Coloração de gram

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Engenharia de Alimentos – 2018.1
Microbiologia Geral
28
 de junho de 201
8
Profa Esp. Ellen Karoline Mota da Silva Soares
Cristian da Silva Neres
AULA PRÁTICA: COLORAÇÃO DE GRAM
IMPERATRIZ – MA
JUNHO DE 2018
CRISTIAN DA SILVA NERES
AULA PRÁTICA: COLORAÇÃO DE GRAM
Relatório da disciplina de Microbiologia Geral do curso Engenharia de Alimentos sobre a coloração de gram para obtenção de nota parcial na disciplina.
 
IMPERATRIZ – MA
JUNHO DE 2018
INTRODUÇÃO
	O método tintorial predominante utilizado em bacteriologia é o método de Gram. A bacterioscopia, após coloração pelo método de Gram com diagnóstico presuntivo, de triagem, ou até mesmo confirmatório em alguns casos, constitui peça importante e fundamental na erradicação e no controle das Doenças Sexualmente Transmissíveis (DST). Essa técnica é simples, rápida e tem capacidade de resolução, permitindo o correto diagnóstico em cerca de 80% dos pacientes em caráter de pronto atendimento em nível local. Os custos com investimento e manutenção são consideravelmente baixos diante da eficácia alcançada com os resultados imediatos dos testes. Essa técnica requer instalação simples, necessitando apenas de uma sala pequena com disponibilidade de água e gás, onde deverá ser instalado um balcão com pia e um bico de Bunsen, eventualmente substituído por uma lamparina ou espiriteira. São ainda necessários: microscópio com objetiva de imersão e bateria para a coloração de Gram. Os corantes devem ser preparados pelo próprio laboratório ou por um laboratório habitado que assegure a qualidade do produto. Finalmente, e mais importante, são necessários técnicos de laboratório treinados, responsáveis e conscientes do valor do seu trabalho. A coloração de Gram recebeu este nome em homenagem a seu descobridor, o médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que as bactérias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classificá-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Gram-positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas. Após descrição do método, inúmeras propostas de modificação foram feitas [1].
	A parede celular é uma estrutura rígida que está presente em quase todas as bactérias e localiza-se acima da membrana citoplasmática. Ela contém polímeros complexos conhecidos como peptidioglicanos, que são responsáveis pela sua rigidez. A parede celular impede que a célula estoure em decorrência do grande turgor, atua como uma barreira de proteção contra determinados agentes químicos e físicos externos e funciona como suporte de antígenos somáticos bacterianos. As bactérias podem ser divididas em dois grandes grupos, com base na capacidade de suas paredes celulares fixarem o corante violeta cristal: as Gram-positivas (que coram em roxo) e as Gram-negativas (que coram em vermelho). A parede celular de bactérias Gram-positivas é composta basicamente por peptidioglicano, que constitui uma espessa camada ao redor da célula. Outros polímeros, tais como ácidos lipoteicóicos e polissacarídeos, também podem estar presentes nessa camada (VIEIRA, D. A. P; QUEIROZ, N. C. A, 2012).	
	Nas bactérias Gram-negativas o peptidioglicano constitui uma camada basal delgada, sobre a qual se encontra outra camada, denominada membrana externa que é composta por lipoproteínas, fosfolipídios, proteínas e lipopolissacarídeo. O processo de coloração de Gram consiste basicamente em tratar bactérias sucessivamente com cristal violeta, lugol, álcool e fucsina. O cristal violeta e o lugol penetram tanto nas bactérias Gram-positivas quanto nas Gram-negativas, formando um complexo de cor roxa. O tratamento com álcool é a etapa diferencial; nas Gram-positivas, o álcool não retira o complexo cristal violeta+lugol, pois a sua ação desidratante faz com que a espessa camada de peptidioglicano torne-se menos permeável, retendo o corante. Nas Gram-negativas, devido à pequena espessura da camada de peptidioglicano, o complexo corado é extraído pelo álcool, deixando as células descoradas. O tratamento com fucsina não altera a cor roxa das Gram-positivas, ao passo que as Gram-negativas descoradas pelo álcool se tornam avermelhadas (VIEIRA, D. A. P; QUEIROZ, N. C. A, 2012).	
Figura 1: Parede celular de bactéria Gram-positiva
Figura 2: Parede celular de bactéria Gram-negativa
Importância das bactérias gram positivas
	Para aumentar a vida útil e garantir segurança dos alimentos por meio da técnica de biopreservação, há muitos anos vem sendo empregado o uso de microbiota protetora e/ou seus peptídeos antimicrobianos, as chamadas bacteriocinas. Várias espécies de bactérias do gênero Bacillus produzem substâncias com atividade antimicrobiana. As bactérias lácticas utilizadas na fermentação de alimentos são capazes de inibir ou reduzir a contaminação por microrganismos deteriorantes e/ou patogênicos, por meio da produção de vários agentes antimicrobianos. A acidificação é o fator primário na preservação de produtos de fermentação láctica. Entretanto, outros compostos como diacetil, dióxido de carbono, peróxido, etanol e bacteriocinas podem exercer ação inibitória sobre diferentes grupos de microrganismos (HELANDER et al., 1997). Muitas pesquisas vêm sendo realizadas sobre a produção de bacteriocinas das bactérias gram-positivas, em particular das bactérias ácido-láticas. Muitos destes são organismos de grau alimentício, já amplamente utilizados na indústria de alimentos, porém vem se buscando aperfeiçoamento no processo de conservação dos mesmos.  Um outro ponto interessante estudado sobre essa substância, é a possível aplicação sobre a prevenção de doenças infecciosas nos animais (JACK et al., 1995).
 	Na indústria de carne suína, de modo geral, as de maior importância são a nisina e a enterocina. A nisina, produzida pela cultura de Lactobacillus lactis é de grande importância na bioconservação da carne.  Da mesma forma, a enterocina, produzida pela cultura de Enterococcus faecalis é de extrema importância para a bioconservação da salsicha tendo como microrganismo algo o Staphylococcus aureus (NATTRESS et al., 2001; ANANOU et al.,2005). 
 	Uma outra bactéria estudada para o uso na indústria em 1996 por LEISNER et al. é a Leuconostoc gelidum, isolada a partir de carne embalada a vácuo. Ela produz a bacteriocina leucocin A que é bacteriostática e ativa contra um amplo espectro de cepas de Listeria monocytogenes e Enterococcus spp., mas não é ativa contra Brochothrix spp., Staphylococcus spp. ou bactérias gram-negativas.
	Atualmente, muitas pesquisas sobre bacteriocinas tem se estendido além do campo da indústria. Sabe-se que genes que codificam peptídeos antimicrobianos de defesa como as bacteriocinas diferem de várias formas dos antibióticos clássicos e podem proporcionar uma abordagem totalmente nova para o combate a doenças infecciosas e infecções nocosomiais no campo.
 	Alguns autores citam que a grande diferença estaria na forma de atuação. Enquanto os antibióticos inibiriam as enzimas essenciais no processo de combate a bactéria durante dias, estes peptídeos agiriam rapidamente destruindo ou permeando a membrana microbiana e prejudicando a capacidade de realizar processos anabólicos (BOMAN, 1995; NICOLAS e MOR, 1995).
 	Em um estudo conduzido por Yeon-ok e Ahn, 1997, que trabalhavam com bactérias ácido-láticas fermentadoras de um alimento muito tradicional da Coréia, originou-se a bacteriocina produzida por Leuconostoc sp. Os pesquisadores descobriram que esta bacteriocina tinha uma ampla atividade antimicrobiana contra patógenos gram-positivos. 
2. MATERIAIS, VIDRARIAS, EQUIPAMENTOS E REAGENTES:
Água destilada;
Balança analítica;
Algodão;
Álcool 90;Solução de Lugol 1% (m/v);
Solução estéril de Cloreto de Sódio 9% (m/v);
Solução de Fucsina 5% (m/v);
Microscópio;
Erlenmeyeres de 200 mL
Caldo Lactose Bronth;
Autoclave;
Bico de Bunsen;
Alça metálica; 
Papel toalha;
Solução de Azul de Metileno 10% (m/v).
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Procedimentos prévios
- Foi realizado um teste semelhante ao de swab no trinco da porta de uma das salas do laboratório de microbiologia da Universidade Federal do Maranhão, no Centro de Ciências Sociais, Saúde e Tecnologia – Campus Avançado, sendo coletado duas amostras e posteriormente submersas no meio Caldo Lactose Bronth, as amostras foram identificadas como CL1 e CL2;
- Formulou-se três amostras spread plate em placas de Petri também do trinco da mesma porta;
Obs: As duas análises feitas posteriores foram realizadas 24 horas antes à realização do teste de coloração de gram.
- A solução de Cloreto de Sódio foi esterilizada por meio de autoclave em uma temperatura de 121°C a 1 atm por 15 minutos.
- Foram realizados 3 testes de coloração de gram em virtude de se ter mais confiabilidade nos resultados e também pela adaptação da metodologia por causa da substituição do Cristal Violeta pelo Azul de Metileno;
3.1. Primeiro teste – Coloração de Gram
3.1.1. Flambou-se a alça metálica no bico de Bunsen e tendo passado o tempo necessário do resfriamento da mesma, retirou-se uma alçada do tudo CL1 e passou ao longo da lamina;
3.1.2. Adicionou 3 gotas da Solução estéril de Cloreto de Sódio 9% (m/v) sobre a lamina e logo em seguida a sobrepôs na chama do bico de Bunsen com intensão da fixação dos microrganismos na placa;
3.1.3. Tendo flambado e esperado um certo tempo, com a alça metálica, retirou uma alçada sobre uma placa de Petri e passou-se ao longo da lamina;
3.1.4. Adicionou 10 gotas da Solução de Azul de Metileno 10% (m/v) sobre a lamina e a deixou por 1 minuto e logo em seguida foi retirado com água destilada;
3.1.5. Adicionou 10 gotas da Solução de Lugol 1% (m/v) sobre a lamina e a deixou por 1 minuto e logo em seguida foi retirado com água destilada;
3.1.6. Adicionou 5 gotas do Álcool 90 sobre a lamina e a deixou por 15 segundos e logo em seguida foi retirado com água destilada;
3.1.7. Adicionou 10 gotas da Solução de Fucsina 5% (m/v) sobre a lamina e a deixou por 30 segundos e logo em seguida foi retirado com água destilada e enxugado levemente com papel toalha;
3.1.8. Foi realizada a leitura da lamina no microscópio para a determinação de quais foram as cores obtidas no teste; 
3.2. Segundo teste – Coloração de Gram
3.2.1. Flambou-se a alça metálica no bico de Bunsen e tendo passado o tempo necessário do resfriamento da mesma, retirou-se uma alçada do tudo CL1 e passou ao longo da lamina;
3.2.2. Adicionou a Solução estéril de Cloreto de Sódio 9% (m/v) sobre toda a superfície da lamina e logo em seguida a sobrepôs na chama do bico de Bunsen com intensão da fixação dos microrganismos na placa;
3.2.3. Tendo flambado e esperado um certo tempo, com a alça metálica, retirou uma alçada sobre uma placa de Petri e passou-se ao longo da lamina;
3.2.4. Adicionou 30 gotas da Solução de Azul de Metileno 10% (m/v) sobre a lamina e a deixou por 1 minuto e logo em seguida foi retirado com água destilada;
3.2.5. Adicionou 30 gotas da Solução de Lugol 1% (m/v) sobre a lamina e a deixou por 1 minuto e logo em seguida foi retirado com água destilada;
3.2.6. Adicionou 10 gotas do Álcool 90 sobre a lamina e a deixou por 15 segundos e logo em seguida foi retirado com água destilada;
3.2.7. Adicionou 30 gotas da Solução de Fucsina 5% (m/v) sobre a lamina e a deixou por 30 segundos e logo em seguida foi retirado com água destilada e enxugado levemente com papel toalha;
3.2.8. Foi realizada a leitura da lamina no microscópio para a determinação de quais foram as cores obtidas no teste; 
3.3. Terceiro teste – Coloração de Gram
3.3.1. Flambou-se a alça metálica no bico de Bussen e tendo passado o tempo necessário do resfriamento da mesma, retirou-se uma alçada do tudo CL1 e passou ao longo da lamina;
3.3.2. Adicionou 3 gotas da Solução estéril de Cloreto de Sódio 9% (m/v) sobre a lamina e logo em seguida a sobrepôs na chama do bico de Bussen com intensão da fixação dos microrganismos na placa;
3.3.3. Tendo flambado e esperado um certo tempo, com a alça metálica, retirou uma alçada sobre uma placa de Petri e passou-se ao longo da lamina;
3.3.4. Adicionou 30 gotas da Solução de Azul de Metileno 10% (m/v) sobre a lamina e a deixou por 1 minuto e logo em seguida foi retirado com água destilada;
3.3.5. Adicionou 30 gotas da Solução de Lugol 1% (m/v) sobre a lamina e a deixou por 1 minuto e logo em seguida foi retirado com água destilada;
3.3.6. Adicionou 30 gotas do Álcool 90 sobre a lamina e a deixou por 15 segundos e logo em seguida foi retirado com água destilada;
3.3.7. Adicionou 30 gotas da Solução de Fucsina 5% (m/v) sobre a lamina e a deixou por 30 segundos e logo em seguida foi retirado com água destilada e enxugado levemente com papel toalha;
3.3.8. Foi realizada a leitura da lamina no microscópio para a determinação de quais foram as cores obtidas no teste; 
RESULTADOS E DISCUSSÃO
	
Primeiro teste – Coloração de Gram
	Os resultados obtidos nesse teste foi somente a melhor visualização das células microbianas em relação à coloração gram não pôde-se ver com clareza e consequentemente afirmar a coloração das células bacterianas, isso ocorreu em virtude da pouca quantidade dos reagentes utilizados. 
Segundo e terceiro teste – Coloração de Gram
	
	Nestas avaliações foi possível determinar a presença de bactérias gram-positivas. Contudo, a diminuição da quantidade de volume de Álcool 90 mostrou ser determinante nessa avaliação sendo que as Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicano e ácido teicóico, a parede celular das bactérias gram-positivas, em virtude de sua composição diferente, torna-se desidratada durante o tratamento com álcool-acetona, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e Azul de Metileno não pôde ser extraído.
CONCLUSÃO
	Em virtude dos objetivos propostos e os resultados obtido concluiu-se que no trinco da porta de uma das salas do laboratório de Microbiologia da Universidade Federal do Maranhão, no Centro de Ciências Sociais, Saúde e Tecnologia – Campus Avançado há presença predominante das bactérias gram positiva o que de certa forma apresenta o perigo de saúde pública aos que utilizam o laboratório para a realização de suas pesquisas, limpeza e higienização adequadas são importante na higienização do laboratório erradicando a níveis aceitáveis a presença destes microrganismos.
REFERÊNCIAS
Técnica de Coloração de Gram. Brasília: Ministério da Saúde, Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS, 1997. 63 p.: iI. (Série TELELAB) 1. Gram I. Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS, (Brasil). II. Série TELELAB 
VIEIRA, D. A. P; QUEIROZ, N. C. A. – Microbiologia Geral – Inhumas: IFG; Santa Maria: Universidade Federal de Santa Maria, 2012.
HELANDER, I. et al. Potential of lactic acid bacteria and novel antimicrobials against gram-negative. Trends in Food Science and Technology, Oxford, v. 8, n. 5, p. 146-150, 1997.
JACK, R. et al. Bacteriocins of Gram-Positive Bacteria. Microbiological Reviews. v. 59, n. 2, p. 171–200, 1995.
NATTRESS, F. et al. Evaluation of ability of lysozyme and nisin to control meat spolage bacteria. International. 
BOMAN, H. Peptide antibiotics and their role in innate immunity. Annu. Rev. Immunol. v.13, p. 61–92, 1995.
ANANOUS, S. et al. Control of Staphylococcus aureus in sausage by enterocin AS-48. Meat Science. v. 71, n. 3, p. 549-556, 2005.
LEISNER, J. et al. Control of Beef Spoilage by a Sulfide-Producing Lactobacillus sake train with Bacteriocinogenic Leuconostoc gelidum UAL187 during Anaerobic Storage at 28C. Applied and Environmental Microbiology. vol. 62, n. 7, p. 2610–2614, 1996NICOLAS, P., E MOR, A. ANNU. Rev. Microbiol. v.49, p. 277–304, 1995.