Cromatografia Quimica Analítica Instrumental

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Análise Instrumental – Prof. Cezar ManziniAnálise Instrumental – Prof. Cezar Manzini
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CROMATOGRAFIA
Histórico
M. TSWEET (1903): Separação de misturas de
pigmentos vegetais em colunas recheadas com
adsorventes sólidos e solventes variados.éter de
petróleo
CaCO3
mistura de
pigmentos
pigmentos
separados
Cromatografia =
kroma [cor] + graph [escrever]
(grego)
Figura 1 – Esquema de cromatografia em coluna
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INTRODUÇÃO:
A cromatografia envolve uma série de
processos de separação de misturas,
acontece pela passagem de uma mistura
através de duas fases: uma estacionária
(fixa) e outra móvel. A interação dos
componentes da mistura com estas duas
fases é influenciado por diferentes forças
intermoleculares, incluindo iônica, bipolar,
apolar, e específicos efeitos de afinidade e
solubilidade.
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CROMATOGRAFIA Princípio Básico
Separação de misturas por interação diferencial dos seus
componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou
sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
Figura 2 – Esquema de eluição na cromatografia planar
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2. Classificação pela fase móvel empregada
São de 3 tipos:
�a cromatografia gasosa
�a cromatografia líquida e a cromatografia supercrítica
(CSC). A cromatografia líquida apresenta uma
importante subdivisão:
� cromatografia líquida clássica (CLC)
� cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
No caso de fases móveis gasosas, separações podem ser
obtidas por cromatografia gasosa (CG) e por
cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR).
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3. Classificação pela fase estacionária utilizada
Quanto à fase estacionária, distingue- se entre
fases estacionárias sólidas, líquidas e quimicamente
ligadas. No caso da fase estacionária ser constituída por
um líquido, este pode estar simplesmente adsorvido sobre
um suporte sólido ou imobilizado sobre ele. Suportes
modificados são considerados separadamente, como fases
quimicamente ligadas, por normalmente diferirem dos
outros dois em seus mecanismos de separação.
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4. Classificação pelo modo de separação
Separações cromatográficas se devem à adsorção,
partição, troca iônica, exclusão ou misturas desses
mecanismos.
• CCD - Cromatografia de Camada Delgada, também 
conhecida por Cromatografia de Capa Fina 
• PLC –Planar Chromatography (Cromatografia Planar)
• TLC - Thin Layer Chromatography: Usada para 
descrever uma técnica “clássica”, não sofisticada que 
era/é feita manualmente e avaliada por meio visual. 
• HPTLC – High Performance Thin Layer Chromatography
4. Conceitos
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CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIA
PLANAR COLUNA
CENTRÍFUGA CCD
CP
CSC GASOSA
LÍQUIDA
CLÁSSICA CLAE
CG CGAR
Figura 3 – Organograma com os 
métodos cromatográficos
6. Esquema Geral das Técnicas Cromatográficas
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http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm
Mecanismos de separação
Soluto é
adsorvido na
superfície da fase
estacionaria
Soluto é
dissolvido na
fase líquida,
revestindo a
superfície do
suporte sólido
Ânions movem-
se ao redor dos
cátions, estando
covalentemente
ligados a fase
estacionária
Resinas de extração 
aniônica; somente 
ânions são atraídos.
Macromoléculas são 
excluídas
Pequenas
moléculas
penetram
nos poros.
Um tipo de molécula da
complexa mistura será
atraída pelas moléculas
que estão
covalentemente ligadas
a fase estacionária.
As outras moléculas 
são carreadas pelo 
solvente.
Cromatografia de Adsorção
Cromatografia de Partição
Cromatografia de Exclusão iônica
Cromatografia de Exclusão molecular
Cromatografia de Afinidade
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Exercícios de Fixação
Qual o tipo de mecanismo de separação envolvido na
cromatografia em camada delgada e em coluna de sílica?
Explique o mecanismo de separação da cromatografia em
papel, por exclusão e de troca iônica.
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Cromatografia planar
A cromatografia em papel
(CP) é uma técnica de
partição líquido–líquido.
Baseia-se na diferença de
solubilidade das substâncias
em questão entre duas fases
imiscíveis, sendo geralmente a
água um dos líquidos. Este
método é muito útil para a
separação de compostos
polares, sendo largamente
usado em bioquímica.
Figura 4 – a) esquema cromatografia em papel b) 
Foto de cromatografia em papel de alguns corantes
A cromatografia em papel
(CP) é uma técnica de
partição líquido–líquido.
Baseia-se na diferença de
solubilidade das substâncias
em questão entre duas fases
imiscíveis, sendo geralmente a
água um dos líquidos. Este
método é muito útil para a
separação de compostos
polares, sendo largamente
usado em bioquímica.
Figura 4 – a) esquema cromatografia em papel b) 
Foto de cromatografia em papel de alguns corantes
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Cromatografia em papelCromatografia em papel
• Compostos hidrossolúveis, ácidos orgânicos e íons metálicos
• Princípio: partição (solubilidade)
• Quantidade de amostra necessária 10-3 a 10-6 g
• Tipos: ascendente, descendente, bidimensional, circular
• F.M. - Sistema de solventes
• F.E. - Água retida na celulose (papel Whatman)
• Métodos de detecção: físico-químicos
• Análise qualitativa: Rf (fator de retenção) - problema :
reprodutibilidade
• Análise quantitativa: densitômetro, extração dos solutos
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A cromatografia em camada
delgada ou fina (CCD) é uma
técnica de adsorção líquido–sólido.
Nesse caso, a separação se dá pela
diferença de afinidade dos
componentes de uma mistura pela
fase estacionária.
Cromatografia em Camada Delgada
Figura 5 – Placa cromatográfica CCD
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� Separação de misturas de compostos moleculares através da
migração diferencial dos mesmos entre duas fases: uma fixa e outra
móvel.
� Pode ser expresso como um procedimento de separação
microanalítico no qual os componentes de uma mistura são
transportados para diferentes distâncias em uma placa recoberta
com uma fina camada de material poroso. A espessura da camada
pode variar de 100mm a 250mm.
Cromatografia de Camada DelgadaCromatografia de Camada Delgada
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�A placa que serve de suporte em geral é de vidro, mas pode ser de
plástico ou de alumínio. A camada que recobre a placa recebe o nome
de fase estacionária e em geral é constituída de sílica gel.
�O mecanismo de transporte é um solvente e é conhecido como fase
móvel. Primeiro a amostra é dissolvida em umsolvente adequado,
então, uma certa alíquota desta solução é aplicada na região de
partida e o conjunto é seco.
�A placa de TLC/HLTPC é então colocada em uma câmara de
desenvolvimento ou cuba, o qual contém o solvente.
Cromatografia de Camada Delgada Cromatografia de Camada Delgada -- Materiais da placaMateriais da placa
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Cromatografia de Camada Delgada Cromatografia de Camada Delgada –– desenvolvimento da placadesenvolvimento da placa
� Inicia-se o que chamamos de desenvolvimento cromatográfico
onde os componentes da amostra são influenciados pela ação de
duas forças, opostas entre si:
� Capilaridade: é a responsável pelo avanço do solvente ou fase
móvel sobre a fase estacionária que contém a amostra.
� Interação: tão logo se inicia a migração da fase móvel, a
amostra é dissolvida e começa a ser arrastada pela fase móvel.
� Neste momento aparecem forças de interação entre os
componentes da amostra e a fase estacionária.
�Estas forças de interação se opõem à força de arraste da fase
móvel (capilaridade) retardando o avanço dos componentes da
amostra.
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Tipos de adsorventes:
G- aglutinantes (gesso, amido ou 
talco)
H- sem aglutinante (p/ CL)
P- camada preparativa
F- contém fluorescência
R- adsorvente sem aditivo
Critérios para escolha da fase móvel:
analitos devem ser solúveis diferentemente
não deve haver reação entre analitos/FM e FM/FE
Adsorção depende:
natureza química do 
adsorvente
área de superfície/ 
tamanho da partícula
porosidade da partícula
-atividade --> sítios ativos
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Em função de todas estas interações entre amostra/fase Em função de todas estas interações entre amostra/fase 
móvel/fase estacionária, o sistema TLC/HPTLC deve ser móvel/fase estacionária, o sistema TLC/HPTLC deve ser 
otimizado para cada amostraotimizado para cada amostra
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Medida e Identificação de Solutos
Fator de relação (Rf)
• Isto é calculado através do Rf (fator de relação)
• Rf é a relação entre as distâncias percorridas pelo 
composto e pela frente do solvente.
• Rf =distância do centro da mancha à linha de partida
distância da frente do eluente à linha de partida
Ou Rf = a/b
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Fator de relação (Rf)
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Determine os Rf de uma amostra de
aminonoácidos, formada de cadeias
carbônicas lineares ou ramificada,
apresentando de 3 a 15 átomos de
carbono por cadeia foi levada para
separação por CCD com fase
estacionária normal. Sendo utilizando
uma mistura de éter/diclorometano 1:1
como eluente para a separação, (utilize
os dados da placa de CCD ao lado)?
Exercício de Fixação
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Aplicação da amostraAplicação da amostra
Forma incorreta de aplicação Forma correta de aplicação
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Aplicação em spots, bandas ou Aplicação em spots, bandas ou 
retângulos ?retângulos ?
Vídeo da Merck
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Para este caso, o solvente Hexano mostrou-se como o melhor,
pois o ponto de aplicação ficou o menor possível. O ideal é
evitar o efeito de anel, como ocorreu com a água.
Influência do SolventeInfluência do Solvente
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CCD CCD -- exemplosexemplos
Requerimento da amostra::
detectável no cromatograma
solúvel na FM
estável à luz, oxigênio, solvente, não ser volátil
Figura 3 – Fotos de placas cromatográficas de CCD utilizadas para separação de espécies químicas
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Parâmetros para a placaParâmetros para a placa
Temperatura:
O desenvolvimento do cromatograma deve ocorrer em
temperatura ambiente. Temperaturas entre 20°C e 25°C
não são críticas para este procedimento. Ë importante
evitar flutuações de temperatura durante o processo.
Umidade:
Durante a fabricação e logo após, as placas são secas à
temperatura de 120°C, de modo a ativar a sílica gel. Ao
ser retirada da embalagem a placa adsorve rapidamente
umidade, se equilibrando em alguns minutos. Entre HR
de 50 a 60% este equilíbrio ocorrerá na placa com cerca
de 13% de conteúdo de água.
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Posição da cubaPosição da cuba
• A cuba deve ser colocada de modo a não
receber luz solar direta, em local com
temperatura estável e bancada a mais nivelada
possível.
• Quando o trabalho estiver sendo feito com
substâncias fotossensíveis, o cromatograma
deve ser corrido no escuro.
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Princípios Básicos do detector
Figura 5 - Representação esquemática
mostrando a separação de uma mistura de
componentes A e B através de uma coluna
cromatográfica, por eluição. (b) Curva do sinal
de saída do detetor (cromatograma).
Fatores Interferentes:
- Diluição dos analitos
- Velocidade de 
Migração
- Alargamento de Zonas
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Uma amostra monoácidos, formada de cadeias
carbônicas lineares ou ramificada, apresentando
de 3 a 15 átomos de carbono por cadeia foi
levada para separação por CCD com fase
estacionária reversa. Sendo utilizando uma
mistura de etanol/metanol 1:1 como eluente para
a separação, responda:
a) Qual a quantidade de componentes separados
e seu Rf (utilize os dados da placa de CCD ao
lado)?
b) Quais as espécies mais polares e apolares?
c) Como você esboçaria um cromatograma a
partir da placa ao lado?
d) O que você faria para melhorar a resolução das
separações de alguns componentes da amostra?
Exercício de Fixação