endógeno que entao aravessa a barreira hematoencefalica e altera o ponto de equilíbrio dos neurónios reguladores de temperatura do hipotálamo anterior.
Processos de despirogenização
O ideal é evitar que nas etapas de processo de fabricação tenha a presença de contaminantes microbiológicos.
O processo de esterilização vao ser efetivos com cargas mais baixas entao é melhor evitar os contaminantes.
Os conceitos de BPF devem ser aplicados para evitar contaminantes.
Em caso de contaminação pirogênica a despirogenizacao pode ser obtida por inativação ou remoção de endotoxinas.
Deve sempre treinas os profissionais dando a eles a consciência. E sempre renovando o treinamento pois somos passivos a erros.
Por inativação
-Hidrolise ácido-base: utilizando uma solução acida e uma básica.
-Oxidação: predomina o peroxido de hidrogênio 
-Alquilação: inativação de microrganismo pelo óxido de etileno
-Calor seco: Com temperaturas elevadas.
-Radiação ionizante cobalto. Reduz s toxicidade de endotoxinas bacterianas sendo as alterações físicas e biológicas relatadas como dose dependentes mas pode ocorrer alterações desconhecidas nos fármacos por isso o uso da radiação nao tem sido muito considerada. Nao é muito utilizada pois a toxicidade supera os benefícios.
Por remoção – Consiste em apenas tirar e não inativar.
-Lavagem: com água estéril apirogênica. 
-Destilacao: água apirogenica
-Ultrafiltracao: com os filtros que eliminam por meio do PM.
-Osmose reversa
-Carvao ativado: ligacao a endotoxina com o carvão ativado.
-Atracao eletrostática: por meio de cargas
-Atracao por membrana hidrófoba
Essas ultimas nao são muito utilizadas pois em relação a medicamentos possuem mais desvantagens que vantagens.
Por inativação 
 Hidrolise acido base: elimina a atividade biológica do LPS desativando o Lipideo A (que é a parte ativa).
A hidrólise acida age sobre a ligacao cetosidica labil para separar o Lipideo A do restante da molécula do LPS. 
-Emprega-se HCL 0,05N por 30 min a 100°C nos materiais.
-Na hidrolise alcalina usa-se NaOH 0,25N por 1 hora a 50°C saponificação de ácidos graxos do lipídeo A.
 Oxidação: O H2O2 (Atividade despirogenizante e esterilizante) age oxidando os ácidos graxos presentes no lipídeo A do LPS.
Inativa pirogêno em: Água estéril para injetáveis USP, solução salina normal e salina dextrose.
Sua inativação depende do tempo de exposição, pH e concentração do H2O2.
Usado na lavagem de componentes plásticos empregados na fabricação de correlatos. 
Tudo vai depender de como você fez o processo de produção.
 Alquilacao: Ocorre por substituicao nucleofilica na ligacao glucosamina do Lipideo A e/ou etalonamina do núcleo central do LPS, reduzindo a atividade do lipídeo A.
Emprego de óxido de etileno em materiais temolábeis (produtos médico-hospitalares). Formaldeido não usa em medicamentos.
 Calor seco
Inativa as endotoxinas por oxidação e dessecação empregando temperaturas de 250°C por não menos de 30 min para frascos de vidros e instrumentos metálicos.
Por remoção 
Todo material que chega (não na forma estéril), faz-se os processos.
 Lavagem
Com água estéril para injeção, remove níveis baixos de endotoxina superficial da vidraria, tampa e dispositivos.
Mas nao é uma técnica segura entao muitas vezes faz-se mais de uma delas.
 Destilacao
A água submetida a duas alterações de fase, de liquida para vapor, e de vapor para liquida, consegue que na primeira fase as moléculas de LPS permaneçam na fase liquida, caindo por gravidade pelo seu elevado PM, logo a água recém destilada e mantida em frascos despirogenizados e estéreis, é apirogênica.
Deve-se ter uma periodicidade de lavagem do destilador.
 Ultrafiltracao
Ocorre por exclusão de PM. Como o LPS apresenta tamanho de 10000 a 20000 daltons, pode ser removido por ultrafiltro molecular de 10000.
 Osmose reversa
Remove endotoxina da água por exclusão de tamanho, porem seu uso é limitado. É reconhecido pela USP para produção de água Estéril para injeção, paralelamente a destilação. 
Existem farmacopeias que nao aceitam.
Ensaio de pirogenio in vivo – o primeiro a ser utilizado.
O coelho é um animal dócil mas que se estressa facilmente, entao tem que ter uma técnica para manuseamento do animal. Vem sendo substituído pelo teste in vitro mas de forma parcial pois a resposta animal é mais próxima da resposta do homem. Porém muitas vezes ele deve ser utilizado, dependendo do caso.
Nao utiliza o rato pois ele vai ter uma hipotermina e nao uma hipertermia.
O modelo animal empregado sao coelhos sadios do mesmo sexo, pesando 1,5 kg. Só fêmea ou só macho.
O teste in vivo é utilizado quando a metodologia in vitro nao é aplicável.
É empregado em produtos injetáveis, líquidos para infusão e perfusão, materiais cirúrgicos e correlatos em geral.
É considerado um ensaio limite cujo valor limite é ≥ 0,5 °C (USP e FB), ou a somatória de elevação térmica individual de todos os animais testados.
Voce trabalha com 3 animais entao analisa-se a temperatura inicial desses 3 animais e depois de administrar a droga deve-se ficar monitorando a temperatura do animal durante 3h e assim avaliando as variações térmicas. 
Todo material empregado no ensaio deve ser apirogênico.(agulha etc)
Injeta-se, 0,5 mL a 10ml/kg de peso corporal, do produto a ser testado pré-aquecido a 37 °C na veia marginal de orelha de 3 coelhos. (essa temperatura que é a temperatura corporal do animal)
Registrar a temperatura inicial antes de administração e a cada 30 min entre 1 a 3 horas após a injeção com par termoelétrico no reto do animal.
Tem que ter um prazo de descanso dos animais desses animais.
	O ensaio in vivo detecta níveis de contaminação da ordem de 50pg/mL, na dose de 10mL/kg. (nao é tao preciso quanto o in vitro).
Valores menores nao sao detectados
	Valores menores de pirogenios serão detectados pelo ensaio in vitro LAL. A dose de 10mL/ kg é empregada para injetáveis de grande volume e líquidos extratores de materiais plásticos descartáveis. O tempo de administração não deve ultrapassar 10 minutos. (para o coelho nao ficar estressado e não dar um resultado falso-positivo)
Interpretacao do ensaio de pirogenio in vivo (segundo FB)
	O aumento da temperatura é verificado pela diferença entre a maior temperatura apresentada pelo coelho durante o teste e sua temperatura controle (a cada meia-hora faz a verificação da temperatura). Se nenhum dos 3 coelhos apresentar aumento individual ≥ 0,5 °C em relação a temperatura controle, aprova-se o produto (considera apirogenico). 
	Havendo algum coelho com aumento da temperatura ≥ 0,5 °C, repetir o teste utilizando outros 5 animais. O produto cumpre os requisitos de ausencia de pirogenios se no máximo 3 dos 8 coelhos apresentarem aumentos individuais de temperatura ≥ 0,5 °C, e se a soma dos aumentos individuais de todos os coelhos não exceder a 3,3 °C. (pode-se trabalhar com mais 6 coelhos)
Ensaio in vitro
	Determinacao de endotoxinas bacterianas por ensaio in vitro - O sangue do Limulus polyphemus (caranguejo) ou do Tachypleus tridentatus, forma em coagulo em gel solido quando removido do animal. Bacterias marinhas, Gram (-), provocam extensiva coagulação intravascular e morte dos caranguejos. Mas não detecta os pirogenios de gram (+), por isso, precisa usar o coelho. 
	Preparo do LAL: os caranguejos sao submetidos a sangria introduzindo uma agulha estéril e apirogenica através do músculo entre as regiões cefalo-toracica e abdominal. A hemolinfa flui para recipiente contendo anticoagulante. Centrifuga. O sobrenadante é desprezado. Os amebocitos sao lavados em NaCl 3%. Submete as células a choque osmotico. O produto liquido é liofilizado (o que é comprado na empresa junto com a endotoxina para o controle positivo e a agua apirogenica para ressuspender). 
	A atividade de coagulacao da hemolinfa do Limulus reside no amebocito ( unica celula do sangue do caranguejo). A reacao é dependente da ativacao de enzima de alto peso molecular pela endotoxina, que gelifica proteinas coagulaveis de baixo PM (coagulogenio), esta reacao é critica na definicao de um ponto final no teste LAL.
	
	Metodo de ponto final de gelificacao - metodo semi-quantitativo: Deteccao de endotoxinas baseado na gelificacao. Volumes iguais de reagente LAL e da solucao teste (0,1mL de cada) sao transferidos para tubos apirogenicos. Homogeniza, suavemente, e incuba a 37 graus/1h. O ponto final é constatado pela inversao a 180 graus. Se formar gel solido é positivo. Desta forma o ensaio é caracterizado como teste limite, considerando a sensibilidade do LAL, que varia entre 0,25 e 0,015 UE/mL.
	Diversas diluicao 1:2, em duplicata, sao feitas e o ponto final é determinado. Calcula-se o nivel de endotoxina multiplicando a reciproca da mais alta diluição da solução teste que apresentou resultado positivo pela sensibilidade do LAL. (Exemplo: supondo que a ultima diluição que deu positiva foi de 1:16, entao multiplica o 16 pela sensibilidade do LAL - da o valor aproximado).
	
	
Quantitativos - Cromogenico e turbidimetrico, calorimetrico de proteina de Lowry
	Cromogenico (cor amarela) - baseia-se na acao da endotoxina bacteriana para ativacao da enzima de coagulacao que reage com um substrato cromogenico sintetico incolor. O substrato é composto por um peptideo ligado pela arginina C- terminal ao cromoforo p-nitroanilina (pNA), de cor amarela. Ativada a reacao é liberada (pNA) proporcionalmente a concentracao de endotoxina, medida por espectrofotometro com absorbancia a 405nm.
	Mistura-se 0,1 mL de LAL com 0,1 mL da amostra e pre-incuba por 8 min. Apos incubacao 0,5mL do substrato é adicionado incubando-se por 3 min. Adiciona 0,1 mL de acido acetico glacial em agua, a 25% v/v, e a densidade optica, e a densidade optica é lida em espectrofotometo a 405 nm. Uma curva padrao de 3 pontos deve ser aplicada. (é outro tipo de LAL)
	Metodo de preparo:
Mistura-se 0,1 ML do LAL com 0,1 mL da amostra e pre incuba por 8 min. Apos a incubação 0,5 mL do substrato é adicionado incubando por 3 min. Adiciona-se 0,1 mL de acido acético glacial em agua a 25 % v/v e a densidade optica é lida com espectro fotômetro a 405 nm. Uma curva padrão de 3 pontos ( 5,0 0,5 0,05 UE/mL) deve ser aplicada. Tem que fazer um controle positivo e um controle negativo, e o controle positivo é sempre a concentração do meio da curva.
	
	
Turbidimetricos quantitativos - qualquer aumento na concentração de endotoxina causa aumento na turbidez devido a precipitação do coagulogenio, que é sempre a proteina que quando ativa se converte em coagulina. A leitura é feita por densidade optica (leitor de ELISA) de varias diluições da amostra contra uma curva padrão com 3 concentrações. A endotoxina E. coli O55:B5. (5,0 0,5 0,05 UE/mL) Duplicata de amostras de 0,1 mL de: 
Cada concentração do padrão de endotoxina, 
amostra diluída para o (cN) do produto. 
Amostra contaminada com endotoxina na concentração 0,5 UE/mL do produto. 
Agua para o CN da agua. (para ve se ta apirogenica)
	Sao transferidos para a placa ELISA 0,1 ml de LAL reconstituído é distribuído sobre as amostras. É feita a leitura a 37 graus/1h. O metodo emite sensibilidade de 0,005 UE/mL.
	
	
Calorimetrico de proteina de Lowry
	Baseia-se em concentrações crescentes de endotoxinas que irão precipitar proporcionalmente a proteina do reagente LAL. Quantidades iguais da amostra e do lisado (0,1 mL) sao misturados em tubos apirogenicos, incubando-se a 37 graus/1h, centrifugando-se por 10 min. O sobrenadaste é removido. Usa-se o espectometro com leitura de 660nm. Relaciona-se os resultados com a curva padrão. 
	O controle positivo e negativo asseguram a não interferencia de amostras e ausencia de contaminantes. Tres concentrações de endotoxinas são usadas para obter a curva de densidade optica, as concentrações são diferentes das demais ( 200 50 12pg/mL). Esse metodo é empregado para testar matérias-primas, aguas, soluções parenterais. (os outros também) 
	RESUMO DO QUE FOI FALADO
	O Ensaio LAL é considerado um ensaio mais sensível que o ensaio em coelhos. Na industria o ensaio LAL é reconhecido no controle em processo. A simplicidade e rapidez do ensaio de LAL permitiu testes mais frequentes em mais amostras, prevendo a segurança com os testes pirogenicos. Detecta e quantifica níveis subpirogenicos. Tem sido empregado em agua, matéria-prima, dispositivos e outros materiais. E a FB admite os testes de gelificacao, fotometrico e turbidimetrico, cromogenico.
Hence an effort was made to detect the pyrogenicity of five medical grade polymer (gelatin) materials, intended for the manufacturing of capsule for pharmaceutical applications, using an indigenously developed ELISA method, LAL and rabbit pyrogen assay.
Assim, um esforço foi feito para detectar a pirogenicidade de cinco materiais políméricos de grau médico (gelatina), destinado a fabricação de cápsulas para aplicações farmacêuticas, utilizando um método de ELISA desenvolvido nativamente, ensaio de LAL e pirogenios coelho.