histoquimica fundamentos simposio pat 1

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Tuim 20 : utilizados como detergentes para proteína ... esse tem alguns sais que o tormam melhor que o triptom x100. Pode-se começar usando de 0,1% ate 1%, que depende de quanto o anticorpo precisa infiltrar... fígado é um tecido muito permeável já musculo é pouco permeável, tecidos fibrosos são menos permeáveis e depende disso para se escolher o valor de concentração. Nos livros diz que pode-se usar a 0,1 0,5 sem danificar o tecido com uma margem de segurança, pra ver se funciona e melhora a marcação do anticorpo isso é necessário quando o que se quer encontrar esta dentro da célula, pq a célula não é permeável ao anticorpo.
Fixação de tecido para manter (estabilizar molécula e manter o tecido, Conserva a antigenicidade do tecido) o tecido: e para o tecido não é interessante usar formol pq ele altera o epitopo e utiliza-se paraformaldeido mas existe um limite de tempo no fixador pq os epitopos vão se modificando e pode-se perder a marcação.
4hrs – 5% de paraformoldeido: é bem utilizado, mas pode-se deixar ate 24 hrs e isso varia de um tecido para o outro.
A primeira coisa é estabilizar o tecido .... fixando .... ai pode-se pensar o que fazer com esse tecido.
existe a marcação incorreta inespecífica (bach round) porém ele é mais claro do que a marcação especifica. Ele não pode ser forte pra não confundir ele é importante pra ver o que é positivo e o que não é e para ver a arquitetura do tecido.
imunofluorecencia
O resultado lhe da uma localização bem especifica, podendo localizar proteínas dentro da célula ou algum tecido heterogenio.
Imunohistoquimica direta: um anticorpo que liga direto na minha proteína de interesse, neste caso ele tem uma fluorecencia algo que gere cor
Imunohistoquimica indireta: Anticorpo se liga no antígeno não tendo nada ligado dele que gera cor, ai depois usa um segundo anticorpo que é especifico para esse anticorpo e esse sim gera cor.
Como escolher um antic primário: tenho que detectar uma proteína que so tenha naquela célula e uso um anticorpo pra essa proteína especifica, cada célula tem proteínas especificas. Tem que procurar na literatura.
Anticorpo monoclonal ou policlonal
Monoclonal: são tds específicos para aquele epitopo, anticorpos iguais
Policlonal: são vários epitopos e anticorpos diferentes, ele é um pool de anticorpos que foi produzidos para a mesma proteína, ele é menos especifico, porem nem sempre encontra comercialmente um monoclonal para a proteína de interesse pois exige um grau de pureza muito maior. Esse é feito de um animal pra outro. Já o monoclonal é purificada a proteína e é feito em meio de cultura. Para ser mto especifico e replicar iguais.
Tem que ler o data sheet do anticorpo para ter certeza que ele vai funcionar, se não pode estar jogando seu dinheiro no lixo.
Reat too: qual tipo de espcie ele conhece
Reat too: human, rat, mouse p.e.
Outra coisa mto importante é verificar application, pq anticorpos não são usados apenas para uma coisa, HC:himunohistoquimica IF: imunofluorecencia WE: não compre pq não funciona para himunohistoquimica, as vezes o HC tbm serve para a IF.
Qual fixador utilizar¿ depende se esta dentro ou fora da célula se precisa ou não aglutinar, paraformoldeino com buan (amarelinho) é bem comum ou formanina tamponada ...
Deixar o fixador agindo na geladeira!! Ajuda muito... a qtdd de fixador é de 20 a 30 vezes o volume do tamanho da peça por isso deve-se fragmentar a peça para facilitar.
Pode-se deixar ate 15 dias no álcool 70 mas a antigenicidade pode ser alterada então deve-se fazer a estabilização o quanto antes. 
Se for um tecido mais denso pode usar 6%
Se for sensível pode usar de 2 a 4% se for 4 deve ser em um tempo mais curto.
Após deve-se fazer os cortes
Recuperação antigênica: quando os epitopos ficam escondidos e vc precisa deixa-los novamente exposto
Usar direta ou indireta¿
Indireta vc economiza o anticorpo primário e com isso gasta menos dinheiro pq ai vc usa o ac secundário em maior quantidade que é bem mais barato.
Os 2 tem a mesma especificidade tanto a direta como indireta.
Para conservar:
Inclusão de parafina
Primeiro desidrata faz a diafanização e depois usa a parafina pq agua e parafina não da certo depois faz a microtomia
Ou 
Congelamento
24 hrs 30% sacarose (a sacarose entra deixa o tecido pesado e o tecido desce ai já sabe que ela entrou)
Add OCT deixa 24 hrs
Ai coloco td isso no congelamento
E depois corta no criostato
Imunohistoquimica não tem fluorecencia então tem uma enzima que é peroxidase que gera o DAB, fígado e rim tem mta peroxidase. A peroxidase do tecido é endógena então ela tem que sei inativada para não interferir no final somente na imunohistoquimica e pra isso é uma das primeiras etapas que é colocar agua oxigenada que satura a peroxidase endógena, já na fluorecencia não é necessário.
Se o primeiro foi produzido em um animal x o secundário tem que ser anti o animal x, não é de acordo com o animal que vc esta trabalhando que sempre é diferente do anticorpo e sim do animal do anticorpo primário.
Dupla marcação 
É quando vai utilizar 2 antigenos, tbm pode ser 3 mas ai chama tripla marcação, para saber se o antígeno A e B estão na mesma célula ou célula separada. Neste caso o anticorpo primário é especifico então vão ter 2 anticorpos primários e não podem ter sido produzidos no mesmo animal para que o segundo anticorpo seja anti animal A e anti animal B e ai tbm será utilizado 2 anticorpos secundários anti animais diferentes para que gere cor diferentes.
Recuperação antigênica (aumenta as especificas so faz em casos específicos)
Pode-se usar calor 
Ou tratamento enzimático pq as vezes o epitopo não esta exposto pq tem outra proteína em cima
So faz quando esta fazendo a marcação e não esta conseguindo ou esta mto fraco.
Bloqueio antigênico (esse tem que fazer sempre)
Pra diminuir as inespecífica
Utiliza-se normalmente com o BSA 2% se o back round tiver mto alta ai pode aumentar a % e tem que ser feito antes de add o anticorpo.
Inativa peroxidase depois bloqueio antigênico (se for imunohistoquimica)